用于檢測(cè)痛風(fēng)相關(guān)snp位點(diǎn)的等位基因特異性引物及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種用于檢測(cè)痛風(fēng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物及其應(yīng)用，所述引物包括引物對(duì)Fw91和Rn191，F(xiàn)w91和Rn291；Fw11和Rn111，F(xiàn)w11和Rn211；所述引物的應(yīng)用具體為：反應(yīng)體系：總體積為30μL，含有模板0.8μL、引物對(duì)各0.4μmol/L、緩沖液3μL、MgCl23.5mmol/L、海藻糖2.5mmol/L、硫酸銨10mmol/L、甘油10%、TW-200.1%、dNTP0.25mmol/L、10XSYBRGreenI染料和TaqDNA聚合酶1.8U，其余為水。本發(fā)明建立一種高效快速和低成本地對(duì)目的基因進(jìn)行SNP分型檢測(cè)方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)痛風(fēng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物及其應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)痛風(fēng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物，及利用所述 引物對(duì)外周血樣品進(jìn)行SNP分型檢測(cè)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 作為第三代DNA遺傳標(biāo)記，單核苷酸多態(tài)性（SNP)具有分布廣、數(shù)量大、易于檢測(cè) 和在基因組中相對(duì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，其不同基因型與個(gè)人及群體對(duì)重大疾病易感性及發(fā)展進(jìn)程 有很大相關(guān)性。對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重點(diǎn)發(fā)展方向，也是個(gè)性化醫(yī)療的基礎(chǔ)之一，因 此對(duì)SNP分型檢測(cè)方法的研究更是成為疾病研究特別是多基因疾病研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)。但 是目前大多數(shù)SNP分型檢測(cè)方法都需要先提取樣品DNA，然后才能加以檢測(cè)。在進(jìn)行大樣 本檢測(cè)時(shí)，對(duì)血液等組織樣品進(jìn)行基因組提取，不僅操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力，而且增加了樣品 間交叉污染的可能性，同時(shí)也增加了操作人員的感染風(fēng)險(xiǎn)。因此，目前對(duì)SNP的檢測(cè)及與疾 病的相關(guān)性研究多在相關(guān)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。由于臨床樣品需要在各臨床治療單位采集，要將這 些樣品集中到相關(guān)實(shí)驗(yàn)室，其保存和運(yùn)輸均需要較高的要求如低溫等，這無(wú)形中增加了 SNP 檢測(cè)的工作量和成本，極大地限制了 SNP檢測(cè)分析技術(shù)在臨床領(lǐng)域的研究與應(yīng)用。而SNP 這一疾病相關(guān)遺傳標(biāo)記的檢測(cè)要想進(jìn)一步發(fā)展，最終走向臨床，一種快速、安全、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì) 和易于推廣的檢測(cè)方法是必須的前提。
[0003] 目前已有直接針對(duì)血樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增的技術(shù)，但是這些技術(shù)多需要電泳檢測(cè)，對(duì) 于大樣本檢測(cè)而言工作量依然很大，而且很多凝膠染料如溴化乙啶（EB)等對(duì)操作人員有 潛在的危害，因此也無(wú)法大規(guī)模推廣應(yīng)用。
[0004] 痛風(fēng)是一種高尿酸血癥，據(jù)研究表明其發(fā)病有家族聚集的特點(diǎn)，且發(fā)病率隨著人 民生活水平的提高而逐漸升高，并且有低齡化的趨勢(shì)。經(jīng)研究，痛風(fēng)代謝相關(guān)基因 SNP的存 在使個(gè)體之間對(duì)痛風(fēng)的易感性有著明顯的差異，針對(duì)痛風(fēng)相關(guān)SNP檢測(cè)對(duì)痛風(fēng)早期診斷具 有很大意義，因此本發(fā)明以痛風(fēng)相關(guān)的SNP為研究對(duì)象.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一在于提供一種用于檢測(cè)痛風(fēng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的等 位基因特異性引物，擴(kuò)增效率高、特異性好。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案之一解決上述技術(shù)問(wèn)題之一的：一種用于檢測(cè)痛風(fēng)相 關(guān)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物，包括針對(duì)SNP位點(diǎn)Rsl333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)Fw91、 Rnl91，及針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs6855911序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)Fwll、Rnlll ;各引物具體為：
[0007] (1)針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs 1333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)：
