專利名稱：一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離材料的制備，尤其是一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法。
背景技術(shù)：
分子印跡(molecular imprinting)是近年來基于分子組裝發(fā)展起來的一種對(duì)特 定分子(模板分子或印跡分子)具有選擇性的人工仿生材料合成技術(shù)。該技術(shù)也被形象地 描述為制造識(shí)別“分子鑰匙”的人工“鎖”的技術(shù)。以非共價(jià)型分子印跡為例，以要識(shí)別的目 標(biāo)分子為模板，通過弱的非共價(jià)相互作用(如氫鍵、靜電作用、疏水作用等)使模板分子與 可聚合的功能單體進(jìn)行組裝，并與交聯(lián)劑發(fā)生聚合反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后除去模板分子，即可在 聚合物中形成功能基團(tuán)排布與印跡分子的形狀、大小、電荷分布互補(bǔ)的孔穴，因此，制備的 分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymer, MIP)對(duì)印跡分子具有良好的選擇性、 親和性。目前，以小分子為印跡模板的合成材料已廣泛應(yīng)用于色譜填料、人工受體、模擬酶、 催化劑以及傳感器等領(lǐng)域。盡管分子印跡技術(shù)對(duì)小分子比較成功，然而在蛋白質(zhì)印跡方面的研究仍然處于起 步階段，由于蛋白質(zhì)不溶于有機(jī)溶劑，容易變性、體積龐大，因此在制備蛋白印跡整體分離 材料時(shí)容易將其包裹在聚合物網(wǎng)絡(luò)中，而反應(yīng)后難以洗脫出來，在反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)的構(gòu) 象也比較容易發(fā)生變化。目前，制備蛋白質(zhì)分子印跡材料的制備方法主要包括包埋法、表面印跡法和抗原 決定基法。包埋法也稱本體聚合法，按照一定的比例將印跡分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā) 劑溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲泻螅ㄟ^脫氣以及除氧，經(jīng)引發(fā)聚合制備印跡聚合物。Liao等以血 紅蛋白、生長(zhǎng)激素、紅細(xì)胞色素、肌紅蛋白和核糖核酸酶為模板分子，以丙烯酰胺為功能單 體合成了低交聯(lián)度的丙烯酰胺凝膠，然而制備的聚合物交聯(lián)度低，機(jī)械強(qiáng)度差，部分模板分 子由于被包埋在顆粒內(nèi)洗脫困難，此外，吸附所需的平衡時(shí)間也較長(zhǎng)(Liao，J. L.，Wang， Y. ,Hjerten, S. ,Chromatographia 1996,42,259-262 ；Hjerten, S. , Liao, J. L. ,Nakazato, K. , Wang, Y. et al.，Chromatographia 1997，44，227-234)。表面印跡技術(shù)是將模板分子固 定于基質(zhì)表面，然后引發(fā)聚合，通過此技術(shù)制備的印跡材料印跡位點(diǎn)位于磁療的表面，可以 克服本體聚合印跡材料的弊端，通常是在微球或聚合物涂層上進(jìn)行印跡，Glud將轉(zhuǎn)鐵蛋白 在溶液中與硼酸酯硅烷發(fā)生作用，然后在多孔硅膠顆粒上進(jìn)行聚合，由于硼酸酯基團(tuán)能與 轉(zhuǎn)鐵蛋白上的硅酸鋁發(fā)生不可逆反應(yīng)，因此硼酸酯硅烷與轉(zhuǎn)鐵蛋白的預(yù)結(jié)合使得硼酸酯基 團(tuán)能正確排列，確保了與轉(zhuǎn)鐵蛋白的特異性相互作用(Glad M,NorrlOw0, Sellergren B， Siegbahn N, Mosbach K.，J. Chromatogr. 1985，347，11-23.)，但是這種方法制備的印跡聚 合物吸附容量比較低，制備過程繁瑣?？乖瓫Q定基法的基本原理是基于生物分子體內(nèi)識(shí)別 時(shí)抗體與抗原的決定基作用。因此利用抗原的決定基制備的印跡材料可以識(shí)別相應(yīng)的抗 體，在蛋白質(zhì)印跡材料制備過程中，通常以蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)的小部分裸露短肽作為模板， 制備印跡材料，即可識(shí)別多種具有該肽段的分子(Rachkov A.，Minoura N. ；Biochimica etBiophysica Acta 1544 (2001) 255-266)，該方法的缺點(diǎn)是選擇性較差。印跡聚合物不僅可 以識(shí)別模板分子，而且可以識(shí)別與模板具有相同氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。綜上所述，目前已有的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)多數(shù)限于合成聚合物顆粒，其蛋白質(zhì)模板 分子包埋嚴(yán)重，選擇性差，無法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行識(shí)別分離
