羥脯氨酸衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6TOH溶液中。
[0057] (2) 2-8°C攪拌過夜。
[0058] 純化產(chǎn)物： 通過G-25凝膠層析柱純化步驟3中的溶液，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8 °C下儲存。
[0059] 實施例六：羥脯氨酸均相酶免疫檢測試劑的制備 1.試劑A的制備：將4. 036g( 11. 25mM)氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)U. 71 Ig (11. 25mM)葡萄糖-6-磷酸（G-6-P)置于燒杯D中，用IL 55mM、pH=8.0的Tris緩沖液溶 解制成均相酶底物；將上述制備的抗羥脯氨酸特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗體與 均相酶底物的體積比為1:1500。
[0060] 2.試劑B的制備：將實施例五制備的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物加到 120mM、pH=8. 2的Tris緩沖液中，上述偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:1000。
[0061] 實施例七：羥脯氨酸均相酶免疫檢驗及結果 1.獲得標準曲線： (1)設置邁瑞B(yǎng)S-480全自動生化分析儀反應參數(shù)(見表2)。
[0062] (2)操作步驟為：先加試劑A，再加入標準品，最后加入試劑B。加入試劑B后，測 定不同時間點的OD34。吸光值，算出不同標準品濃度時的反應速率，實際操作過程中需不斷 調整試劑A和試劑B的體積比例，同時調整測光點，最后得出較理想的反應標準曲線圖，如 圖3所示。
[0063] 表2邁瑞B(yǎng)S-480全自動生化分析儀反應參數(shù)
2.樣本檢測：通過本發(fā)明的均相酶免疫檢測試劑得到的標準曲線，重復測定低、中、高 濃度質控樣本10次，上述質控樣本為：將羥脯氨酸標準品溶解于人尿液中，至濃度分別為 10. 00,100. 00, 200. 00mg/L。檢測數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)分析見表3。
[0064] 表3樣品測定及精密度和回收率評估
檢測結果：本發(fā)明的均相酶免疫檢測試劑測定的準確度高，回收率達到95%_105%，精 密度高，CV均低于5%。
[0065] 實施例八：藥物干擾試驗 選取62種常見藥物進行干擾檢測，調整濃度至1.00 mg/L，采用實施例七的均相酶免 疫方法進行測定： 1. 將待測干擾藥物與實施例六制備的試劑A接觸反應，再加入試劑B ; 2. 檢測上述混合溶液的OD34。吸光值，根據(jù)實施例七的標準曲線得到相應物質的濃度。
[0066] 常見的62種藥物名稱以及測定結果具體參見表4。
[0067] 表4常見干擾藥物測定結果
測定結果顯示：上述62種常見藥物等價于羥脯氨酸的濃度均小于0.01 mg/L。由此可 見，本發(fā)明的抗體是抗羥脯氨酸的特異性抗體，與其它藥物無交叉反應。
[0068] 實施例九：相關性分析 對100例臨床標本分別使用青島博新生物技術有限公司的比色法試劑和本發(fā)明的均 相酶免疫試劑進行相關性分析，測定的數(shù)據(jù)參見表5。
[0069]表5臨床樣本測定值

對上述數(shù)據(jù)作圖，參見圖3,得到的線性方程為：y = 0.9718x + I. 9094,相關系數(shù)R2 = 0. 9969,表明本發(fā)明的檢測試劑測定羥脯氨酸臨床標本的準確度高。
[0070] 需要說明的是，以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍， 凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內容所做的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在 其他相關技術領域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內。
【主權項】
1. 一種羥脯氨酸免疫原，其結構式如式（I )所示：式（I ) 式中，R為連接基團-(CH2) n-C00-，η是1至20之間的整數(shù)，優(yōu)選R為-(CH2) 5-C00-;載 體為具有免疫原性的蛋白質或多肽，選自血清蛋白、血藍蛋白或甲狀腺球蛋白中的一種，優(yōu) 選為血清蛋白，更優(yōu)選為牛血清白蛋白。2. -種如權利要求1所述的羥脯氨酸免疫原的制備方法，其特征在于包含以下步驟： (1) 將載體蛋白100~300g溶解于25~75 ml 0· 2 M，pH 8. 5的磷酸緩沖液中； (2) 將如下化學品加入到小燒杯中攪拌溶解：100~300 mg羥脯氨酸衍生物、1. 75~ 5. 25 ml二甲基甲酰胺、L 75~5. 25 ml乙醇、3. 5~10. 5ml 10mM，pH 5. 0的磷酸鉀緩沖 液、100~300 mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基）碳二亞胺、25~75 mg N-羥基硫代琥珀 酰亞胺，將上述化學品在室溫下攪拌溶解反應30~60 min ; (3) 將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2~8°C下攪拌過夜，得到抗原；將合 成好的抗原經(jīng)過透析進行純化，得到羥脯氨酸免疫原。3. 根據(jù)權利要求2所述的羥脯氨酸免疫原制備方法，其特征在于所述的羥脯氨酸衍生 物結構式如式（II)所示：式（II) 上述R為連接基團-(CH2) n-C00-，η為1至20之間的整數(shù)，優(yōu)選n=5。4. 根據(jù)權利要求2-3任一項所述的羥脯氨酸衍生物，其特征在于，n=5時，具體合成步 驟如下：或者當η為5以外的其余整數(shù)時，羥脯氨酸衍生物的合成步驟與上述合成步驟的區(qū)別 僅在于：由化合物2合成化合物3的步驟中，采用的原料6-溴己酸甲酯替換為其類似物。