Oct4在調控IL-31基因表達中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學及基因工程領域，具體涉及0ct4在調控IL-31基因表達中 的應用。
【背景技術】
[0002] 白細胞介素 31(Interleukin 31，IL-31)是由Dillon等于2004年發(fā)現(xiàn)的具有4個螺 旋結構的多肽鏈細胞因子，歸類于白細胞介素 6細胞因子家族，主要由活化的CD4+Th2細胞產 生。人的IL-31基因位于12q24.31，含有904bp，開放閱讀框為495bp，編碼一條由164個氨基 酸殘基組成的多肽鏈，成熟的IL-31蛋白質含有141個氨基酸。IL-31通過與IL-31RA和0SMRi3 兩個亞基組成的異源二聚體復合物結合，從而激活JAK-STAT、MAPK、PI3K/AKT三條信號通 路，發(fā)揮生物學功能。IL-31的受體主要分布于上皮細胞、淋巴細胞、支氣管和皮膚等組織 中，所以目前關于IL-31的研究主要集中于IL-31在皮膚炎癥反應中的作用。
[0003] 0ct4又稱為0ct3或0ct3/4,屬于P0U轉錄因子家族中的成員，由Pou5fl基因編碼， 主要在胚胎干細胞及生殖干細胞中表達，維持胚胎干細胞的自我更新和多分化潛能。人 0ct4基因位于第6號染色體上(6p21.31)，含有16.41^)。0(^4具有不同的亞型（Isoforms)，其 中Isoform 1是具有功能的0ct4亞型，具有5個外顯子，4個內含子，翻譯的蛋白質含有一個 保守的DNA結合結構域(P0U結合域），能與含八聚體基序(Octamer motif)的DNA結合從而調 控下游靶基因的轉錄。目前關于0ct4的靶基因研究的比較多，大多數(shù)是多分化潛能有關的 基因，如:Nanog和Sox2等。在細胞分化的過程中0ct4的表達逐漸下調，在完全分化的細胞中 基本檢測不到0ct4的表達，然而最近發(fā)現(xiàn)很多成體干細胞也表達0ct4。間充質干細胞 (Mesenchymal stem cel Is，MSCs)是成體干細胞中的一種，來源于多種組織，如:骨髓、臍帶 和脂肪組織等。最近很多文章報道0ct4也能促進MSCs的自我更新和多向分化潛能，但其分 子調控機制目前還不清楚。在MSCs中0ct4可以直接調控其靶基因 MBD6、Dnmtl和CD49f等的 表達，從而促進MSCs的自我更新和多向分化潛能。但0ct4是否對IL-31基因表達起調控作用 目前還不清楚。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供0ct4在調控IL-31基因表達 中的應用。
[0005] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):0ct4在調控IL-31基因表達中的應用，該技 術方案的提出是基于本發(fā)明發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)轉錄因子0ct4在MSCs內對IL-31表達有調節(jié)作 用。
[0006] 所述的IL-31基因的核苷酸序列如下所示：
[0007] ATGGCCTCTCACTCAGGCCCCTCGACGTCTGTGCTCTTTCTGTTCTGCTGCCTGGGAGGCTGGCTGGCCTCCCACAC GTTGCCCGTCCGTTTACTACGACCAAGTGATGATGTACAGAAAATAGTCGAGGAATTACAGTCCCTCTCGAAGATGC TTTTGAAAGATGTGGAGGAAGAGAAGGGCGTGCTCGTGTCCCAGAATTACACGCTGCCGTGTCTCAGCCCTGACGCC CAGCCGCCAAACAACATCCACAGCCCAGCCATCCGGGCATATCTCAAGACAATCAGACAGCTAGACAACAAATCTGT TATTGATGAGATCATAGAGCACCTCGACAAACTCATATTTCAAGATGCACCAGAAACAAACATTTCTGTGCCAACAG ACACCCATGAATGTAAACGCTTCATCCTGACTATTTCTCAACAGTTTTCAGAGTGCATGGACCTCGCACTAAAATCA TTGACCTCTGGAGCCCAACAGGCCACCACTTAA〇
[0008] 所述的0ct4在調控IL-31基因表達中的應用，是0ct4蛋白能夠與IL-31基因的啟動 子特異性結合，并能夠活化IL-31基因的轉錄。
[0009] 所述調控為正調控。
[0010]從而，所述的0ct4在調控IL-31基因表達中的應用，是將0ct4蛋白或是能表達0ct4 的核酸序列制備成活化IL-31基因轉錄的藥物。
[0011] 所述的0ct4在調控IL-31基因表達中的應用，是將0ct4蛋白或是能表達0ct4的核 酸序列制備成治療皮膚炎癥的藥物。
[0012] 所述的核酸序列為DNA序列。
[0013] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果:本發(fā)明是本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)轉錄因 子0ct4在MSCs內對其新靶基因 IL-31表達有調節(jié)作用而提出的。本發(fā)明采用染色質免疫共 沉淀和雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)方法證明了在MSCs內轉錄因子0ct4能夠與IL-31基因的啟 動子特異性結合，并能夠活化IL-31基因的轉錄。本發(fā)明揭示了轉錄因子0ct4對其新靶基因 IL-31表達的調控機制，并為將0ct4和IL-31應用于皮膚炎癥等疾病的治療中奠定必要基 礎。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明實施例1中將含有0ct4、sh0ct4和空質粒的慢病毒分別感染UC-MSCs 后采用RT-PCR方法確認IL-31表達的結果圖。