[0008] 引物 Fw91 序列：TGGACACTCTAATCCCTGCTGAAAG ;
[0009] 引物 Rnl91 序列：CAGGCGGATGCTCCTCTGCAAGI;
[0010] (2)針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs6855911序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)：
[0011] 引物 Fwl 1 序列：GGCAGTGGACATCTTTCAGGGTG;
[0012] 引物 Rnlll 序列：GTCTTCATCTACTTGGCATCATCTe ;
[0013] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案之二解決上述技術(shù)問(wèn)題之一的：一種用于檢測(cè)痛風(fēng)相 關(guān)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物，包括針對(duì)SNP位點(diǎn)Rsl333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)Fw91、 Rn291，及針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs6855911序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)Fwll、Rn211 ;各引物具體為：
[0014] (1)針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs 1333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)：
[0015] 引物 Fw91 序列：TGGACACTCTAATCCCTGCTGAAAG ;
[0016] 引物 Rn291 序列：CAGGCGGATGCTCCTCTGCAAG￡ ;
[0017] (2)針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs6855911序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)：
[0018] 引物 Fwl 1 序列：GGCAGTGGACATCTTTCAGGGTG;
[0019] 引物 Rn211 序列：GTCTTCATCTACTTGGCATCATCTI;
[0020] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于提供一種利用所述的引物對(duì)外周血樣品進(jìn) 行SNP分型檢測(cè)的方法，建立了一種高效快速和低成本地對(duì)目的基因進(jìn)行SNP分型檢測(cè)的 方法。
[0021] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題之二的：一種所述的引物對(duì)外周血 樣品進(jìn)行SNP分型檢測(cè)的方法，包括以下步驟：
[0022] 步驟一：采用EDTA抗凝劑處理外周血，將外周血直接采集在EDTA抗凝管中，上下 顛倒混勻,從血液樣品中部吸取〇. 8 μ L作為模板；
[0023] 步驟二：采用real-time PCR反應(yīng)儀器進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，其中反應(yīng)體系 和反應(yīng)程序具體如下：
[0024] 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為30 μ L，含有模板0.8 μ L、引物對(duì)中的兩引物各 0.4以111〇1/]^、緩沖液3 4]^、]\%〇123.51111]1〇1/]^、海藻糖2.5 1111]1〇1/]^、硫酸銨10 1111]1〇1/]^、甘油 10% (w/v)、TW-20 0· 1% (W/V)、dNTP 0.25 mmol/L、0.5x SYBR Green I 染料和 Taq DNA 聚 合酶1. 8 U，其余成分為無(wú)菌水；其中，各組分的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積30 μ L為基 準(zhǔn)；
[0025] 所述緩沖液為PCR buffer經(jīng)NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 3后的溶液；
[0026] 所述引物對(duì)為下述引物對(duì)中的任一對(duì)：引物對(duì)Fw91、Rnl91 ;引物對(duì)Fw91、Rn291 ; 引物對(duì) Fwll、Rnlll ;引物對(duì) Fwll、Rn211 ;
[0027] 反應(yīng)程序?yàn)椋?br> [0028] 96.5 C 3 min 94 °C 25s ^ 57.3 °C 20s p盾環(huán) 40 次 72 °C 45s ^ 72 °C 7min 95 °C 15s 60 °C lmin 95 °C 15s
[0029] 進(jìn)一步地，所述步驟一中的模板也可采用濾紙干血樣品，其制備方法如下：采集外 周血時(shí)直接將0. 8μ L外周血滴在面積為0. 5cm2的濾紙上，將帶有血液樣品的濾紙直接加 入所述反應(yīng)體系中。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于：省去了提取血樣DNA的步驟，簡(jiǎn)化了 SNP檢測(cè)的流程，節(jié) 省了時(shí)間和成本，同時(shí)減少了樣品間相互污染的幾率，更重要的是減少了操作人員與血樣 接觸的機(jī)會(huì)，即可大大減少臨床操作人員感染未知傳染性疾病的風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)濾紙干血樣品 的使用使得臨床樣本的保存更為容易。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0032] 圖1為以三種模板(提取的DNA、EDTA抗凝劑處理的血液樣品、濾紙干血樣品）分 別對(duì)Rsl 165205進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0033] 圖2為以三種模板(提取的DNA、EDTA抗凝劑處理的血液樣品、濾紙干血樣品）分 別對(duì)Rsll65205進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
