一種基于pcr的核酸傳感器快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)針對(duì)待檢物目標(biāo)序列的上下游特異性引物，特異性引物序列與特異性引物5’端的Tag序列通過(guò)C9九個(gè)碳原子進(jìn)行連接，將特異性引物置于PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，將上游特異性引物Tag序列的互補(bǔ)序列固定于硝酸纖維素膜上，下游特異性引物Tag序列的互補(bǔ)序列3’端進(jìn)行修飾后與膠體金顆粒相連接，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物末端Tag序列與膠體金顆粒上序列互補(bǔ)，配合膠體金層析試紙進(jìn)行快速檢測(cè)。本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，檢測(cè)成本低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且本發(fā)明可用于所有生物目標(biāo)序列的檢測(cè)，通過(guò)PCR體系擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)待檢測(cè)物目標(biāo)序列的定性分析。
【專利說(shuō)明】-種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)方法，具體是一種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，簡(jiǎn)稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段。 PCR是利用DNA在體外攝氏95°C高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，60°C左右低溫退火時(shí)引物與單鏈 按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度72°C左右，DNA聚合酶沿 著磷酸到五碳糖5' -3'的方向合成互補(bǔ)鏈，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。
[0003] PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、純度要求低的優(yōu)點(diǎn)，PCR反應(yīng)擴(kuò)增出 了高的拷貝數(shù)，下一步檢測(cè)就成了關(guān)鍵。熒光素溴化乙錠染色凝膠電泳是最常用的檢測(cè)手 段，然而溴化乙錠是強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性，對(duì)環(huán)境造成極大的污染，危害人體健康。同 時(shí)，電泳檢測(cè)以瓊脂糖或聚丙烯酰胺為介質(zhì)，借助電泳儀、紫外透射光儀等進(jìn)行，既耗時(shí)又 費(fèi)成本。因此，人們?nèi)匀恍枰獙ふ铱焖?、靈敏、低成本、操作簡(jiǎn)易的檢測(cè)工具代替?zhèn)鹘y(tǒng)的電泳 檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種操作方便、檢測(cè)成本低的基于PCR的核酸傳感器快速 檢測(cè)方法，以解決上述【背景技術(shù)】中提出的問題。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案： 一種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方法，包括如下步驟： 1)設(shè)計(jì)得到一對(duì)針對(duì)待檢物目標(biāo)序列的特異性引物，分別記為F-Primer和R-Primer; 2)設(shè)計(jì)一段與特異性引物F-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)的序列，記為序列T;設(shè)計(jì)一 段與特異性引物R-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)并3'端巰基修飾的序列，記為序列A;合 成一段特異性引物R-Primer的5'端Tag序列，記為序列C; 3)將序列T與序列C分別固定于硝酸纖維素膜上，序列A的3'端進(jìn)行修飾后的序列與 膠體金連接，得到金標(biāo)產(chǎn)物B; 4)提取樣品總RNA/基因組DNA，將總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;將cDNA/基因組DNA 樣品、特異性引物F-Primer和特異性引物R-Primer置于含有Taq聚合酶的PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 5)擴(kuò)增產(chǎn)物與金標(biāo)產(chǎn)物B混合后，置于步驟3)已處理的硝酸纖維素膜上進(jìn)行側(cè)向?qū)?析，通過(guò)膠體金層析試紙檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在與序列T互補(bǔ)的末端帶單鏈Tag序列的 雙鏈DNA，確定待檢物是否存目標(biāo)序列。
[0006] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述特異性引物F-Primer和特異性引物R-Primer的 5'端分別連接有Tag序列，特異性引物序列與Tag序列通過(guò)C9九個(gè)碳原子進(jìn)行連接。
[0007] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述序列A的3'端進(jìn)行修飾后的序列與膠體金連接是 指將序列A的3'端進(jìn)行巰基修飾后與膠體金顆粒連接，或者序列A的3'端進(jìn)行biotin修 飾，用膠體金顆粒鏈霉親和素標(biāo)記，通過(guò)biotin與鏈霉親和素結(jié)合從而使序列A與膠體金 顆粒結(jié)合。
[0008] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟4)中采用特異性引物F-Primer和特異性引 物R-Primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq聚合酶延伸至C9九個(gè)碳原子位點(diǎn)時(shí)延伸終止，擴(kuò)增產(chǎn)物 為雙向末端帶單鏈Tag序列的雙鏈DNA。
[0009] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述特異性引物序列與Tag序列的連接點(diǎn)可以為任意 一種可終止Taq聚合酶延伸的修飾。
[0010] 作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述膠體金層析試紙是單鏈核酸快速檢測(cè)試紙。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，檢測(cè)成本低，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確 可靠，且本發(fā)明可用于所有生物目標(biāo)序列的檢測(cè)，通過(guò)PCR體系擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)待檢測(cè)物目標(biāo)序 列的定性分析。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1為本發(fā)明一種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方法的檢測(cè)流程圖。

【具體實(shí)施方式】 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。
