羥脯氨酸免疫原、特異性抗體、檢測試劑及其制備方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，涉及羥脯氨酸免疫原、抗羥脯氨酸特異性抗體和羥脯 氨酸檢測試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 輕脯氨酸（Hydro Proline)，其結(jié)構(gòu)式如式(III)所示： 式(m)
羥脯氨酸是膠原蛋白所特有的組成成分，占其氨基酸總量的13%，與膠原的螺旋結(jié)構(gòu)形 成并能承受巨大壓力有關。羥脯氨酸經(jīng)脯氨酸羥化酶和羥脯氨酸脫氫酶在肝臟中降解，未 降解的羥脯氨酸由腎臟清除。羥脯氨酸大約有一半由尿排出體外。羥脯氨酸具有多種重 要的生理功能及獨特的生物活性，尿液中羥脯氨酸的濃度可代表骨吸收水平，嚴重骨折、燒 傷、重癥肺結(jié)核和肝硬化、Hodgkin' s病、甲狀腺功能亢進、羥脯氨酸血癥，氟骨癥都會導致 尿液中羥脯氨酸排泄量的增加，因而測定尿液中羥脯氨酸含量可反應膠原蛋白的代謝情況 及某些疾病對結(jié)締組織尤其是骨組織的損害程度，具有重要的臨床參考價值。此外，羥脯氨 酸可作為肺纖維化的特異性指標以及人體衰老檢測的參考指標等。
[0003] 目前，羥脯氨酸測定方法主要有：比色法、高效液相色譜法、氨基酸分析儀法、電泳 法等。但這些方法檢測靈敏度相對較低，步驟繁瑣，成本較高，不適合臨床大量尿液樣本的 檢測。目前市場上缺乏穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強的羥脯氨酸檢測試劑，尤其是質(zhì)量好 的自動化檢驗試劑。因此，研發(fā)一種質(zhì)量達到臨床檢驗要求、實用性強、性價比高，可應用于 全自動生化分析儀的羥脯氨酸檢測試劑勢在必行。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，采用全新的羥脯氨酸衍生物制備免疫原性 強的羥脯氨酸免疫原及其抗體，用該抗體制備的羥脯氨酸均相酶免疫檢測試劑可以實現(xiàn)在 全自動生化分析儀上對羥脯氨酸高通量、快速化的檢測。該檢測試劑具有操作簡便、靈敏度 高、特異性強、結(jié)果準確等優(yōu)點，還能有效降低羥脯氨酸檢測成本，有利于臨床推廣使用。
[0005] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種羥脯氨酸衍生物。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種免疫原性強的羥脯氨酸免疫原。
[0007] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種羥脯氨酸免疫原的制備方法。
[0008] 本發(fā)明的又一個目的在于提供使用本發(fā)明羥脯氨酸免疫原制備得到的特異性強 的抗羥脯氨酸特異性抗體。
[0009] 本發(fā)明的再一個目的在于提供一種羥脯氨酸檢測試劑。
[0010] 免疫原性與所合成的羥脯氨酸衍生物分子結(jié)構(gòu)及所選載體種類有關，現(xiàn)有技術(shù)中 羥脯氨酸免疫原的免疫原性較弱，所得到抗體的特異性、與羥脯氨酸的結(jié)合力，敏感度都不 如本發(fā)明。本發(fā)明的羥脯氨酸免疫原，免疫原性高，可以誘導得到高效價的抗羥脯氨酸特異 性抗體。該抗體特異性高，與羥脯氨酸的結(jié)合力強。由該抗體制備得到的羥脯氨酸檢測試 劑，可以快速、準確地確定樣品中的羥脯氨酸含量。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種羥脯氨酸免疫原，其結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
式（I) 式中，R為連接基團-(CH2)n-C00-，n是1至20之間的整數(shù)，優(yōu)選R為-(CH2) 5-C00-。
[0011] 載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽，優(yōu)選為血清蛋白、血藍蛋白和甲狀腺球蛋 白，更優(yōu)選為血清白蛋白，進一步優(yōu)選為牛血清白蛋白。
