一種與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)緊密連鎖的sts分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)緊密連鎖的STS分子標(biāo)記及應(yīng)用，通過(guò)對(duì)水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)進(jìn)行定位，根據(jù)定位結(jié)果設(shè)計(jì)一系列分子標(biāo)記并進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)以及對(duì)抗病/感病品種進(jìn)行鑒定篩選，得到一個(gè)與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)qSTV11b緊密連鎖的STS分子標(biāo)記A14，該分子標(biāo)記位于水稻第11染色體克隆AC136491.4上第80511堿基到80939堿基之間，與抗性基因表現(xiàn)高度緊密連鎖，能準(zhǔn)確有效區(qū)分抗病/感病品種或分離群體中純合抗病/感病及雜合單株，而且操作簡(jiǎn)單、使用方便，可用于水稻條紋葉枯病抗性品種的選育及抗性基因資源的篩選。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)緊密連鎖的STS分子標(biāo)記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)緊密連鎖的STS分子標(biāo)記及應(yīng)用，該分子標(biāo)記可用于水稻條紋葉枯病抗性品種的選育及抗性基因資源的篩選。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻條紋葉枯病(Rice Stripe Diease)是由水稻條紋病毒(Rice Stripe Virus,RSV)引起，是一種由灰飛虱刺吸傳播的危害嚴(yán)重的水稻病毒病。該病主要發(fā)生在東亞的溫帶、亞熱帶地區(qū)。最早發(fā)現(xiàn)于日本的關(guān)東地區(qū)，之后在朝鮮、韓國(guó)、前蘇聯(lián)及我國(guó)均有發(fā)生。我國(guó)首見(jiàn)該病在1963年的蘇南地區(qū)，之后迅速擴(kuò)大到包括臺(tái)灣在內(nèi)的18個(gè)省市。近年來(lái)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，該病的發(fā)病面積已達(dá)4000萬(wàn)畝以上，尤以江蘇省為代表的長(zhǎng)江下游稻區(qū)為主。該病對(duì)我國(guó)糧食產(chǎn)量造成重大損失，極大威脅了我國(guó)的糧食安全。
[0003]經(jīng)驗(yàn)表明，控制水稻條紋葉枯病最經(jīng)濟(jì)有效的方法是選用抗耐病品種?？共≠Y源的篩選及了解其遺傳機(jī)理是選育抗病品種的基礎(chǔ)。早年間學(xué)者們經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)的抗性品種的抗性主要由兩對(duì)顯性互補(bǔ)基因Stv-a和Stv-b，以及與Stv-b等位的不完全顯性基因Stv-bi所控制。
[0004]Stv-a定位在水稻第6染色體；Stv_bi被定位在11染色體兩個(gè)重疊克隆220B5和123A6之間，覆蓋物理距離約286Kb (Kusaba，2003)。除此之外，其他一些對(duì)該病具有抗性的基因位點(diǎn)相繼被報(bào)道，如Ikeda等(1982)在Kanto PL3中定位了一個(gè)與Stv_bi緊密連鎖的抗性基因(Pinto，1999);Kazuo等(2002)在秈粳后代BLl中定位到一個(gè)新的與Stv_bi不連鎖的不完全顯性抗病基因；丁秀蘭等在秈稻Dv85中檢測(cè)到兩個(gè)抗病QTL ；Meada等在日本陸稻品種Kanto72種檢測(cè)到兩個(gè)抗病QTL。
[0005]日本率先利用抗病基因Stv-bi育成第一個(gè)條紋葉枯病的抗性品種St.N0.1。之后，相繼育出抗性品種中國(guó)31號(hào)、愛(ài)知6號(hào)、青空、月光、星光、葵風(fēng)等。80年代，我國(guó)也育出一批抗性品種，如中作180、中作9和中作59等。針對(duì)江蘇地區(qū)條紋葉枯病發(fā)病較重的情況，江蘇省農(nóng)科院較早致力于高抗條紋葉枯病粳稻品種的選育工作，先后育出一批優(yōu)良品種，如鎮(zhèn)稻88、鎮(zhèn)稻99、徐稻3號(hào)、徐稻4號(hào)、鹽粳5號(hào)、鹽稻8號(hào)、揚(yáng)粳9538等。
[0006]現(xiàn)有絕大部分抗性品種的抗性來(lái)源于秈稻品種Modan或Mudgo中位于第11染色體的單基因Stv-bi。然而對(duì)該病的抗性研究及抗病品種的選育不能單純依靠這一個(gè)基因，在持久的選擇壓力下，該 基因存在對(duì)條紋葉枯病毒喪失抗性的可能性。因此，挖掘和利用新的對(duì)該病具優(yōu)良抗性的基因?qū)τ谠摬〉拈L(zhǎng)期防治意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)緊密連鎖的STS分子標(biāo)記及應(yīng)用，該分子標(biāo)記位于水稻第11染色體克隆AC136491.4上第80511堿基到80939堿基之間，與抗性基因表現(xiàn)高度緊密連鎖，能準(zhǔn)確有效區(qū)分抗病/感病品種或分離群體中純合抗病/感病及雜合單株，而且操作簡(jiǎn)單、使用方便。
