在水稻中高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fa1的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種在水稻中高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fa1的方法，其是在原有蛋白Cry30Fa1（GenBank:ACI22625.1）的基礎(chǔ)上，將編碼該蛋白的基因改造為水稻偏好的密碼子，然后將改造后的基因（Seq?ID?No.1）導(dǎo)入水稻中，蛋白Cry30Fa1在水稻中的表達(dá)量，比未改造的基因高，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)褐飛虱的抗性顯著，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】在水稻中高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fa1的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，涉及一種在水稻中高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fal的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]揭飛風(fēng)(Nilaparvata lugens Stdl)又稱(chēng)揭稻風(fēng)，屬同翅目(Homoptera),飛風(fēng)科(Delphacide)，是一種遍布世界的遷飛性害蟲(chóng)，是危害亞洲稻作區(qū)最嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一，嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量及其品質(zhì)，我國(guó)褐飛虱的年發(fā)生面積為1330-2000萬(wàn)hm2，大約占水稻種植面積的1/2。褐飛虱對(duì)水稻的危害主要表現(xiàn)為以下幾方面:I)成蟲(chóng)和若蟲(chóng)群集于稻叢基部，刺吸水稻莖葉韌皮部中汁液，消耗稻株?duì)I養(yǎng)；受害重時(shí)，稻株下部變黑、腐爛發(fā)臭和癱瘓倒?fàn)睢?)成蟲(chóng)產(chǎn)卵時(shí)刺傷稻株莖葉組織，形成大量傷口，促使水分由刺傷點(diǎn)向外散失，同時(shí)輸導(dǎo)組織破壞，同化作用減弱，加速稻株倒伏。3)褐飛虱還是傳播水稻病毒病的蟲(chóng)媒，可以傳播或誘發(fā)水稻病害。此外，褐飛虱取食或產(chǎn)卵時(shí)造成的大量傷口，有利于水稻紋枯病等病菌的侵染；取食危害時(shí)排泄的“蜜露”，富含各種糖類(lèi)和氨基酸，覆蓋在稻株上，易招致病菌的孳生。
[0003]長(zhǎng)期以來(lái)，主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治褐飛虱，但是傳統(tǒng)單藥劑控制方法已經(jīng)很難滿足現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)的需求，且濫用化學(xué)殺蟲(chóng)劑會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染和生態(tài)環(huán)境破壞等問(wèn)題。另外，褐飛虱生物型的改變、食物鏈的豐富以及對(duì)主治藥劑吡蟲(chóng)啉等產(chǎn)生抗性的一些因素促使了褐飛虱的反復(fù)暴發(fā)。因此，世界上許多國(guó)家都在不斷挖掘和利用抗褐飛虱基因，進(jìn)而選育具有持久抗蟲(chóng)性水稻品種。
[0004]研究者陸續(xù)從水稻抗褐飛虱品種中定位了一系列抗飛虱主基因，目前為止，已經(jīng)鑒定了水稻中35個(gè)褐飛虱抗性位點(diǎn)，其中4個(gè)已被克隆，并培育出一系列抗褐飛虱水稻品種。另外，對(duì)同翅目害蟲(chóng)具有控制作用的基因，還包括膽固醇氧化酶基因、大豆胰蛋白酶抑制(SKTI)基因和雪花蓮?fù)庠茨?GNA)基因。由于GNA蛋白對(duì)人的毒性極低，但對(duì)褐飛虱、黑尾葉蟬有極強(qiáng)的毒殺作用，同時(shí)還能抑制蚜蟲(chóng)的生長(zhǎng)，因而已經(jīng)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因水稻中。這些抗性品種的推廣在一定階段緩解了褐飛虱的危害，獲得了較大的經(jīng)濟(jì)效益，也為發(fā)展環(huán)境友好型和資源節(jié)約型農(nóng)業(yè)做出了重要貢獻(xiàn)。
[0005]然而，褐飛虱具有快速演變形成新的生物型以適應(yīng)新的抗蟲(chóng)品種的能力，使一系列單一抗性的水稻品種往往很快就被新的生物型所危害，如IR26僅推廣兩年就喪失了抗性，而IR36的抗性也僅維持了 8年。因此，篩選對(duì)褐飛虱具有獨(dú)特殺蟲(chóng)機(jī)理的新型基因，結(jié)合分子輔助選擇技術(shù)聚合多個(gè)抗蟲(chóng)基因或QTL，已成為防治褐飛虱危害和減輕抗蟲(chóng)品種對(duì)褐飛虱的選擇壓 力，延長(zhǎng)品種使用年限的首要任務(wù)。
