專(zhuān)利名稱(chēng)：一種克隆草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域，具體涉及一種克隆草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因的方法。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)的飛速發(fā)展，草坪對(duì)人們賴(lài)以生存的環(huán)境起著越來(lái)越多的改善、美化與保護(hù)作用，成為生存環(huán)境的重要組成部分。在我國(guó)人口較密集的城市，一個(gè)綠草茵茵、花香四溢的生活和工作環(huán)境，將會(huì)帶來(lái)不可估量的生態(tài)效益、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 然而水資源的匱乏與草坪面積的增加，是限制草坪應(yīng)用的一個(gè)最突出的矛盾，人們?cè)谌找嬉兄赜诓萜汗δ苄浴蕵?lè)性和觀賞性的同時(shí)，又面臨解決草坪草生長(zhǎng)所需水分的問(wèn)題。特別是在水資源變得日益緊缺的城市地區(qū)，草坪灌溉需水量是競(jìng)爭(zhēng)用水的一個(gè)重要方面。在我國(guó)北方干旱和半干旱地區(qū)，水資源僅占全國(guó)總量的7%左右，近年來(lái)有減少的趨勢(shì)。在草坪草生長(zhǎng)初期，水分的多少起致關(guān)重要的作用，決定著草坪建植的成敗及成坪的速度、時(shí)間與質(zhì)量。解決這一問(wèn)題的途徑除了繼續(xù)開(kāi)辟水源，利用農(nóng)藝和工程技術(shù)進(jìn)行有效節(jié)水灌溉、保墑等非生物節(jié)水措施來(lái)提高環(huán)境水資源利用效率外，另一更重要的措施是通過(guò)生物自身節(jié)水潛力(生物節(jié)水)(張正斌，2006，作物水分利用效率的遺傳改良研究進(jìn)展)提高草坪草的水分利用效率(Water use efficiency，WUE)，利用現(xiàn)代科技開(kāi)拓草坪節(jié)水新途徑，培育抗旱節(jié)水新品種，讓每一滴水生產(chǎn)出更多的綠色，創(chuàng)造出更多的生態(tài)效益和社會(huì)效益。草地早熟禾(學(xué)名:Poa pratensis L.英文名Kentucky bluegrass)屬于禾本科 (Gramineae)、早熟禾系(Poatae)、早熟禾屬(Poa L.)的多年生冷季型根莖-疏叢型禾草， 是世界公認(rèn)的優(yōu)良冷季型草坪草，長(zhǎng)期以來(lái)，一直備受草坪業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的重視。其自然資源廣泛分布于世界溫帶、寒溫帶和高寒地區(qū)，中國(guó)也是草地早熟禾資源蘊(yùn)藏量極為豐富的國(guó)家。草地早熟禾葉色濃綠、葉形和株形優(yōu)美，形成的草皮結(jié)實(shí)而富有彈性，因此廣泛應(yīng)用于城市綠地、公園、庭院等草坪綠化，此外還被用于高爾夫球場(chǎng)的球道和高草區(qū)。由于草地早熟禾對(duì)水分脅迫敏感而且耗水量比較大，利用分子生物學(xué)技術(shù)挖掘抗旱基因并進(jìn)行基因重組育成抗旱品種成為目前的育種目標(biāo)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)和獲得一種對(duì)草地早熟禾水分吸收機(jī)制有重要調(diào)節(jié)作用的水通道蛋白基因，對(duì)其克隆并與其他基因重組為實(shí)現(xiàn)育種目標(biāo)提供了可能。但是由于對(duì)水通道蛋白基因克隆時(shí)缺乏內(nèi)參基因，難以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的校正和標(biāo)準(zhǔn)化， 大大阻礙水通道蛋白基因在基因重組育種中的應(yīng)用，成為世界公認(rèn)急需解決的科研難題。內(nèi)參基因是目的基因表達(dá)用作參照的基因，其在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定。內(nèi)參基因的作用主要是對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行校正，使目的基因克隆時(shí)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求并使qRT-PCR的結(jié)果準(zhǔn)確(胡瑞波，2009，植物實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的選擇)° 實(shí)時(shí)焚光定量 RT-PCR (real-time fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, FQ RT-PCR)是檢測(cè)低豐度mRNA 的敏感方法， 為了去除不同標(biāo)本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，通常選擇一定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。內(nèi)參基因擴(kuò)增中的變化可以反映RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和/或cDNA合成效率的變化。選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因以減少檢測(cè)標(biāo)本間的差異是必須的。