專利名稱：一種水稻庫(kù)源新基因(ss2)的緊密連鎖分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種控制水稻庫(kù)(每穗粒數(shù))源(劍葉大小)新基因SS2的緊密連鎖分子標(biāo)記，屬于水稻超高產(chǎn)育種和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，適用于在水稻高產(chǎn)育種中引入新的產(chǎn)量相關(guān)基因SS2，并利用緊密連鎖分子標(biāo)記對(duì)該基因進(jìn)行水稻庫(kù)源相關(guān)性狀的輔助選擇育種。
背景技術(shù)：
從我國(guó)水稻育種歷史分析，源、庫(kù)、流三者的平衡對(duì)水稻產(chǎn)量潛力的提高發(fā)揮了重要作用。無(wú)論20世紀(jì)50年代的矮化育種，70年代的雜交水稻育種，還是近年的超級(jí)稻育種，每一次水稻產(chǎn)量的大幅度提高無(wú)不伴隨著源、庫(kù)、流狀況的改善及新型源庫(kù)平衡關(guān)系的建立?，F(xiàn)已明確，水稻產(chǎn)量的高低主要取決于源、庫(kù)、流三者的強(qiáng)弱及其相互間的協(xié)調(diào)程度， 其中穗部性狀特別是每穗總粒數(shù)是光合產(chǎn)物積累的主要庫(kù)性狀，倒三葉尤其是劍葉是光合產(chǎn)物生產(chǎn)的主要源性狀，穗莖中的大維管束數(shù)量通常被作為從葉片向穗部輸送同化物的一個(gè)“流”性狀。劍葉是穗部最重要的同化產(chǎn)物來(lái)源，其大小與每穗粒數(shù)、小穗育性、高容重籽粒、千粒重及籽粒產(chǎn)量密切相關(guān)。在不同條件下，源、庫(kù)、流三者之一都有可能成為作物產(chǎn)量的限制因素，因而單方面強(qiáng)調(diào)源或庫(kù)對(duì)產(chǎn)量的重要性都是不全面的。要獲得高產(chǎn)，不僅源、 庫(kù)要協(xié)調(diào)，還要考慮到流(運(yùn)轉(zhuǎn))的協(xié)調(diào)，即源要足、庫(kù)要大和運(yùn)轉(zhuǎn)通暢。由此可見(jiàn)，源、庫(kù)、 流三者之間是相互促進(jìn)、相互影響、相互制約的關(guān)系。目前一般采用源/庫(kù)、源/流和流/ 庫(kù)“三比”來(lái)評(píng)價(jià)源、庫(kù)、流三者間的平衡關(guān)系，進(jìn)而分析“三比”變化對(duì)水稻產(chǎn)量及生理的影響，從而找出水稻高產(chǎn)所需的最佳“三比”值。盡管人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到充足而且彼此協(xié)調(diào)的源庫(kù)關(guān)系是水稻高產(chǎn)理想株型和超高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)，但至今對(duì)庫(kù)源性狀的遺傳特別是兩者間的分子調(diào)控機(jī)制還缺少研究。因此，鑒定影響庫(kù)源性狀的重要基因，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇培育庫(kù)源協(xié)調(diào)的高產(chǎn)品種進(jìn)而解析庫(kù)源性狀調(diào)控的分子機(jī)制將具有重要意義。數(shù)量性狀基因座(QTL)定位的應(yīng)用極大地促進(jìn)了對(duì)包括產(chǎn)量在內(nèi)的許多重要復(fù)雜性狀遺傳機(jī)理的認(rèn)識(shí)。鑒定影響庫(kù)、源和流及產(chǎn)量性狀的QTL有助于增加對(duì)這些復(fù)雜性狀相互關(guān)系的理解，從而達(dá)到通過(guò)遺傳操縱改良這些性狀并最終提高產(chǎn)量的目的。一些學(xué)者利用不同的作圖群體檢測(cè)到影響源相關(guān)性狀(劍葉、倒二葉和倒三葉)的QTL與庫(kù)相關(guān)性狀，諸如每穗總粒數(shù)，千粒重及單株產(chǎn)量的QTL定位在相同或相近的區(qū)域，認(rèn)為一因多效或緊密連鎖是籽粒產(chǎn)量與庫(kù)、源之間相關(guān)的遺傳基礎(chǔ)(Erik等.2002 ；Cui等.2003 ； Ishimaru 2003 ；Thomson 等.2003 ；Yoon 等.2006)。