[0012] 當R為-(CH2)n-COO-時，該羥脯氨酸免疫原的合成途徑和方法如下： 1.羥脯氨酸衍生物的制備方法： 一種羥脯氨酸衍生物，其結(jié)構(gòu)式如式（II)所示：
式（II) 式中，R為連接基團-(CH2)n-COO-,n是1至20之間的整數(shù)。
[0013] 取n=5時，該羥脯氨酸衍生物的具體合成步驟如下：
本發(fā)明中，羥脯氨酸衍生物的制備過程中選用了 6-溴己酸甲酯為合成原料，故所得的 最終產(chǎn)物羥脯氨酸衍生物的連接基團R為-(CH2) 5-C00-。當n取其他數(shù)值時，選用其他6-溴 己酸甲酯的類似物，即直鏈的、通式為Br- (CH2) n-C00CH3的化合物參加反應時，合成方法完 全一致。
[0014] 2.羥脯氨酸免疫原的制備步驟： (1)將載體蛋白100~300mg溶解于25~75 ml 0? 2 M，pH 8. 5的磷酸緩沖液中； (2)將如下化學品加入到小燒杯中攪拌溶解：100~300 mg本發(fā)明合成的羥脯氨酸衍 生物、1.75~5. 25 ml二甲基甲酰胺、L 75~5. 25 ml乙醇、3. 5~10. 5 ml 10mM，pH 5.0 的磷酸鉀緩沖液、100~300 mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亞胺、25~75 mgN-羥 基硫代琥珀酰亞胺，將這些化學品在室溫下攪拌溶解反應30~60 min ; (3)將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2~8°C下攪拌過夜，得到抗原；將合 成好的抗原經(jīng)過透析進行純化，得到羥脯氨酸免疫原。
[0015] 本發(fā)明中當n取1~20范圍內(nèi)的其他整數(shù)時，用上述方法可以制備出如式（I )所 示的羥脯氨酸免疫原。載體仍為具有免疫原性的蛋白質(zhì)，可以是血清蛋白，血藍蛋白和甲狀 腺球蛋白。優(yōu)選的，載體為血清蛋白。更優(yōu)選的，載體為牛血清白蛋白。
[0016] 由于連接基團主要起小分子衍生物與載體的連接作用，免疫原性強弱與所合成的 羥脯氨酸衍生物分子結(jié)構(gòu)及所選載體種類有關，因此理論上n取1至20之間的任意整數(shù) 時，羥脯氨酸衍生物制備的羥脯氨酸免疫原無顯著差異，均具備強免疫原性，都能制備高效 價的特異性抗體。
[0017] -種抗羥脯氨酸特異性抗體，由上述的羥脯氨酸免疫原免疫動物后生產(chǎn)得到。
[0018] 所述的抗羥脯氨酸特異性抗體由上述制得的羥脯氨酸免疫原采用常規(guī)方法接種 實驗動物，加強免疫后取抗血清，具體步驟如下： (1)用PBS將上述合成的BSA-輕脯氨酸免疫原稀釋至0. 1~3. 0 mg/ml，得到抗原溶 液，然后用0. 5~5. 0 ml抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行注射； (2) 2~3周后，再用0. 5~5. 0 ml相同的抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑對上述實 驗動物注射一次，之后每隔四周注射一次，共計注射3~6次； (3)對上述實驗動物取血，分離純化得到效價為1:30000~1:50000的抗羥脯氨酸特異 性抗體。
[0019] 本發(fā)明的抗羥脯氨酸特異性抗體為完整的抗體分子，也包括保留與羥脯氨酸特異 性結(jié)合能力的抗體片段或抗體衍生物。
[0020] 本發(fā)明的抗體為采用單一的羥脯氨酸免疫原對動物加強免疫所獲得的多克隆抗 體，或者為免疫后經(jīng)體細胞雜交獲得的單克隆抗體；所述的實驗動物為兔、山羊、小鼠、綿 羊、豚鼠或馬的一種，優(yōu)選為兔。
[0021] 本發(fā)明提供一種羥脯氨酸檢測試劑，含有上述抗羥脯氨酸特異性抗體和指示試 劑。
[0022] 本發(fā)明指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑、發(fā)光試劑。優(yōu)選的，指 示試劑為酶試劑，由羥脯氨酸酶標偶聯(lián)物和酶的底物所組成。