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0009]一種與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)qSTVllb緊密連鎖的STS分子標(biāo)記，由上游引物和下游引物組成，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010]本發(fā)明的STS分子標(biāo)記是通過(guò)以下步驟篩選得到的:
[0011]I)以抗病品種秈稻Dular為父本，意大利感病品種粳稻Balilia為母本雜交，F(xiàn)2代發(fā)生抗性分離，構(gòu)建F2無(wú)性群體為作圖群體，用于基因定位。
[0012]2)對(duì)作圖群體進(jìn)行人工接蟲(chóng)，通過(guò)田間調(diào)查進(jìn)行抗性鑒定，根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果，鑒定親本及作圖群體 對(duì)RSV的抗性。用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析并進(jìn)行QTL檢測(cè)，連續(xù)兩年以株系發(fā)病率和病級(jí)指數(shù)為表型值，檢測(cè)到位于11染色體上的兩個(gè)QTLs，分別命名為qSTVllb和qSTVllc，同時(shí)將位點(diǎn)qSTVllb初步定位在微衛(wèi)星標(biāo)記RM287與RM209之間。
[0013]其中，連鎖分析的過(guò)程為:提取定位群體的水稻基因組DNA，然后以該DNA作為模板，根據(jù)分子標(biāo)記設(shè)計(jì)引物并合成，之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析試驗(yàn)結(jié)果，獲得數(shù)據(jù)。
[0014]提取DNA采用CTAB法，參照Murray等(1980)提出的方法進(jìn)行。
[0015]設(shè)計(jì)引物:利用Gramene網(wǎng)站上(http://www.gramene.0rg)提供的微衛(wèi)星序列搜索工具SSRIT，找出目標(biāo)BAC序列中的微衛(wèi)星序列，用Primer Premier5.0對(duì)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)出上下游引物對(duì)。
[0016]PCR 反應(yīng)體系:Tris-HCl (pH=8.3)，IOmmoI/L ；KC1, 50mmol/L ；MgCl2,2.5mmol/L ；Taq 酶，1.5U ;dNTP，4nmol ;引物，IOpmol ;模版 DNA，20ng。
[0017]PCR 反應(yīng)程序:94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 Imin ；50°C _60°C退火 Imin ;72°C延伸1.5min ；32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
[0018]QTL檢測(cè):利用軟件QTL Cartographer v2.0，以株系發(fā)病率和病級(jí)指數(shù)作為抗病性表型值，以L0D=2.5作為閾值，采用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行抗水稻條紋葉枯病QTL的定位分析。
[0019]3)根據(jù)初步定位結(jié)果，利用F3分離群體和回交群體為作圖群體對(duì)該連鎖抗病位點(diǎn)進(jìn)一步定位。根據(jù)初步定位結(jié)果，設(shè)計(jì)新分子標(biāo)記，利用這些分子標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行連鎖分析，過(guò)程同步驟2)，進(jìn)一步將qSTVllb定位在標(biāo)記RM1355與標(biāo)記STS11-31之間269.6Kb區(qū)域，遺傳距離分別為0.6cM和0.4cM。
[0020]其中，F(xiàn)3分離群體由基因型雜合的F2株系收獲的種子種植獲得，回交群體為由基因雜合的F2無(wú)性株系與感病親本Balilla回交得到的回交一代BC1F1群體。
[0021]新分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)過(guò)程為:利用http://shenghuan.shtu.edu.cn/上水稻DNA多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)中的關(guān)于InDels的信息，再通過(guò)提供目的InDels IObp序列差異)兩側(cè)各20bp的序列及其位置，在相應(yīng)的BAC上找到其兩側(cè)的基因組序列，然后根據(jù)這些序列通過(guò)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物。