Li 等(1997 ； 1998)在美國(guó)德州生態(tài)條件下種植利用粳稻Lemont與秈稻特青培育的早世代重組自交系群體，研究了水稻劍葉和倒二葉與庫(kù)容量之間的遺傳關(guān)系，發(fā)現(xiàn)作為主要庫(kù)容量的每穗粒重有50%的變異是由劍葉大小引起，并利用分子標(biāo)記鑒定出位于第3染色體RG910a-RG418區(qū)間同時(shí)影響庫(kù)(每穗粒數(shù)和每穗粒重)、源(劍葉和倒二葉的葉面積和葉長(zhǎng)度)性狀的1個(gè)主效QTL (QL13b)，該基因座特青等位基因增加葉長(zhǎng)和葉面積同時(shí)增加每穗粒數(shù)和每穗粒重，被認(rèn)為是一個(gè)影響源庫(kù)性狀的重要主效QTL，并認(rèn)為一因多效是控制源庫(kù)性狀的遺傳基礎(chǔ)。Mei等Q005)利用Lemont/特青BC1F1群體，在第3染色體的G249_RG418b區(qū)間檢測(cè)到影響劍葉長(zhǎng)度的主效 QTL，貢獻(xiàn)率為8. 1%，其增加劍葉長(zhǎng)度的等位基因也同樣來(lái)自特青。申請(qǐng)人進(jìn)一步在北京和海南兩個(gè)不同的生態(tài)區(qū)下利用Lemont與特青培育的雙向?qū)胂等后w及在北京環(huán)境下利用Lemont/特青F13重組自交系群體，在第3染色體的RM227-RM85區(qū)間均檢測(cè)到影響每穗粒數(shù)和劍葉長(zhǎng)度的主效QTL，該QTL增加葉長(zhǎng)和每穗粒數(shù)的等位基因均來(lái)自親本特青(未發(fā)表)。經(jīng)比較作圖，與該QTL緊密連鎖的RM227和RM85正好落在RG910a_RG418區(qū)間。因此，可以推斷該QTL與Li等(1998)定位到影響源庫(kù)性狀的QLUb位于同一染色體區(qū)間。由此表明，RM227-RM85區(qū)間確實(shí)存在一個(gè)在不同的生態(tài)條件下穩(wěn)定表達(dá)的影響源庫(kù)性狀的基因，暫且將該基因命名為SS2 (Source-sink 2)。水稻庫(kù)源性狀是水稻產(chǎn)量形成的農(nóng)學(xué)基礎(chǔ)。庫(kù)源相關(guān)性狀(如劍葉長(zhǎng)、寬及葉面積，每穗粒數(shù)及粒重)的QTL定位研究表明，影響水稻庫(kù)源相關(guān)性狀的QTL大致分成3種類型，一是同時(shí)控制葉片源性狀和穗部庫(kù)性狀，二是只控制葉片源性狀，三是只控制穗部庫(kù)性狀。在這3種類型中，只有第一種基因，對(duì)水稻庫(kù)源協(xié)調(diào)起關(guān)鍵作用，是通過(guò)庫(kù)源協(xié)調(diào)培育超高產(chǎn)品種的重要遺傳基礎(chǔ)。雖然葉片長(zhǎng)短和葉片大小等源性狀易于常規(guī)選擇，但常規(guī)選擇無(wú)法分辨影響源性狀的不同基因位點(diǎn)，而只有通過(guò)標(biāo)記輔助，有針對(duì)性地選擇影響庫(kù)源性狀的基因(即上述的第一類基因)，才能快速有效地選育庫(kù)源協(xié)調(diào)的超高產(chǎn)品種。因此， 鑒定和精細(xì)定位水稻庫(kù)源性狀的重要基因，尋找與其緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過(guò)標(biāo)記輔助選擇技術(shù)培育水稻超高產(chǎn)新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
(一)技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明針對(duì)上述研究背景，從Lemont背景的高代回交導(dǎo)入系中選擇出帶有影響源(劍葉葉長(zhǎng))、庫(kù)(每穗粒數(shù))性狀SS2的近等基因?qū)胂礕G306，其輪回親本背景恢復(fù)率為91. 