一種改良的蛋白質(zhì)印跡方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及生命科學(xué)研究領(lǐng)域，具體地涉及改良的蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn)）即Western Blot，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫 遺傳學(xué)中常用的分析方法，并且是一種能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量的分析的方法。蛋白免 疫印跡是一種蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，主要涉及將電泳分離后的從細(xì)胞或組織提取的蛋白質(zhì)從凝 膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測(cè)某特定抗原，其基本原理是 通過特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過的已分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行著色，通過分析著色的位置和著 色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息(參見圖1)。
[0003] 蛋白質(zhì)印跡法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測(cè)和疾病 早期診斷等多個(gè)方面。蛋白質(zhì)印跡法可分為電泳、轉(zhuǎn)膜、酶免疫反應(yīng)，二抗上的酶底物反應(yīng) 產(chǎn)生信號(hào)和蛋白信號(hào)檢測(cè)五個(gè)階段。蛋白質(zhì)印跡法的靈敏度主要依賴于最終的信號(hào)放大與 信號(hào)檢測(cè)，總體可分為兩種，即酶促反應(yīng)和同位素標(biāo)記放射自顯影。其中，放射自顯影所用 試劑有輻射性;經(jīng)典蛋白質(zhì)印跡法中，對(duì)二抗偶聯(lián)的酶和底物的信號(hào)檢測(cè)方式包括：
[0004] 底物呈色：（二抗用HRP標(biāo)記）HRP的生色底物有二氨基聯(lián)苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB)、氯萘酸（4-chlor〇-l_naphthol，4_CN)、CN/DAB、3_氨基_9_乙基味 P坐（3-amino-9-ethylca;rbazol，AEC)和四甲基聯(lián)苯胺（3,3,5,5tetramethylbenzidine， TMB)等（而得到可溶性產(chǎn)物的底物如0PD、ABTS等則適用于ELISA)中，底物顯色主要是利用 底物在有HRP和過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累這一過程檢測(cè)蛋白質(zhì)印 跡法的結(jié)果；
[0005] 經(jīng)典增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)(二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇 到HRP，酶促基團(tuán)發(fā)光，結(jié)果通過X光片壓片使膠片曝光后洗出條帶而顯影；
[0006] 底物熒光ECF:反應(yīng)底物為過氧化物和魯米諾，經(jīng)HRP催化發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
[0007] 底物DAB顯色方法的缺點(diǎn)缺陷就是需要現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色后光照數(shù)小時(shí)會(huì)褪色，不能 永久保存，需要拍照記錄，而且有毒;傳統(tǒng)的ECL采用X光片檢測(cè)酶和底物反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā) 光，該方法需要通過顯影和定影兩步過程才能實(shí)現(xiàn)最終對(duì)蛋白的顯色。這種方式需要根據(jù) 信號(hào)強(qiáng)弱調(diào)整曝光時(shí)間，還需要X光片及顯影液，溫度過低時(shí)(低于16°C)需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí) 間，因此操作繁瑣，有放射性污染的風(fēng)險(xiǎn)，而且不易掌握，成本較高。
[0008] 表1.經(jīng)典蛋白質(zhì)印跡法中，HRP的不同生色底物（可參見http:z7www.biofly.cn/ view.asp?id = 44)
[0009]
[0010] 因此，現(xiàn)代生命科學(xué)研究領(lǐng)域亟待一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)單的影像獲取技術(shù)代替 現(xiàn)有蛋白質(zhì)印跡法的影像顯示，改良蛋白質(zhì)印跡法的操作以降低生命科學(xué)科研人員的勞動(dòng) 強(qiáng)度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N改良的蛋白質(zhì)印跡方法，包括以下步驟：⑴目標(biāo)蛋白質(zhì)的SDA-PAGE電泳分離；（2)轉(zhuǎn)膜；（3)酶免疫定位；（4)蛋白信號(hào)檢測(cè);其中，步驟(3)所述的酶免疫反 應(yīng)是膜上的目標(biāo)蛋白質(zhì)先后分別與特異性一抗和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)，所述酶標(biāo)二抗是偶聯(lián) 酶標(biāo)記物的特異性一抗的抗體;并且所述酶標(biāo)二抗的酶標(biāo)記與顯色底物反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生熒 光，所述步驟(4)是采用活體生物成像裝置檢測(cè)步驟(3)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。在一些實(shí)施方案 中，所述步驟(4)中采用活體生物成像裝置檢測(cè)的曝光時(shí)間為0.025s~2.5s，優(yōu)選0.25s。在 一些實(shí)施方案中，所述酶標(biāo)記物選自辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖 苷酶β中的一種。在一些實(shí)施方案中，所述酶標(biāo)記物是辣根過氧化物酶。在一些實(shí)施方案中， 所述與酶標(biāo)二抗上偶聯(lián)的酶標(biāo)記的反應(yīng)底物包括但不限于DAB、4-CN、CN/DAB、AEC、TMB和 ECL。在一些實(shí)施方案中，所述酶標(biāo)二抗的偶聯(lián)酶標(biāo)記的反應(yīng)物底物是ECL。在一些實(shí)施方案 中，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)包括動(dòng)物蛋白。在一些實(shí)施方案中，步驟(2)中所述轉(zhuǎn)膜是將在凝膠中 已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至固相膜上，所述固相膜選自硝酸纖維素膜(NC)和PVDF膜中的一種。 在一些實(shí)施方案中，步驟(4)所述的活體生物成像裝置為熒光成像裝置，優(yōu)選小動(dòng)物活體成 像儀。
