專利名稱：畢赤酵母制備人白細(xì)胞介素32β的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種畢赤酵母制備重組人白細(xì)胞介素32β的方法及其重組工程菌。 屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素32 (human interleukin 32，hIL-32)是近年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為促炎癥性細(xì)胞因子的特點(diǎn)，在多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病呈高表達(dá)狀態(tài)，并與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)(Dinarello CA, Kim SH. (2006)IL-32, a novel cytokine with a possible role in disease. Ann Rheum Dis,65(Suppl III) 61-64)。hIL-32的產(chǎn)生細(xì)胞有多種，由IL-2活化的NK細(xì)胞或用絲裂原激活的T細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-32，用IFN-Y刺激單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞也可誘導(dǎo)IL-32的產(chǎn)生。人IL-32的基因定位于16號(hào)染色體(16pl3. 3)上，含有8個(gè)外顯子，可編碼表達(dá) IL-32 蛋白的 6 種剪接變異體IL-32 α、IL-32 β、IL-32 γ、IL-32 δ、IL-32 ε 和 IL-32 ζ， 目前已報(bào)告了蛋白結(jié)構(gòu)的有IL-32 α、IL-32 β、IL-32 γ和IL-32 δ，組成這4種剪接變異體肽鏈的氨基酸殘基數(shù)分別為131、188、234和178個(gè)。通過Northern blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在人的脾、胸腺、白細(xì)胞、小腸、結(jié)腸、前列腺、卵巢、睪丸均有IL-32的mRNA表達(dá)(Goda C5Kanaji T,Kanaji S, et al. (2006)Involvement of IL_32in activation-induced cell death in T cells. Int Immunol,18(2) :233-240)。近年已發(fā)現(xiàn)，人IL-32的表達(dá)與多種炎癥性疾病及自身免疫性疾病相關(guān)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腸炎、結(jié)核病、甲型流感、骨髓增生異常綜合征和慢性骨髓單核細(xì)胞白血球過多癥、人體免疫缺陷癥等疾病患者中，都檢測(cè)到IL-32mRNA的表達(dá)水平升高。鑒于hIL-32的多種生物學(xué)效應(yīng)，尤其是其生物學(xué)作用與炎癥性疾病及自身免疫病性疾病的相關(guān)性，并參與細(xì)胞凋亡過程的作用，提示hIL-32及其受體有可能成為炎癥性疾病及自身免疫病性疾病的治療靶點(diǎn)，而針對(duì)hIL-32或其受體的相關(guān)生物工程制品有可能成為開發(fā)抗炎癥藥物治療自身免疫病性疾病藥物的新方向，由此顯現(xiàn)出IL-32潛在的臨床應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用酵母表達(dá)重組人白細(xì)胞介素32 β (hIL_32i3)的制備方法及其酵母工程菌。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下(1)本發(fā)明的第一方面，提供一種hIL_32i3的重組真核表達(dá)載體，該載體是將 pPIC9K(Invitrogen公司)與本發(fā)明所述的hIL_32 β編碼基因(SEQ ID No 1)經(jīng)過重組而獲得，該重組真核表達(dá)載體為PPIC9K-hIL-32i3，如圖1所示。(2)本發(fā)明的第二方面，提供一種表達(dá)人IL-32 β的重組酵母工程菌GS115/ hIL-32i3，該工程菌是畢赤酵母GS115anvitrogen公司)被本發(fā)明所述的重組真核表達(dá)載體pPIC9K-hIL-32 β轉(zhuǎn)化而獲得，而且pPIC9K中的信號(hào)肽基因序列與hIL_32 β的編碼基因均已整合到該工程菌的基因組中，因此該工程菌可分泌性表達(dá)hIL-32 β至培養(yǎng)液中。(3)本發(fā)明的第三方面，提供一種制備重組hIL-32i3的方法，該方法包括以下步驟a)培養(yǎng)上述重組酵母工程菌，于培養(yǎng)液中添加0.5 (ν/ν)的甲醇為誘導(dǎo)劑， 誘導(dǎo)重組酵母工程菌表達(dá)重組hIL-32 β ；b)離心培養(yǎng)液去除菌體和不溶物，收集培養(yǎng)液上清經(jīng)過超濾濃縮和透析除鹽處理；c)除鹽后的培養(yǎng)上清用弱陰離子交換層析柱分離純化培養(yǎng)液中的重組 hIL-32 β，收集含有重組hIL-32 β的洗脫液；d)將含有重組hIL-32 β的洗脫液用分子篩層析方法進(jìn)一步純化；e)用 SDS-PAGE 和 ^festern blotting 方法分析鑒定純化的重組 hIL_32 β。


圖1為重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-hIL_32i3的構(gòu)建圖譜圖2為人IL-32 β編碼基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-hIL_32 β的雙酶切鑒定結(jié)果