1%，進(jìn)一步以Lemont作為輪回親本與GG306進(jìn)行3次回交，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇的方法篩選到目標(biāo)區(qū)段為SS2基因雜合導(dǎo)入、背景完全恢復(fù)為輪回親本Lemont的近等基因系，利用該近等基因系所構(gòu)建的F2次級(jí)分離群體為試材，篩選目標(biāo)染色體區(qū)段的交換單株， 從而構(gòu)建了一套亞區(qū)間的跨疊系，并結(jié)合表現(xiàn)型對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行高精確度的連鎖分析，將 SS2基因精細(xì)定位到一個(gè)1041Λ的區(qū)間內(nèi)；獲得與之緊密連鎖的基于PCR的分子標(biāo)記SL14， 借助該標(biāo)記可以有效篩選到帶有SS2基因的長(zhǎng)劍葉且每穗粒數(shù)多的個(gè)體，主要應(yīng)用于庫(kù)源充足且協(xié)調(diào)的水稻超產(chǎn)新品種的培育。( 二 )技術(shù)方案控制水稻庫(kù)源新基因緊密連鎖的分子標(biāo)記方法，其特征在于用兩對(duì)特異擴(kuò)增水稻位于第3染色體上控制水稻庫(kù)源新基因(SS2)的緊密連鎖分子標(biāo)記的引物SL14，其中正向引物序列為CTCATAATCGTTGCTACTCATC，反向引物序列為 CATGCAGACACGGAAATAC。共同擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)段為雜合導(dǎo)入的近等基因系(攜帶有一個(gè)包含SS2 的1041Λ雜合片段)自交所衍生的F2分離群體中各單株的基因組DNA，電泳分離出2種分子量大小的片段，其中與Lemont親本相同片段的分子量大小為18;3bp，與特青相同片段的分子量大小為166bp (

圖1)。如果SL14的引物擴(kuò)增后獲得與親本特青大小相同片段或者帶有雙親雜合片段的單株，那么這些單株帶有SS2高產(chǎn)等位基因，在性狀上表現(xiàn)為劍葉增長(zhǎng)且穗粒數(shù)增多，反之，則不帶有SS2高產(chǎn)等位基因，表現(xiàn)劍葉較短且穗粒數(shù)較少。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。其中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。(一 )控制水稻庫(kù)源新基因的初步定位1.供試材料以美國(guó)南部的優(yōu)質(zhì)粳稻品種Lemont和我國(guó)廣東的高產(chǎn)秈稻品種特青所構(gòu)建的雙向回交導(dǎo)入系為主要研究材料。其構(gòu)建過(guò)程如下將Lemont與特青配制雜種FnF1植株分別與雙親回交，分別形成Lemont和特青背景的雙向回交BC1F1群體，在雙向回交后代隨機(jī)選單株分別與各自的輪回親本進(jìn)行2-4次不等的連續(xù)回交并經(jīng)自交多代穩(wěn)定，最后分別獲得了 201個(gè)Lemont背景導(dǎo)入系(LT-ILs)和252個(gè)特青背景的導(dǎo)入系(TQ-ILs)。另一套材料是來(lái)自同一個(gè)雜交組合(Lemont/特青)的294個(gè)高世代重組自交系(RILs)。2. DNA提取、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳參考TemnyW!等(2000年)的DNA提取方法，對(duì)各株系的代表單株分別混合提取基因組DNA。根據(jù)參考圖譜，選取均勻分布于全基因組的142個(gè)雙親間有多態(tài)的SSR標(biāo)記，合成引物。以各個(gè)株系的基因組DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?PCR)反應(yīng)。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物通過(guò)8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，genefinder染色后，在凝膠成像系統(tǒng)下成像。 參考雙親的擴(kuò)增條帶，對(duì)后代株系的帶型進(jìn)行判別記錄。3.完備區(qū)間作圖分析根據(jù)后代株系的擴(kuò)增條帶所表示的基因型，將其對(duì)應(yīng)的庫(kù)(每穗粒數(shù))和源(劍葉長(zhǎng)度)相關(guān)性狀調(diào)查的結(jié)果作為表型值，輸入由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所王建康課題組所發(fā)展的完備區(qū)間作圖軟件(ICIMapping V3. 