所以，尋找草地早熟禾水通道蛋白基因合適的內(nèi)參基因成為草地早熟禾水通道蛋白基因育種研究的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)內(nèi)參基因的獲得和應(yīng)用只在一些作物研究上有報(bào)道(鄭小亞等，2011，逆境條件下糯玉米水分利用效率和水通道蛋白表達(dá)差異研究)，但針對(duì)于草地早熟禾水通道蛋白基因表達(dá)時(shí)的內(nèi)參基因，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中草地早熟禾水通道蛋白基因育種研究的困難，本發(fā)明提供一種草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因及其克隆方法，此基因不受早熟禾細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，能經(jīng)受住鹽脅迫、干旱等外界非生物因素的影響，在組織中表達(dá)穩(wěn)定，可用于草地早熟禾水通道蛋白基因表達(dá)的校正和標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明的目的之一是提供一種用于草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因克隆的引物，所述引物序列為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，即:EF1 α F1 5 ’ -GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3’EFl α Rl :5，-TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3，。本發(fā)明的目的之二是提供上述引物克隆得到的草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因序列 SEQ ID NO 3 為T(mén)GTTGCTGTTGCATTAAGCGTGGGTTTGTGGCTTCTAACTCCA AGGATGACCCAGCCAAGGAGGCTGCCAACTTCACCTCCCAGGTCATCATCATGAACCACCCTGGCCAGATCGGCAAC GGTTACGCCCCGGTGCTGGACTGCCACACCTCCCACATTGCTGTCAAGTTTGCAGA。本發(fā)明的目的之三是提供克隆上述草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因的方法，所述方法包括(1)以草地早熟禾總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，(2)將獲得的cDNA作為模板，以引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，即EFl α Fl :5’ -GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3‘EFl α Rl 5，-TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA電泳，回收凝膠獲得目的基因條帶，(4)將獲得的目的基因連接到pMDIS-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行DNA測(cè)序，得到174bp的草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因序列。本發(fā)明的目的之四是提供一種準(zhǔn)確校正水通道蛋白基因表達(dá)量的方法，其實(shí)現(xiàn)方案是將各種鹽脅迫條件下的處理植株和無(wú)處理對(duì)照植株，取嫩葉部位進(jìn)行水通道蛋白基因和內(nèi)參基因的克隆，將克隆基因在菌體中進(jìn)行表達(dá)，將內(nèi)參基因的表達(dá)量對(duì)各脅迫條件下水通道蛋白基因的表達(dá)量進(jìn)行矯正，其中，所述內(nèi)參基因的克隆為(1)以草地早熟禾總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，( 將獲得的cDNA作為模板，以引物SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO :2，即EFl α Fl :5’ -GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3‘EFl α Rl :5’ -TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA電泳，回收凝膠獲得目的基因條帶，⑷ 將獲得的目的基因連接到PMD18-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行DNA測(cè)序，得到174bp的草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因序列。本發(fā)明的有益效果在于(1)本發(fā)明的草地早熟禾EF-I α內(nèi)參基因達(dá)到了實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)在進(jìn)行水通道蛋白基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確定量的要求。(2)本發(fā)明基因不受細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響，能經(jīng)受住外界非生物因素的影響(鹽脅迫、干旱等)，在組織中表達(dá)非常穩(wěn)定，這是傳統(tǒng)內(nèi)參基因不能保證的。附圖表說(shuō)明

圖1草地早熟禾EF-I α基因擴(kuò)增電泳2草地早熟禾EF-I α基因擴(kuò)增曲線(xiàn)圖3草地早熟禾EF-I α基因溶解曲線(xiàn)表1不同逆境處理草地早熟禾EF-I α基因表達(dá)量表2以草地早熟禾EF-I α作內(nèi)參的水通道蛋白基因表達(dá)結(jié)果