[0012 ]本申請(qǐng)的目的是提供一種靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，成本低的改良的蛋白質(zhì)印跡方法。
[0013] 本申請(qǐng)實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是：
[0014] -種改良的蛋白質(zhì)印跡方法，包括步驟：
[0015] ⑴蛋白質(zhì)的SDA-PAGE電泳分離，
[0016] (2)轉(zhuǎn)膜，
[0017] (3)酶免疫定位，
[0018] (4)蛋白信號(hào)檢測(cè)，
[0019] 其中，步驟(3)所述酶免疫反應(yīng)是膜上的目標(biāo)蛋白質(zhì)先后分別與特異性一抗和酶 標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)，所述酶標(biāo)二抗是偶聯(lián)酶標(biāo)記的特異性一抗的抗體。
[0020] 在本申請(qǐng)的改良的蛋白質(zhì)印跡方法中，所述酶標(biāo)二抗上的酶標(biāo)記物與顯色底物反 應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生熒光，步驟(4)所述蛋白信號(hào)檢測(cè)是在活體生物成像裝置檢測(cè)固體膜在步驟(3) 酶-底物反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號(hào)。本申請(qǐng)的步驟(4)蛋白信號(hào)檢測(cè)步驟中用活體生物成像裝置 檢測(cè)熒光的方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)中的X膠片法，避免了 X膠片曝光、顯影 和定影等步驟中的不利因素的影響，降低了操作的復(fù)雜程度。
[0021 ]本申請(qǐng)的改良的蛋白質(zhì)印跡方法中，步驟（1)中蛋白質(zhì)的SDA-PAGE電泳分離利用 的是抗原等蛋白樣品經(jīng)SDS處理后帶負(fù)電荷，在聚丙烯酰胺凝膠中從陰極向陽極泳動(dòng)，分子 量越小，泳動(dòng)速度就越快的特性分離蛋白樣品。蛋白樣品可以是動(dòng)物蛋白。
[0022] 本申請(qǐng)的改良的蛋白質(zhì)印跡方法中，步驟(2)轉(zhuǎn)膜是選用低電壓和大電流，通電將 在凝膠中已經(jīng)分離的條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)或PVDF膜上。所用電壓為30V~70V，優(yōu) 選40V，所用電流為120~250mA，優(yōu)選200mA，轉(zhuǎn)移時(shí)間為2h~4h。
[0023] 本申請(qǐng)的改良的蛋白質(zhì)印跡方法中，步驟(3)所述酶免疫反應(yīng)是膜上的目標(biāo)蛋白 先后分別與特異性一抗和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)，所述酶標(biāo)二抗是偶聯(lián)酶標(biāo)記的特異性一抗的 抗體。
[0024] 本申請(qǐng)的改良的蛋白質(zhì)印跡方法中，步驟(4)酶免疫定位酶標(biāo)二抗上的酶標(biāo)記物 與顯色底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光，所述蛋白信號(hào)檢測(cè)是采用活體生物成像裝置檢測(cè)步驟(3)產(chǎn)生 的熒光信號(hào)。其中，偶聯(lián)在二抗上的酶標(biāo)記物包括過氧化物酶P0D類、堿性磷酸酶AP (Alkaline Phosphatase)，葡萄糖氧化酶（Glucose 〇xidase)、0 半乳糖苷酶（β-Galactosidase)，優(yōu)選地為辣根過氧化物酶HRP(Horseradish Peroxidase)，HRP的生色底 物包括但不限于DAB、4-CN、CN/DAB、AEC、TMB和ECL，優(yōu)選地為ECL。
[0025] 本申請(qǐng)的改良的蛋白質(zhì)印跡方法中，目標(biāo)蛋白質(zhì)包括動(dòng)物蛋白。
[0026] 本申請(qǐng)的改良的蛋白質(zhì)印跡方法中，步驟(4)所述的活體生物成像裝置為熒光成 像裝置。
[0027] 在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，熒光成像裝置為小動(dòng)物活體成像儀。
[0028] 在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，步驟（4)采用活體生物成像裝置檢測(cè)的曝光時(shí)間為 0.5s〇
[0029] 在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，步驟（4)采用活體生物成像裝置檢測(cè)的曝光時(shí)間為 0. ls〇
[0030] 在本發(fā)明一具體實(shí)施例中，步驟(4)采用活體生物成像裝置檢測(cè)的曝光時(shí)間為5s。
[0031] 本申請(qǐng)的有益效果是:靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，容易掌握，環(huán)保安全。
[0032] 本申請(qǐng)的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變 得顯而易見，或者通過實(shí)施本申請(qǐng)而了解。本申請(qǐng)的目的和其他優(yōu)點(diǎn)可通過在說明書、權(quán)利 要求書以及附圖中所特別指出的結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)和獲得。
【附圖說明】
[0033]附圖用來提供對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本 申請(qǐng)的實(shí)施例一起用于解釋本申請(qǐng)的技術(shù)方案，并不構(gòu)成對(duì)本申請(qǐng)技術(shù)方案的限制。
[0034] 圖1為免疫印跡法原理示意圖；
[0035] 圖2為實(shí)施例1的兔單克隆抗體的改良的蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果(曝光時(shí)間為0.5s，從 左至右的泳道M、l、2、3、4、5分別代表Marker (5ul)- Anti-GAPDH和上樣濃度為0.925/ 500mg/mL、0 · 925/1000mg/mL、0 · 925/2000mg/mL、0.925/4000mg/mL、0.925/8000mg/mL 的樣 品）；
[0036] 圖3為實(shí)施例2的兔單克隆抗體的改