0，免費(fèi)軟件)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得與水稻庫(kù)源相關(guān)的候選區(qū)間及相關(guān)標(biāo)記。我們鑒定出1個(gè)在不同遺傳背景(特青背景導(dǎo)入系、Lemont背景導(dǎo)入系和重組自交系)和不同環(huán)境(北京和海南)下均能穩(wěn)定表達(dá)的同時(shí)影響庫(kù)源性狀的主效QTLdP 位于第3染色RM85標(biāo)記附近同時(shí)影響每穗粒數(shù)(庫(kù)性狀)和劍葉葉長(zhǎng)(源性狀)的主效 QTL(SS2)，該基因座上來(lái)自特青的等位基因增加劍葉葉長(zhǎng)的同時(shí)增加每穗粒數(shù)，一因多效是控制該庫(kù)源性狀的遺傳基礎(chǔ)。表1利用294個(gè)Lemont/特青重組自交系(RILs)、252個(gè)特青背景導(dǎo)入系 (TQ-ILs)和201個(gè)Lemont背景導(dǎo)入系(LT-ILs)定位影響劍葉葉長(zhǎng)(FLL，厘米)和每穗粒數(shù)(SNP，粒/穗)的主效QTL
權(quán)利要求
1.水稻庫(kù)源新基因(SS》緊密連鎖分子標(biāo)記方法，其特征在于以雜合近等基因系構(gòu)建的F2次級(jí)分離群體為試材，篩選目標(biāo)染色體區(qū)段的交換單株，從而構(gòu)建了一套覆蓋目標(biāo)區(qū)段的跨疊系，結(jié)合表現(xiàn)型對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行高精確度的連鎖分析，最終將SS2基因精細(xì)定位到104Kb的區(qū)間內(nèi)，獲得與庫(kù)源新基因(SS2)緊密連鎖的InDel分子標(biāo)記SL14。
2.按照權(quán)利1所獲得一種與水稻庫(kù)源新基因(SS》緊密連鎖分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于以劍葉長(zhǎng)品種特青導(dǎo)入短劍葉品種Lemont培育的雜合近等基因系的后代分離群體為對(duì)象，通過(guò)SL14標(biāo)記的帶型數(shù)據(jù)，輔助選擇由SS2基因控制的水稻庫(kù)(每穗粒數(shù))源(劍葉葉長(zhǎng))相關(guān)性狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻庫(kù)源新基因SS2的分子標(biāo)記方法，屬于水稻超高產(chǎn)育種和分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明實(shí)質(zhì)是根據(jù)連鎖分離規(guī)律，利用攜帶SS2雜合片段的近等基因系自交所構(gòu)建的F2次級(jí)分離群體為試材，構(gòu)建一套目標(biāo)區(qū)段的跨疊系，結(jié)合表現(xiàn)型對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行高精確度的連鎖分析，經(jīng)過(guò)兩年兩點(diǎn)的重復(fù)鑒定，最終將SS2精細(xì)定位到第3染色體上104Kb的區(qū)間內(nèi)，并獲得了與之緊密連鎖的基于PCR的分子標(biāo)記SL14。將本發(fā)明應(yīng)用于水稻超高產(chǎn)育種，能夠快速準(zhǔn)確的鑒定出同時(shí)影響庫(kù)(每穗粒數(shù))源(劍葉葉長(zhǎng))性狀的基因型個(gè)體，進(jìn)行育種材料的早世代選擇，大大加速水稻超高產(chǎn)分子育種的進(jìn)程。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102433334SQ20111041350
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者孫勇, 徐建龍, 王韻, 黎志康 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所