[0006]蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,在形成芽胞的同時(shí)能產(chǎn)生對(duì)鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、同翅目、線蟲(chóng)等多種害蟲(chóng)具有特異殺蟲(chóng)活性的殺蟲(chóng)晶體蛋白(Insecticidal Crystal Proteins, ICPs),編碼這些蛋白的基因稱(chēng)為cry或cyt基因。這些殺蟲(chóng)晶體蛋白具有對(duì)人畜無(wú)害、環(huán)境友好的特點(diǎn)。因此，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、衛(wèi)生等領(lǐng)域的害蟲(chóng)防治，成為世界上應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲(chóng)劑；同時(shí)其殺蟲(chóng)基因已成功地應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物中，是轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物主要的基因來(lái)源。
[0007]編碼殺蟲(chóng)晶體蛋白的基因稱(chēng)為cry或cyt基因，由國(guó)際Bt殺蟲(chóng)基因命名委員會(huì)正式命名，主要是根據(jù)殺蟲(chóng)基因編碼的氨基酸序列的同源性進(jìn)行分類(lèi)；由于氨基酸序列差異與殺蟲(chóng)特異性及毒力有密切的相關(guān)性，命名委員會(huì)規(guī)定與已知蛋白同源性低于95%即為新的模式基因(http://www.biols.susx.ac.uk/Home/Nei 1-Crickmore/Bt/index, html)。目前，研究者已從世界各地的昆蟲(chóng)、土壤和植物體表等樣本中分離到數(shù)萬(wàn)株Bt菌株，并從中挖掘出從Cryl~Cry73類(lèi)殺蟲(chóng)晶體蛋白，但是對(duì)昆蟲(chóng)高毒力Bt菌株和Cry蛋白卻鮮有報(bào)道。
[0008]Bt及其殺蟲(chóng)晶體蛋白的應(yīng)用主要集中在三個(gè)方面:1)直接工業(yè)化生產(chǎn)；2)構(gòu)建工程菌，進(jìn)而轉(zhuǎn)化生產(chǎn)；3)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)植物。目前商業(yè)化應(yīng)用的Cry蛋白主要有CrylAa、CryIAbλ CryIAcΛ CrylC、CrylD、CrylE、CrylF、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry3A、Cry3B, Cry8A, Cry8B和Cry34/Cry35。Bt及其殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)植物害蟲(chóng)、衛(wèi)生害蟲(chóng)的綠色防治做出了巨大貢獻(xiàn)。
[0009]然而，Cry毒素蛋白的殺蟲(chóng)譜僅局限于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等特定靶標(biāo)昆蟲(chóng)，對(duì)于半翅目刺吸式口器的蚜蟲(chóng)、飛虱、葉蟬等昆蟲(chóng)只有極少有效Cry毒素的報(bào)道。同時(shí)，來(lái)源于不同物種的基因，在異種受體中的表達(dá)效率會(huì)受到影響，殺蟲(chóng)晶體蛋白基因在植物中的表達(dá)量、毒力與野生菌株存在顯著差異。為避免抗性昆蟲(chóng)所造成的損失，提高水稻對(duì)褐飛虱的抗性，尋找新的高毒力基因資源是解決這一問(wèn)題的有效途徑，對(duì)我國(guó)的生物防治有著十分重要的意義。
[0010]2009年本發(fā)明 人從四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的新Bt菌株BtMC28。通過(guò)對(duì)BtMC28菌株的毒力測(cè)試表明，BtMC28對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)、雙翅目害蟲(chóng)等，均具有極聞的毒力。
[0011]后期通過(guò)擴(kuò)大測(cè)試害蟲(chóng)種類(lèi)，發(fā)現(xiàn)該菌株純蛋白對(duì)褐飛虱具有很強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，在48h的殺蟲(chóng)校正死亡率為95%。通過(guò)對(duì)BtMC28菌株所有Cry蛋白生物活性測(cè)定，僅殺蟲(chóng)晶體蛋白Cry30Fal (GenBank:ACI22625.1)蛋白對(duì)褐飛虱具有殺蟲(chóng)活性(48h，LC50為I μ Μ)。在相同背景下，其殺蟲(chóng)活性相較Powell等所報(bào)道的雪花蓮凝集素(GNA)更高(LC5tl為4 μ Μ)，是目前國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)對(duì)褐飛虱具有特異殺蟲(chóng)活性的Cry類(lèi)蛋白。該蛋白可用于制備主要針對(duì)褐飛虱以及其他蟲(chóng)害的廣譜Bt殺蟲(chóng)劑，將其基因序列轉(zhuǎn)化水稻，使其具備相應(yīng)的抗蟲(chóng)活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種在水稻中高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fal的方法。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種編碼Bt蛋白Cry30Fal的基因，即Cry30Fal基因，其核苷酸序列為:
[0014]i) Seq ID N0.1 ;或
[0015]ii)Seq ID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0016]iii)在嚴(yán)格條件下與Seq ID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0017]所述嚴(yán)格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0018]本發(fā)明還提供含有Cry30Fal基因的載體、宿主細(xì)胞和工程菌。
[0019]本發(fā)明還提供Cry30Fal基因或含有該基因的載體在制備轉(zhuǎn)基因植物(如水稻)中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增Cry30Fal基因的特異性引物對(duì)，包括正向引物F5’ -GCGCATATGATGAAGCCGTACCAGAGCGAGAAT-3’ 和反向引物 R5’ -CGGAATTCTTAGTTCACTGGACAAGCAAACGCA-3，。
[0021]本發(fā)明還提供一種在水稻中高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fal的方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有Cry30Fal基因的載體轉(zhuǎn)入水稻(如水稻品種蜀恢818)愈傷組織中，轉(zhuǎn)化的材料經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fal的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
[0022]優(yōu)選地，所述載體為植物雙元表達(dá)載體。
[0023]更優(yōu)選地，所述載體的出發(fā)載體為P⑶MAR-Hyg。
[0024]Cry30Fal蛋白的氨基酸組成如表1所示。
[0025]表lCry30Fal蛋白的氨基酸組成
[0026]
【權(quán)利要求】
1.編碼Bt蛋白Cry30Fal的基因，其特征在于，其核苷酸序列為:
i)Seq ID N0.1 ;或 ii)SeqID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 iii)在嚴(yán)格條件下與SeqID N0.1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含0.1%SDS的0.1 X SSPE或含0.1%SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的載體。
3.含有權(quán)利要求1所述基因的工程菌。
4.權(quán)利要求1所述基因或權(quán)利要求2所述載體在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物為水稻。
6.用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述基因的特異性引物對(duì)，其特征在于，包括正向引物F5’-GCGCATATGATGAAGCCGTACCAGAGCGAGAAT-3’ 和反向引物 R5’ -CGGAATTCTTAGTTCACTGGACAAGCAAACGCA-3，。
7.—種在水稻中高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fal的方法，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將權(quán)利要求2所述的載體轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，轉(zhuǎn)化的材料經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)-篩選-分化-生根-轉(zhuǎn)基因苗的鍛煉和移栽，篩選高效表達(dá)Bt蛋白Cry30Fal的轉(zhuǎn)基因水稻植株。
8.根據(jù)權(quán)利要 求7所述的方法，其特征在于，所述載體為植物雙元表達(dá)載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述載體的出發(fā)載體為pCDMAR-Hyg。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用的水稻品種為蜀恢818。
【文檔編號(hào)】C12N15/32GK103937816SQ201410119119
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】朱軍, 張欽斌, 李平, 鄧其明, 李雙成, 劉懷年, 王世全, 王玲霞, 鄭愛(ài)萍 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)