具體實(shí)施例方式本發(fā)明按照如下步驟進(jìn)行(1)引物設(shè)計(jì)根據(jù) Genbank 登陸的小麥(Wheat) / 馬鈴薯(Solanum tuberosum) / 胃(Nicotiana tabacum) / M M (Capsicum annuum) / # M (Tomato) / ^ Μ^
(Salsola komarovii)EFl α 基因的 mRNA序列(Accession Number. M90077. 1/AB061263. 1/ D63396. 1/AF242732. 1/X14449. 1/AB073631. 1)，設(shè)計(jì)一對(duì)兼并引物 EFl α F1/EF1 α R1，引物序列如下EFl α Fl :5’ -GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3’EFl α Rl :5’ -TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3’引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。(2)草地早熟禾EF-I α基因克隆以總RNA為模板，應(yīng)用試劑盒為HaiGene，cDNA 1st Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈；在PCR管中配制以下混合液
RNA1 μ g
Oligo dT (20 μ Μ) 1 μ 1 5XRT Mix4 μ 1
Rnase Free dH20 Up to 20 μ 1在PCR儀上按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30°C 5min，42°C 45min，95°C 5min，
4°C。將獲得的cDNA作為模板，用步驟⑴所設(shè)計(jì)的引物Plant EF-I α Fl/Plant EF-Ia Rl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因條帶。反應(yīng)體系如下CN 102321623 A
說(shuō)明書(shū)
4/5頁(yè)
4 Xi-Taq PCR Mix12. 5ul
Plant efla FlPrimer (10 μ Μ)4ul
Plant efla Rl Primer (10 μ Μ)4ul
cDNA4ul
H2O upto50ul在PCR 儀上按以下條件進(jìn)行反應(yīng)95°C 5min，95°C 20s,58°C 45s, 72°C 42s，共；35 個(gè)循環(huán)，72 °C 5min。獲得的目的基因電泳圖見(jiàn)附圖1。(3)將獲得的PCR擴(kuò)增條帶經(jīng)DNA凝膠回收后，連接到pMD18_T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，37°C培養(yǎng)9-16h，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，得到174bp產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，該序列為早熟禾EF-I α基因序列。可用于內(nèi)參矯正分析。序列如下TGTTGCTGTTGCATTAAGCGTGGGTTTGTGGCTTCTAACTCCAA GGATGACCCAGCCAAGGAGGCTGCCAACTTCACCTCCCAGGTCATCATCATGAACCACCCTGGCCAGATCGGCAACG GTTACGCCCCGGTGCTGGACTGCCACACCTCCCACATTGCTGTCAAGTTTGCAGA(4)取草地早熟禾植株進(jìn)行如下脅迫處理用250mM NaclUOOyM ABA.5 % PEG6000脅迫Mh，并設(shè)無(wú)處理植株為對(duì)照，取嫩葉提取總RNA。應(yīng)用試劑盒為HaiGene，cDNA 1st Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。以獲得的cDNA為模板，進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增(HaiGene，SYBR Green Kit)，其反應(yīng)體系如下
4XSYBR Green Mix12. 5ul
Forward Primer (10 μ Μ)Iul
Reverse Primer (10 μ Μ)Iul
cDNA2ul
H2O upto50ul反應(yīng)條件95°C2min，95°C 10s，62°C 35s,40 cycles定量PCR 儀為Bio-I ad Min_0pticon2獲得的表達(dá)量見(jiàn)附表1無(wú)論哪種脅迫處理，草地早熟禾嫩葉中EF-I α表達(dá)量無(wú)明顯差異，擴(kuò)增曲線(xiàn)良好(見(jiàn)附圖2)，溶解曲線(xiàn)單一(見(jiàn)附圖3)，表明此基因穩(wěn)定，可做克隆草地早熟禾水通道蛋白的內(nèi)參基因。此基因只適于作草地早熟禾逆境條件下的水通道蛋白基因表達(dá)的內(nèi)參基因，穩(wěn)定性好于傳統(tǒng)內(nèi)參基因。(5)用 EF-Ia 基因作參照，用 250mM NaclUOOyM ABA、5% PEG6000 脅迫草地早熟禾植株Mh，并設(shè)無(wú)處理植株為對(duì)照，取嫩葉部位進(jìn)行水通道蛋白基因的克隆(水通道蛋白基因在基因bank中的登錄號(hào)Accession Number為JN383984)，其結(jié)果見(jiàn)附表2。從結(jié)果可以看出，經(jīng)過(guò)校正標(biāo)準(zhǔn)化后，用5% PEG6000脅迫的嫩葉，水通道蛋白表達(dá)量最高，其次表達(dá)量較高的是經(jīng)250mM Nacl脅迫處理的葉片，而對(duì)照的葉片表達(dá)量?jī)H為5% PEG6000處理的22. 37%，為250mM Nacl處理的53. ；34%，為ΙΟΟμΜ ABA處理的43. 53%。此步驟如果無(wú)內(nèi)參基因校正，無(wú)法判斷各處理之間水通道蛋白基因表達(dá)的真正量值。表1不同逆境處理草地早熟禾EF-I α基因表達(dá)量