[0022]4)用BC4F2純合單株的自交種，種植所得BC4F3代構(gòu)建作圖群體，通過(guò)人工接種及田間抗性調(diào)查分析，利用步驟3)中新設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，過(guò)程同步驟2)。篩選出在抗病及感病未本間具多態(tài)性的分子標(biāo)記。
[0023]5)繼續(xù)構(gòu)建含qSTVllb的一系列染色體片段的漸滲系為作圖群體，通過(guò)人工接種及田間抗性調(diào)查分析，利用步驟4)篩選出的分子標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析，過(guò)程同步驟2)，最終將該位點(diǎn)定位于A17和A38之間，物理距離為47.86Kb。
[0024]大量實(shí)驗(yàn)表明，其中一個(gè)STS標(biāo)記A14與抗性基因表現(xiàn)高度緊密連鎖，能準(zhǔn)確有效區(qū)分抗病/感病品種或分離群體中純合抗病/感病及雜合單株，而且操作簡(jiǎn)單、使用方便。
[0025]本發(fā)明中的株系發(fā)病率即發(fā)病株數(shù)比總株數(shù)；病級(jí)指數(shù)，參照Washio抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查每株接種苗病級(jí)，分別將各級(jí)株數(shù)代入以下公式計(jì)算每株系病級(jí)指數(shù)。
[0026]病級(jí)指數(shù)=(100XA+80XB+60XBt+40XCr+20XC+5XD)/ 測(cè)試秧苗總株數(shù)。
[0027]本發(fā)明在連鎖分析時(shí)所用的SSR分子標(biāo)記是在Gramene網(wǎng)站上獲得的。
[0028]本發(fā)明在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中用到的Taq酶和dNTP均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，用到的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0029]本發(fā)明的分子標(biāo)記可用于檢測(cè)水稻品種、品系或育種材料的抗病性。用所述的STS標(biāo)記擴(kuò)增水稻品種、品系或育種材料的DNA，電泳檢測(cè)結(jié)果中若只出現(xiàn)一條368bp的條帶，則表明為純合抗病植株，存在抗性位點(diǎn)qSTVllb，抗水稻條紋葉枯??；結(jié)果中若只出現(xiàn)一條429bp的條帶，則表明為純合感病植株，不存在該抗性位點(diǎn)，不抗水稻條紋葉枯??；結(jié)果中若出現(xiàn)368bp和429bp兩條帶，則表明為雜合植株，存在該抗性位點(diǎn)，抗水稻條紋葉枯病。
[0030]本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的STS分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳即可快速檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單、方便、快捷。該標(biāo)記可用于水稻條紋葉枯病抗性品種的分子標(biāo)記輔助選育及抗性基因資源的篩選，結(jié)合田間表現(xiàn)，不僅提高抗性品種選育的準(zhǔn)確性，同時(shí)大大縮短了育種年限，避免了大量人力的浪費(fèi)。
[0031]目前絕大部分抗性品種的抗性基因來(lái)源均是Stv-bi，然而僅僅依靠這一個(gè)基因，在持久的選擇壓力下，條紋葉枯病毒容易產(chǎn)生抗耐性，導(dǎo)致品種抗性的降低甚至喪失。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并定位了一個(gè)新的抗性位點(diǎn)，即qSTVllb，為今后水稻抗條紋葉枯病新品種的培育提供了另外一個(gè)抗性基因來(lái)源，對(duì)于該病的長(zhǎng)期防治具有重大意義。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1是水稻11染色體上抗條紋葉枯病位點(diǎn)qSTVllb示意圖。
[0033]圖2和圖3是利用本發(fā)明的STS分子標(biāo)記A14對(duì)表3中材料進(jìn)行抗性基因的檢測(cè)結(jié)果；1_20材料順序如表3。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0035]實(shí)施例1初步定位
[0036]材料:Balilla/DularF2無(wú)性系群體，兩年間均使用226個(gè)株系；養(yǎng)于網(wǎng)室秧池內(nèi)的灰飛虱，繁殖到實(shí)驗(yàn)所需蟲(chóng)量；抗性對(duì)照品種IR36 ;感病對(duì)照品種武育粳3號(hào)。
[0037]I)人工接蟲(chóng)及抗性調(diào)查分析 [0038]將室內(nèi)培養(yǎng)的Balilla/DularF2無(wú)性系群體幼苗、兩個(gè)親本及F1幼苗煉苗后分兩個(gè)重復(fù)移入小盆，蓋上紗網(wǎng)，每個(gè)重復(fù)均放置抗性對(duì)照品種IR36及感性對(duì)照品種武育粳3號(hào)。待活棵后，按每株3頭蟲(chóng)量向小盆內(nèi)接入2-3齡灰飛虱若蟲(chóng)，每天趕蟲(chóng)三次。接種三天后，移去紗網(wǎng)，噴灑殺蟲(chóng)劑。將秧苗置于溫室，常規(guī)管理，待4周后植株癥狀穩(wěn)定后觀察秧苗發(fā)病情況，確定株系發(fā)病率及每株接種苗病級(jí)指數(shù)。