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法，這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的測(cè)定均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；所用的培養(yǎng)基如無(wú)特別說(shuō)明均按畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)anvitrogen公司)的配方進(jìn)行配制。實(shí)施例一、人IL_32i3編碼基因的克隆1.設(shè)計(jì)和合成PCR引物根據(jù)GenBank中的人IL-32基因序列和pPIC9K載體的多克隆位點(diǎn)序列，用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物如下上游引物5，-CGGAATTCATGTGCTTCCCGAAGGTCC-3，下游引物5，-ATTTTGCGGCCGCTCATTTTGAGGATTGGGGTTC-3，；在上游引物中加入了限制性內(nèi)切酶EcoR I識(shí)別位點(diǎn)(GAATTC)，下游引物中加入了 Not I位點(diǎn)(GCGGCCGC)，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約560bp。2.人IL-32 β編碼基因的克隆用RNA提取試劑Trizol (BBI公司)按說(shuō)明書操作，從健康中國(guó)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取細(xì)胞總RNA ；取提取的總RNA 1 μ L作為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaKa公司) 按說(shuō)明書操作，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到IL-32 β前體的cDNA ；反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，取反應(yīng)液5 μ L作為模板，用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增IL-32i3的編碼基因，反應(yīng)條件如下94°C 2min, 94°C 30s —61°C 30s-72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示；用EZ-10柱式DNA回收試劑(BBI公司)回收純化約560bp的目的基因片段；將純化的目的基因片段于克隆載體PUCm-T (BBI公司)相連，構(gòu)建為重組質(zhì)粒并命名為pUCm-32 ；將重組質(zhì)粒pUCm-32轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，接種于含IPTG和 X-gaL的氨芐青霉素LB培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)16h，挑取陽(yáng)性菌落接種液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID No :1所示；測(cè)序結(jié)果經(jīng)Oligo 7軟件分析，連接到重組質(zhì)粒pUCm-32中的目的基因序列與GenBank中的人IL-32 β的cDNA序列一致。實(shí)施例二、構(gòu)建表達(dá)人IL_32i3的重組真核表達(dá)載體取質(zhì)粒pUCm-32和載體pPIC9K (Invitrogen公司)分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I和 Not I進(jìn)行雙酶切，回收約560bp的目的基因片段和載體PPIC9K的大片段，用T4DNA連接酶 (BBI公司)于16°C水浴連接16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取陽(yáng)性菌落接種液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，提取重組真核表達(dá)質(zhì)粒并命名為pPICTK-hIL-32 0 ；用EcoR I和Not I對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_hIL_32 β 進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)進(jìn)行測(cè)序鑒定，雙酶切鑒定結(jié)果如圖3所示，酶切出的大片段和小片段分別與載體PPIC9K和目的基因的大小相符合，測(cè)序結(jié)果證實(shí)pPIC9K-hIL-32 β中的人 IL-32 β編碼基因序列與pUCm-32中的完全一致。實(shí)施例三、重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GS115及其高拷貝重組工程菌的篩選提取經(jīng)測(cè)序鑒定的PPIC9K-hIL-32i3，用限制性內(nèi)切酶Ml I酶切后，用0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳分離并回收線性化的pPIC9K-hIL-32 β ；將線性化的pPIC9K_hIL_32 β與酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混合后，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)anvitrogen公司)的方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于不含His的MD培養(yǎng)板，30°C培養(yǎng)2 3天，挑選MD平板上生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌落接種于含0. 