[0015]圖2是本發(fā)明實施例2中采用CHIP(染色質免疫共沉淀)方法證實在不同代數(shù)的UC-MSCs中，0c t4與IL-31基因的啟動子DNA結合的結果圖；其中，*P〈0.01相對于各自的對照抗 體;P3、P6、P9分別代表UC-MSCs培養(yǎng)傳代至第3代、第6代、第9代。
[0016]圖3是本發(fā)明實施例3中采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測0ct4在UC-MSCs中對 IL-31基因表達調控作用的結果圖；其中，*P〈0.01相對于各自的空質粒的對照。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但不用來限制本發(fā)明的范 圍。若未特別指出，實施例均參照常規(guī)實驗條件，或者參照試劑盒制造廠商的說明書進行。 實施例中所用到的工程菌、細胞株均為商業(yè)化的菌株或細胞株。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制 備按照《分子克隆》進行制備。
[0018] 實施例1采用RT-PCR方法確認轉錄因子0ct4對IL-31基因表達的影響。
[0019] (l)0ct4和sh0ct4慢病毒表達載體的構建。
[0020] l)0ct4基因引物的設計。
[0021]用Primer 5.0軟件設計擴增0ct4基因開放閱讀框的引物，引物兩端酶切位點分別 為Xhol和Ncol，引物由上海生工生物有限公司合成，引物的序列如下：
[0022] 0ct4正向引物：5 ' -CCGCTCGAGAGGATGGCGGGACACCTGGCTT-3 '
[0023] 0ct4反向引物：5'-CATGCCATGGAAGGGCAGGCACCTCAGTTTG-3'。
[0024] 2)擴增 0ct4 基因。
[0025]以人胚胎干細胞的cDNA(購自上海斯丹賽生物技術有限公司）為模板擴增0ct4基 因。
[0026] PCR擴增的反應體系如下：
[0027]
[0028] PCR擴增的反應條件如下：
[0029]
[0030] 3)0ct4基因的回收。
[0031 ] 將上述PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并用Gel Extraction Kit(Omega)對PCR 產物回收，實驗步驟對試劑盒說明書略有改動，步驟如下：
[0032] A、用手術刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂糖膠，盡量切除DNA片段周圍多余的瓊 脂糖膠以減少凝膠體積。
[0033] B、將凝膠塊置于1.5ml微量離心管中，加入與凝膠等體積的Binding buffer( X p2)。將混合物置于50-55 °C，7min，直到凝膠完全溶解。
[0034] C、將HiBind DNA離心柱置于隨附的2ml收集管中，將700μ1 DNA/瓊脂糖溶液加至 HiBind DNA離心柱，室溫下，10，000 X g離心lmin。
[0035] D、棄去液體，將HiBind DNA離心柱重新放回相同的收集管。向HiBind DNA離心柱 中加入300μ1 Binding buffer(Xp2)，室溫下，10,000Xg離心lmin，洗HiBind DNA離心柱。 棄去流出液并重新使用收集管。
[0036] E、加入700μ1無水乙醇稀釋的洗滌緩沖液洗滌HiBind DNA離心柱。室溫下10,000 X g離心 lmin〇
[0037] F、棄去液體并最大轉速空柱離心2min以干燥離心柱基膜。
[0038] G、將HiBind DNA離心柱置于干凈的1.5ml離心管。向離心柱基膜中間滴加 15-30μ1 洗脫緩沖液，室溫放置lmin后以13，000g離心lmin洗脫DNA。
[0039] 4)0ct4基因表達載體的構建。
[0040] 將回收的0c t4DNA片段和pGL3-Bas i c真核表達載體(Promega公司）經過Xho I和Nco I雙酶切處理，用T4DNA連接酶將雙酶切后的0ct4DNA片段克隆至經雙酶切的pGL3-Basic真 核表達載體中，然后轉染大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，使用正向引物和反向引物對克隆進行 篩選，將篩選得到的陽性克隆送去測序，DNA測序表明序列正確，命名為pGL3-〇ct4。
[0041 ] 5)0ct4慢病毒質粒的構建。
[0042] 使用Xhol單酶切pGL3-〇ct4及慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl (購買于漢恒生物 科技有限公司），使用T4DNA連接酶將經過Xhol單酶切后的0ct4DNA片段克隆入Xhol單酶切 線性化慢病毒轉移質粒pLVX-IRES-ZsGreenl，然后轉染大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，通過限 制性內切酶Ncol單酶切初步鑒定重組質粒，將鑒定正確的克隆送上海生工生物有限公司進 行DNA測序，命名為pLVX-0ct4-Z SGreenl。將測序正確的克隆大量提取質粒以備轉染用。
[0043] 6)sh0ct4慢病毒質粒的構建。
[0044] 在上海生工生物有限公司合成0ct4shRNA頸環(huán)結構對應的DNA序列（含有Xhol和 Ncol酶切位點），使用Xhol單酶切0ct4shRNA頸環(huán)結構對應的DNA序列及慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl，使用T4DNA連接酶將0ct4shRNA頸環(huán)結構對應的DN