[0013] 請(qǐng)參閱圖1，一種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方法，包括如下步驟： 1) 設(shè)計(jì)得到一對(duì)針對(duì)待檢物目標(biāo)序列的特異性引物，分別記為F-Primer和R-Primer， 特異性引物F-Primer和特異性引物R-Primer的5'端分別連接有Tag序列，特異性引物序 列與Tag序列通過(guò)C9九個(gè)碳原子進(jìn)行連接，特異性引物序列與Tag序列的連接點(diǎn)可以為任 意一種可終止Taq聚合酶延伸的修飾，為保證檢測(cè)效果，特異性引物F-Primer和特異性引 物R-Primer之間不能形成二聚體，特異性引物自身不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)； 2) 設(shè)計(jì)一段與特異性引物F-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)的序列，記為序列T;設(shè)計(jì)一 段與特異性引物R-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)并3'端巰基修飾的序列，記為序列A;合 成一段特異性引物R-Primer的5'端Tag序列，記為序列C; 3) 將序列T與序列C分別固定于硝酸纖維素膜上，將序列A的3'端進(jìn)行巰基修飾后與 膠體金顆粒連接，或者序列A的3'端進(jìn)行biotin修飾，用膠體金顆粒鏈霉親和素標(biāo)記，通 過(guò)biotin與鏈霉親和素結(jié)合從而使序列A與膠體金顆粒結(jié)合，得到金標(biāo)產(chǎn)物B; 4) 提取樣品總RNA/基因組DNA，將總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;將cDNA/基因組DNA 樣品、特異性引物F-Primer和特異性引物R-Primer置于含有Taq聚合酶的PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系中進(jìn)行擴(kuò)增，采用特異性引物F-Primer和特異性引物R-Primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq 聚合酶延伸至C9九個(gè)碳原子位點(diǎn)時(shí)延伸終止，擴(kuò)增產(chǎn)物為雙向末端帶單鏈Tag序列的雙鏈 DNA； 5) 擴(kuò)增產(chǎn)物與金標(biāo)產(chǎn)物B混合后，置于步驟3)已處理的硝酸纖維素膜上進(jìn)行側(cè)向?qū)?析，通過(guò)膠體金層析試紙?jiān)嚰垯z測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在與序列T互補(bǔ)的末端帶單鏈Tag序 列的雙鏈DNA，確定待檢物是否存目標(biāo)序列。
[0014] 實(shí)施例1 一種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方法對(duì)東南亞a地中海貧血進(jìn)行檢查，包括如下 步驟： 1) 設(shè)計(jì)得到一對(duì)針對(duì)待檢物目標(biāo)序列的特異性引物，分別記為F-Primer和R-Primer， 特異性引物F-Primer和特異性引物R-Primer的5'端分別連接有Tag序列，特異性引物序 列與Tag序列通過(guò)C9九個(gè)碳原子進(jìn)行連接，特異性引物序列與Tag序列的連接點(diǎn)可以為任 意一種可終止Taq聚合酶延伸的修飾，為保證檢測(cè)效果，特異性引物F-Primer和特異性引 物R-Primer之間不能形成二聚體，特異性引物自身不能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)； 2) 設(shè)計(jì)一段與特異性引物F-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)的序列，記為序列T;設(shè)計(jì)一 段與特異性引物R-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)并3'端巰基修飾的序列，記為序列A;合 成一段特異性引物R-Primer的5'端Tag序列，記為序列C，所述特異性引物F-Primer、特 異性引物R-Primer、序列T、序列A和序列C的具體序列如表1所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種基于PCR的核酸傳感器快速檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 設(shè)計(jì)得到一對(duì)針對(duì)待檢物目標(biāo)序列的特異性引物，分別記為F-Primer和R-Primer ; 2) 設(shè)計(jì)一段與特異性引物F-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)的序列，記為序列T ;設(shè)計(jì)一 段與特異性引物R-Primer的5'端Tag序列互補(bǔ)并3'端巰基修飾的序列，記為序列A ;合 成一段特異性引物R-Primer的5'端Tag序列，記為序列C ; 3) 將序列T與序列C分別固定于硝酸纖維素膜上，序列A的3'端進(jìn)行修飾后的序列與 膠體金連接，得到金標(biāo)產(chǎn)物B ; 4) 提取樣品總RNA/基因組DNA，將總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ;將cDNA/基因組DNA 樣品、特異性引物F-Primer和特異性引物R-Primer置于含有Taq聚合酶的PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系中進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物； 5) 擴(kuò)增產(chǎn)物與金標(biāo)產(chǎn)物B混合后，置于步驟3)已處理的硝酸纖維素膜上進(jìn)行側(cè)向?qū)?析，通過(guò)膠體金層析試紙檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在與序列T互補(bǔ)的末端帶單鏈Tag序列的 雙鏈DNA，確定待檢物是否存目標(biāo)序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述序列A的3'端進(jìn)行修飾后 的序列與膠體金連接是指將序列A的3'端進(jìn)行巰基修飾后與膠體金顆粒連接，或者序列A 的3'端進(jìn)行biotin修飾，用膠體金顆粒鏈霉親和素標(biāo)記，通過(guò)biotin與鏈霉親和素結(jié)合 從而使序列A與膠體金顆粒結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述特異性引物F-Primer和特 異性引物R-Primer的5'端分別連接有Tag序列，特異性引物序列與Tag序列通過(guò)C9九個(gè) 碳原子進(jìn)行連接。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟4)中采用特異性引物 F-Primer和特異性引物R-Primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq聚合酶延伸至C9九個(gè)碳原子位點(diǎn) 時(shí)延伸終止，擴(kuò)增產(chǎn)物為雙向末端帶單鏈Tag序列的雙鏈DNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述特異性引物序列與 Tag序列的連接點(diǎn)為任意一種可終止Taq聚合酶延伸的修飾。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述膠體金層析試紙是單鏈核 酸快速檢測(cè)試紙。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328176SQ201410586082
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】陳香蓮 申請(qǐng)人:南京天瑞生物科技有限公司