5mg/mL G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，挑選生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌落接種于含lmg/mL G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，如此重復(fù)培養(yǎng)并依次增加 G418濃度至％ig/mL，從含％ig/mL G418的YPD平板篩選得到高拷貝整合的畢赤酵母重組工程菌 GS115/hIL-32 3。實(shí)施例四、重組人IL-32 β的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及分析將重組工程菌GS115/hIL-32 0接種BMGY培養(yǎng)基，于30°C、250rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)至菌液0D600為1 3時(shí)，轉(zhuǎn)換為BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h加入終濃度為1 %的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)培養(yǎng)96h，離心收集培養(yǎng)上清，先用SDS-PAGE檢測(cè)培養(yǎng)上清中hIL-32i3的表達(dá)情況，然后用羊抗人IL-32多克隆抗體(R&D公司)進(jìn)行Western blotting鑒定表達(dá)的hIL-32 β。將培養(yǎng)上清先用截流分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再用 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G_75凝膠過濾層析純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)和Wfestern blotting鑒定，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化的重組hIL_32 β為單一蛋白條帶，其分子量為22kDa，Wfestern blotting結(jié)果顯示單一反應(yīng)條帶。
權(quán)利要求
1.一種人白細(xì)胞介素32β (hIL-32i3)的重組真核表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組真核表達(dá)載體中插入了 hIL-32i3的編碼基因。
2.如權(quán)利要求1所述的重組真核表達(dá)載體中的hIL-32i3的編碼基因，其DNA的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ IDNO :1。
3.如權(quán)利要求1所述的重組真核表達(dá)載體中的hIL-32i3的編碼基因，其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID NO :2。
4.一種重組畢赤酵母工程菌，其特征在于，所述的重組畢赤酵母的染色體中整合有權(quán)利要求1所述的hIL-32i3的編碼基因，并且分泌表達(dá)重組hIL-32i3至培養(yǎng)液中。
5.一種制備重組hIL-32i3的方法，其特征在于，包括步驟(1)用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌；(2)在培養(yǎng)液中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組畢赤酵母工程菌分泌表達(dá)重組 hIL-32 3 ；(3)從培養(yǎng)液中分離純化出重組畢赤酵母分泌表達(dá)的重組hIL-32β。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)所用的培養(yǎng)液為BMGY培養(yǎng)液和 BMMY培養(yǎng)液；步驟(2)所用的誘導(dǎo)劑為甲醇，添加甲醇的終濃度為培養(yǎng)液體積的0. 5 1%; 步驟(3)所用的分離純化重組hIL-32i3的方法為先用弱陰離子型離子交換層析分離培養(yǎng)液中的重組hIL-32 β，再用凝膠過濾層析得到純化的重組hIL-32 β。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人白細(xì)胞介素32β的制備方法及表達(dá)重組hIL-32β的畢赤酵母工程菌。本發(fā)明的具體制備方法包括以下步驟1)人工合成引物；2)從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR得到hIL-32β的編碼基因；3)構(gòu)建含有hIL-32β編碼基因的重組真核表達(dá)載體，融合于畢赤酵母表達(dá)調(diào)控元件獲得重組畢赤酵母工程菌；4)培養(yǎng)重組畢赤酵母工程菌，于培養(yǎng)液添加甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母工程菌表達(dá)重組hIL-32β；5)采用離子交換層析和分子篩層析從培養(yǎng)液上清純化重組hIL-32β。本發(fā)明構(gòu)建的重組畢赤酵母工程菌可進(jìn)行高密度培養(yǎng)并且分泌型表達(dá)重組hIL-32β，適用于工業(yè)化制備重組人白細(xì)胞介素32β。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102392043SQ201110413360
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者吳靜, 來(lái)麗麗, 鄔敏辰, 郁心, 鄭海軍, 陳偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)