[0023] 上述酶標偶聯(lián)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯(lián)物；上述酶的底物為 葡萄糖-6-磷酸。
[0024] 羥脯氨酸均相酶免疫檢測試劑在使用之前，為了避免指示試劑中的酶標偶聯(lián)物 和酶的底物發(fā)生反應，酶標偶聯(lián)物和酶的底物是不混合的且分開放置，所以將酶的底物與 上述抗羥脯氨酸特異性抗體混合在一起。因此，羥脯氨酸均相酶免疫檢測試劑包括兩類試 劑： (1) 試劑A由抗羥脯氨酸特異性抗體和均相酶底物混合而成，具體制備步驟如下： 1) 將2. 018~8. 072g (5. 625~22. 50 mM)氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)、 0.856 ~3.4228(5.625 ~22.50 禮)葡萄糖-6-磷酸（6-6-?)用0.5~2155 1111411=8.0 的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物； 2) 將制備的抗羥脯氨酸特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與均相酶底物的體積 比為 1:100 ~1:10000,優(yōu)選為 1:1500 ; (2) 試劑B由葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物與Tris緩沖液混合而成，制備方 法如下： 1) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PDH)溶液的制備： a. 稱取7. 5~22. 5 mg規(guī)格為100KU的G6PDH，室溫溶解于6~18mL含有72. 6 mg (0? 05 M) Tris、8mg MgCl2 (3. 3 mM)和 IOOmg NaCl 的溶液中，該溶液 pH=9. 0 ; b. 加入112. 5~337. 5 mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)，67. 5~202. 5 mg 葡萄糖-6-磷酸（G-6-P)以及0. 375~1. 125 mL卡必醇； c. 逐滴加入1~3 mL二甲基亞砜； 2) 羥脯氨酸衍生物的激活： a. 在無水狀態(tài)下稱取5~15 mg輕脯氨酸衍生物，溶解于300~900 ML DMF中； b. 使上述溶液溫度降到-2 ~ -8°C ; c?加入L 5~4. 5 ML三丁胺； d. 加入0. 75~2. 25 ML氯甲酸異丁酯； e. -2 ~ -8 °C攪拌30~60分鐘； 3) G6TOH與羥脯氨酸衍生物的連接： a. 將上述激活的羥脯氨酸衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6TOH溶液中； b. 2-8°C攪拌過夜； 4) 純化產(chǎn)物： 通過G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗 原偶聯(lián)物，于2-8°C下儲存。
[0025] 5)將制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到120mM、pH=8. 2的Tris 緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100~1:10000,優(yōu)選為1:1000。
[0026] 本發(fā)明的羥脯氨酸免疫原特異性強、免疫原性高，制備出的抗羥脯氨酸特異性抗 體特異性強、效價高，并且與常見的62種藥物無任何交叉反應；含有上述抗羥脯氨酸特異 性抗體的均相酶免疫檢測試劑可以方便、快速、準確地確定尿液等生物樣品中的羥脯氨酸 含量，并且可以在全自動生化分析儀上同時測定多個樣品，實現(xiàn)羥脯氨酸的高通量快速化 測定，準確度高，特異性強，精確度和檢測效率相比之前都有了較大的提高，同時實現(xiàn)了檢 測過程的全自動化，對檢測人員的要求不高，易于實現(xiàn)和推廣使用。
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