[0034] 圖3為以三種模板(提取的DNA、EDTA抗凝劑處理的血液樣品、濾紙干血樣品）分 別對(duì)Rsll65205進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增后各擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0035] 圖4為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段Rs2231142進(jìn)行等位基因 特異性real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0036] 圖5為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段Rs2231142進(jìn)行等位基因 特異性real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
[0037] 圖6為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段Rs2231142進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0038] 圖7為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段Rs2231142進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
[0039] 圖8為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段Rsl333049進(jìn)行等位基因 特異性real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0040] 圖9為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段RS1333049進(jìn)行等位基因 特異性real-time PCR擴(kuò)增后的溶解曲線圖。
[0041] 圖10為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段RS1333049進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0042] 圖11為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段Rsl333049進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
[0043] 圖12為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段Rs37333591進(jìn)行等位基 因特異性real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0044] 圖13為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段Rs37333591進(jìn)行等位基 因特異性real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
[0045] 圖14為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段Rs37333591進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0046] 圖15為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段Rs37333591進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
[0047] 圖16為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段Rs6855911進(jìn)行等位基因 特異性real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0048] 圖17為以EDTA抗凝劑處理的血液樣品為模板對(duì)靶片段Rs6855911進(jìn)行等位基因 特異性real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。
[0049] 圖18為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段Rs6855911進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增曲線圖。
[0050] 圖19為以濾紙干血樣品為模板對(duì)靶片段Rs6855911進(jìn)行等位基因特異性 real-time PCR擴(kuò)增的溶解曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 本發(fā)明根據(jù)文獻(xiàn)資料選擇痛風(fēng)相關(guān)基因上包含SNP位點(diǎn)的側(cè)翼序列為靶片段 進(jìn)行擴(kuò)增，其中包含5個(gè)已報(bào)道的痛風(fēng)相關(guān)SNP (Rsll65205、Rs2231142、Rs3733591、 Rs6855911、Rsl333049)位點(diǎn)的序列片段均從 NCBI 網(wǎng)站（http://www. ncbi. nlm. nih. gov) 上獲取。所述Rsll65205的堿基序列如SEQ ID NO :1所示；所述Rs2231142的堿基序列如 SEQ ID NO :2所示；所述Rs3733591的堿基序列如SEQ ID NO :3所示；所述Rs6855911的堿 基序列如SEQ ID NO :4所示；所述Rsl333049的堿基序列如SEQ ID NO :5所示。