權(quán)利要求
1. 一種用于草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因克隆的引物，其特征在于，所述引物序列為 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2，即EFl α Fl 5' -GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3‘EFl α Rl :5’ -TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3，。
2.采用權(quán)利要求1所述引物克隆得到的草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因，其特征在于，所述內(nèi)參基因序列 SEQ ID NO 3 為T(mén)GTTGCTGTTGCATTAAGCGTGGGTTTGTGGCTTCTAACTCCA AGGATGACCCAGCCAAGGAGGCTGCCAACTTCACCTCCCAGGTCATCATCATGAACCACCCTGGCCAGATCGGCAAC GGTTACGCCCCGGTGCTGGACTGCCACACCTCCCACATTGCTGTCAAGTTTGCAGA。
3.一種克隆草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 以草地早熟禾總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，(2)將獲得的cDNA作為模板， 以引 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2，即EFl α Fl 5' -GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3‘EFl α Rl 5' -TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3‘進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA電泳，回收凝膠獲得目的基因條帶，⑷將獲得的目的基因連接到PMD18-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行DNA 測(cè)序，得到174bp的草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因序列。
4.一種準(zhǔn)確校正水通道蛋白基因表達(dá)量的方法，其特征在于將鹽脅迫條件下的處理植株和無(wú)處理對(duì)照植株，取嫩葉部位進(jìn)行水通道蛋白基因和內(nèi)參基因的克隆，將克隆基因在PMD18-T載體中表達(dá)，將內(nèi)參基因的表達(dá)量對(duì)脅迫條件下水通道蛋白基因的表達(dá)量進(jìn)行矯正，其中，所述內(nèi)參基因的克隆為(1)以草地早熟禾總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 第一鏈，⑵將獲得的cDNA作為模板，以引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，即EFl α Fl 5' -GTTGCHGTTGCHTBAAGCGTGG-3‘EFl α Rl :5’ -TCWGCAAACTTRACAGCAATGTG-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA電泳，回收凝膠獲得目的基因條帶，⑷將獲得的目的基因連接到PMD18-T載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行DNA 測(cè)序，得到174bp的草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種克隆草地早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因的方法，所述方法包括(1)以草地早熟禾總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，(2)以cDNA為模板，以引物EF1αF1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(3)擴(kuò)增產(chǎn)物回收目的基因條帶，(4)將獲得的目的基因連接到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)培養(yǎng)菌液進(jìn)行DNA測(cè)序，得到174bp早熟禾水通道蛋白內(nèi)參基因序列。本發(fā)明方法獲得的草地早熟禾EF-1α內(nèi)參基因不受細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)影響，能經(jīng)受住外界非生物因素影響，在組織中表達(dá)非常穩(wěn)定，優(yōu)于傳統(tǒng)內(nèi)參基因。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102321623SQ20111024695
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月25日
發(fā)明者劉威, 張璐, 王艷彬, 陳陽(yáng), 陳雅君 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)