[0039]2) DNA 提取
[0040]a)將約0.1克的水稻葉片放置于2mL離心管中，液氮冷凍后用竹簽搗成粉末；[0041 ] b)加入 700 μ L 經(jīng) 65 °C 預(yù)熱的 2 X CTAB 提取緩沖液(1.4mol/LNaCl，IOOmmoI/LTris-Cl, 20mmol/LEDTA, pH8.0),充分混勻后置于 65°C水浴 30min，每隔 5min 混勻一次；
[0042]c)水浴完畢后，在每個(gè)離心管中加入700μ L氯仿，上下顛倒充分混勻，抽提5min ；
[0043]d) 1000Orpm,離心 8min ；
[0044]e)取上清500 μ L移入1.5mL離心管中；
[0045]f)加入500 μ L預(yù)先冷凍的異丙醇，混勻后冰上靜置30min ；
[0046]g) 12000rpm,離心 5min ；
[0047]h)棄上清，DNA沉淀用70%的酒精洗滌2次；
[0048]i)棄盡洗滌液，DNA沉淀風(fēng)干后溶于50 μ L的滅菌雙蒸水中，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0049]3)用SSR標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析
[0050]利用Gramene網(wǎng)站上(http://www.gramene.0rg)提供的微衛(wèi)星序列搜索工具SSRIT,找出目標(biāo)BAC序列中的微衛(wèi)星序列，用Primer Premier5.0對(duì)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增長(zhǎng)度為200-700bp左右的上下游引物對(duì)，進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，選出在抗病及感病親本中間有多態(tài)性的標(biāo)記對(duì)群體進(jìn)行連鎖分析。
[0051]PCR 反應(yīng)體系:Tris-HCl (pH=8.3)，IOmmoI/L ；KC1, 50mmol/L ；MgCl2,2.5mmol/L ；Taq 酶，1.5U ;dNTP，4nmol ;引物，IOpmol ;模版 DNA，20ng。
[0052]反應(yīng)程序:94°C 預(yù)變性 4min ;94°C 變性 Imin ；50°C _60°C 退火 Imin ;72°C 延伸
1.5min ；32 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
[0053]3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120V,電泳120min。
[0054]4) QTL 檢測(cè)
[0055] 利用軟件QTL Cartographer v2.0,連續(xù)兩年對(duì)株系發(fā)病率和病級(jí)指數(shù)作為抗病性表型值，以L0D=2.5作為閾值，采用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行抗水稻條紋葉枯病QTL的定位分析，在兩年都檢測(cè)到2個(gè)QTLs，將位點(diǎn)qSTVllb初步定位在微衛(wèi)星標(biāo)記RM287與RM209之間，見(jiàn)表1、表2。表1為連續(xù)兩年(1Y、2Y)以發(fā)病率為表型值檢測(cè)抗水稻條紋葉枯病QTL的位置和特征，表2為連續(xù)兩年(1Υ、2Υ)以病級(jí)指數(shù)為表型值抗水稻條紋葉枯病QTL的位置和特征。
[0056]表1
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種與水稻抗條紋葉枯病基因位點(diǎn)緊密連鎖的STS分子標(biāo)記，由上游引物和下游引物組成，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的STS分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于，用所述的STS分子標(biāo)記擴(kuò)增水稻品種、品系或育種材料的DNA，電泳檢測(cè)結(jié)果中若只出現(xiàn)一條368bp的條帶，則表明存在抗性位點(diǎn)qSTVllb，為純合抗病植株，抗水稻條紋葉枯??；結(jié)果中若只出現(xiàn)一條429bp的條帶，則表明為純合感病植株，不存在抗性位點(diǎn)qSTVllb，不抗水稻條紋葉枯?。唤Y(jié)果中若出現(xiàn)368bp和429bp兩條帶，則表明存在抗性位點(diǎn)qSTVl Ib，為雜合抗病植株，抗水稻條紋葉枯 病。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104004751SQ201410138338
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】吳書(shū)俊, 閆影, 曹黎明, 萬(wàn)常照, 趙志鵬 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院