[0052] 本發(fā)明對(duì)包含SNP位點(diǎn)Rsl333049、Rs6855911和Rs3733591的序列采用 Primer5. 0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共包括外引物（Fw或Rw)，兩條:V端第一個(gè)堿基分別與SNP位 點(diǎn)野生或突變堿基互補(bǔ)的特異性引物（Rn)，為了增強(qiáng)特異性性，引物3'端第三個(gè)堿基 或第4個(gè)堿基引入人為錯(cuò)配堿基，引物的Tm值及其他參數(shù)使用01igoAnalyzer3. 0軟件 (http://scitools. idtdna. com/analyzer/)計(jì)算，本發(fā)明所用引物如下表1所示。下表中， Rsll65205和Rs2231142的外引物Fw05、Rw05、Fw42,及等位基因特異性引物Rnl42、Rn242 已有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)。
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)痛風(fēng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物，其特征在于：包括針對(duì)SNP 位點(diǎn)Rsl333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)Fw91、Rnl91，及針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs6855911序列設(shè)計(jì)的引 物對(duì)Fwll、Rnlll ;各引物具體為： (1) 針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs 1333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)： 引物 Fw91 序列：TGGACACTCTAATCCCTGCTGAAAG ; 引物 Rnl91 序列：CAGGCGGATGCTCCTCTGCAAGJ：; (2) 針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs6855911序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)： 引物 Fwll 序列：GGCAGTGGACATCTTTCAGGGTG; 引物 Rnlll 序列：GTCTTCATCTACTTGGCATCATCTS。
2. -種用于檢測(cè)痛風(fēng)相關(guān)SNP位點(diǎn)的等位基因特異性引物，其特征在于：包括針對(duì)SNP 位點(diǎn)1^1333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)？《91、1?11291，及針對(duì)5即位點(diǎn)1^6855911序列設(shè)計(jì)的引 物對(duì)Fwll、Rn211 ;各引物具體為： (1) 針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs 1333049序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)： 引物 Fw91 序列：TGGACACTCTAATCCCTGCTGAAAG ; 引物 Rn291 序列：CAGGCGGATGCTCCTCTGCAAGS ; (2) 針對(duì)SNP位點(diǎn)Rs6855911序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)： 引物 Fwll 序列：GGCAGTGGACATCTTTCAGGGTG; 引物 Rn211 序列：GTCTTCATCTACTTGGCATCATCTJ：。
3. -種利用權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)外周血樣品進(jìn)行SNP分型檢測(cè)的方法，其特 征在于：包括以下步驟： 步驟一：采用EDTA抗凝劑處理外周血，將外周血直接采集在EDTA抗凝管中，上下顛倒 混勻，從血液樣品中部吸取〇. 8 μ L作為模板； 步驟二：采用real-time PCR反應(yīng)儀器進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，其中反應(yīng)體系和反應(yīng) 程序具體如下： 反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為30 μ L，含有模板0. 8 μ L、引物對(duì)中的兩引物各 0· 4 μ mol/L、緩沖液 3 μ L、MgCl23. 5mmol/L、海藻糖 2. 5mmol/L、硫酸銨 10 mmol/L、甘油 10% (w/v)、TW-20 0.1% (W/V)、dNTP 0.25 mmol/L、0.5x SYBR Green I 染料和 Taq DNA 聚合酶 1. 8 U，其余成分為無(wú)菌水；其中，各組分的濃度均是以反應(yīng)體系的總體積30 μ L為基準(zhǔn)； 所述緩沖液為PCR buffer經(jīng)NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 3后的溶液； 所述引物對(duì)為下述引物對(duì)中的任一對(duì)：引物對(duì)Fw91、Rnl91 ;引物對(duì)Fw91、Rn291 ;引物 對(duì) Fwll、Rnlll ;引物對(duì) Fwll、Rn211 ; 反應(yīng)程序?yàn)椋? 96.5 °C 3 min 94 !C 25s ^ 57.3。。 20s p盾環(huán) 40 次 1TC 45s 72 °C 7min 。 95 !C 15s 60 °C lmin 95 °C 15s
4.如權(quán)利要求3所述的利用引物對(duì)對(duì)外周血樣品進(jìn)行SNP分型檢測(cè)的方法，其特征在 于：所述步驟一中的模板也可采用濾紙干血樣品，其制備方法如下：采集外周血時(shí)直接將 0. 8 μ L外周血滴在面積為0. 5cm2的濾紙上，將帶有血液樣品的濾紙直接加入所述反應(yīng)體系 中。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104059965SQ201410119246
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】楊會(huì)勇, 王清瑤, 刁勇, 徐超塵 申請(qǐng)人:華僑大學(xué)