5. -種抗羥脯氨酸特異性抗體，由權利要求1-2任意一項所述的羥脯氨酸免疫原免疫 實驗動物后產(chǎn)生的完整抗體分子，或者為保留與羥脯氨酸特異性結合能力的抗體片段或抗 體衍生物。6. 根據(jù)權利要求5所述的一種抗羥脯氨酸特異性抗體，其特征在于所述的完整的抗體 分子、抗體片段或抗體衍生物，為采用單一的羥脯氨酸免疫原對動物加強免疫所獲得的多 克隆抗體，或者為免疫后經(jīng)體細胞雜交獲得的單克隆抗體；所述的實驗動物為兔、山羊、小 鼠、綿羊、豚鼠或馬的一種，優(yōu)選為兔。7. -種如權利要求5-6中任一項所述的抗羥脯氨酸特異性抗體的制備方法，其特征在 于包含以下步驟： (1) 用PBS將牛血清白蛋白-羥脯氨酸免疫原稀釋至0. 1~3. O mg/ml，得到抗原溶液， 然后用0. 5~5. 0 ml抗原溶液與等量弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行注射； (2) 2~3周后，再用0. 5~5. 0 ml相同的抗原溶液與等量弗氏不完全佐劑對上述實 驗動物注射一次，之后每隔四周注射一次，共計注射3~6次； (3) 對步驟（2)的實驗動物取血，分離純化得到效價為1:30000~1:50000的抗羥脯氨 酸特異性抗體。8. -種羥脯氨酸檢測試劑，含有權利要求5-7所述的抗羥脯氨酸特異性抗體和指示試 劑，所述的指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑或發(fā)光試劑中的一種，優(yōu)選 為酶試劑；所述的酶試劑由羥脯氨酸酶標偶聯(lián)物和酶的底物組成，酶標偶聯(lián)物優(yōu)選為葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯(lián)物，酶的底物優(yōu)選為葡萄糖-6-磷酸。9. 一種如權利要求8所述的羥脯氨酸檢測試劑的制備方法，其特征在于包含以下步 驟： (1) 試劑A :將2. 018~8. 072g、5. 625~22. 50 mM氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和 0· 856 ~3. 422g、5. 625 ~22. 50 mM 葡萄糖-6-磷酸用 0· 5 ~2 L 55 mM、pH=8. 0 的 Tris 緩沖液溶解制成均相酶底物；將權利要求5-7中任一項所述的抗羥脯氨酸特異性抗體加到 上述均相酶底物中，抗羥脯氨酸特異性抗體與均相酶底物的體積比為1:100~1:10000 ; (2) 試劑B :將羥脯氨酸酶標偶聯(lián)物加到120mM、pH=8. 2的Tris緩沖液中，羥脯氨酸酶 標偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:100~1:10000 ; 所述的抗羥脯氨酸特異性抗體與均相酶底物的體積比優(yōu)選為1:1500 ; 所述的羥脯氨酸酶標偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比優(yōu)選為1:1000。10.根據(jù)權利要求8-9任一項所述的羥脯氨酸檢測試劑，其特征在于所述的羥脯氨酸 酶標偶聯(lián)物的制備方法包含以下步驟： (1) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備：稱取7. 5~22. 5 mg規(guī)格為100KU的葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶，室溫溶解于6~18 mL含有72. 6 mg 0.05 M Tris、8mg 3. 3 mM MgCl2 和IOOmg NaCl的溶液中，pH=9. 0 ;在溶液中加入112. 5~337. 5 mg還原態(tài)的煙酰胺腺嘌 呤二核苷酸、67. 5~202. 5 mg葡萄糖-6-磷酸以及0. 375~1. 125 mL卡必醇；再逐滴加 入1~3 mL二甲基亞砜； (2) 羥脯氨酸衍生物的激活：在無水狀態(tài)下稱取5~15 mg羥脯氨酸衍生物，溶解于 300~900 PL二甲基甲酰胺中；使上述溶液溫度降到-2 ~ _8°C ;加入1.5~4.5 PL三 丁胺；加入〇. 75~2. 25 PL氯甲酸異丁酯；-2 ~ -8°C攪拌30~60分鐘； (3) 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與羥脯氨酸衍生物的連接：將步驟（2)激活的羥脯氨酸衍生 物溶液逐滴加入到步驟（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2-8°C攪拌過夜； (4) 純化產(chǎn)物：通過G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8 °C下儲存。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羥脯氨酸免疫原及其合成方法，以及由該免疫原獲得的抗羥脯氨酸抗體、檢測試劑及其制備方法。本發(fā)明制備的羥脯氨酸免疫原，免疫原性高，可以誘導得到高效價的抗羥脯氨酸特異性抗體，并且與常見的62種藥物無任何交叉反應；由該抗體制備得到的羥脯氨酸檢測試劑，可以精確快速地確定尿液等生物樣品中的羥脯氨酸含量。與市場上現(xiàn)有的檢測試劑比較，本發(fā)明檢測試劑具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、結果準確等優(yōu)點，還能有效降低羥脯氨酸檢測成本，有利于臨床大規(guī)模推廣使用。
【IPC分類】C07K14/765, G01N33/533, C07K16/06, G01N33/68, C07K14/795, G01N33/535, C07D207/16, G01N33/534, C07K14/47
【公開號】CN105175531
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】虞留明, 陳維賢, 董梅
【申請人】蘇州博源醫(yī)療科技有限公司
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月14日