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種模板分子易洗脫、方法簡(jiǎn) 單的大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，該方法制備的蛋白質(zhì)分子印跡整體材料具 有較快的傳質(zhì)速率和較強(qiáng)的分子選擇性和特異性。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，步驟是如下(1)取聚合物乳膠球、功能單體、交聯(lián)劑混合于IOmM的pH2. 5 10. 0的磷酸鹽緩 沖溶液中，攪拌均勻，聚合物乳膠球的重量終濃度為3.0% 6.0%，功能單體的重量終濃 度為2. 5% 7. 5%，交聯(lián)劑的重量終濃度1. 3% 4. 0%，聚合物乳膠球含有胍基或膦酸基 的特異親和基團(tuán)；(2)在上述混合后的磷酸鹽緩沖液中通入氮?dú)獬?，加入重量終濃度為0. 35% 0. 70%模板分子，模板分子為人血清白蛋白、IgG或轉(zhuǎn)鐵蛋白；(3)繼續(xù)加入重量終濃度分別為0. 05% 0. 25%的過硫酸銨和0. 12% 0. 25% 的N，N，N\N:四甲基乙二胺，混合均勻后迅速注入色譜柱管中，放入20 30°C環(huán)境中3 24小時(shí)進(jìn)行聚合反應(yīng)；(4)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用甲苯洗脫聚合物乳膠球，用含有重量濃度為5% 15% 十二烷基磺酸鈉以及體積濃度為5% 15%乙酸的水溶液洗脫聚合物上的模板分子，再用 PH2. 5 10. 0磷酸鹽緩沖液沖洗，獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料。而且，所述聚合物乳膠球制備的原料的種類及含量為苯乙烯的重量濃度為 5.0% 10.0%，膦酸功能單體的重量濃度為1.0% 3.0%，胍基功能單體的重量濃度為 0. 8% 2. 5%。而且，所述膦酸功能單體為2-甲基-2-丙烯酸-2-(膦酰氧基)乙酯，所述胍基功 能單體為2-甲基-2-丙烯酸_2-(胍基)乙酯。而且，所述聚合物乳膠球的粒徑為50 250nm。而且，所述功能單體為丙烯酰胺與甲基丙烯酸的混合物、或甲基丙烯酰胺與甲基 丙烯酸的混合物，其中甲基丙烯酸的重量濃度為0. 08% 0. 5%。而且，所述交聯(lián)劑為N，N"-亞甲基雙丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明改變了傳統(tǒng)蛋白質(zhì)印跡整體材料的制備過程，采用帶有胍基或膦酸基的 聚合物乳膠球來固定模板蛋白，同時(shí)又充當(dāng)致孔劑，在聚合反應(yīng)完成后，通過有機(jī)溶劑很容 易將聚合物乳膠球除去，在整體材料內(nèi)部形成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這些孔道不僅具有很高的比 表面，而且內(nèi)表面上印跡的蛋白質(zhì)非常易于從孔道中洗脫，避免了強(qiáng)腐蝕性試劑(強(qiáng)酸、強(qiáng) 堿等)對(duì)印跡材料的腐蝕，增強(qiáng)了印跡過程中提取的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在 色譜固定相上的識(shí)別與分離。
2、本發(fā)明制備出的蛋白質(zhì)分子印跡整體材料具有大孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布均勻，使整 體材料具有較好的選擇性和親和性，也具有較快的傳質(zhì)速率和較強(qiáng)的分子選擇性和特異 性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，步驟是 (1)取聚合物乳膠球、功能單體、交聯(lián)劑混合于IOmM的pH2. 5 10. 0的磷酸鹽緩 沖溶液中，攪拌均勻，聚合物乳膠球的重量終濃度為3.0% 6.0%，功能單體的重量終濃 度為2. 5% 7.5%，交聯(lián)劑的重量終濃度1.3% 4.0% ；聚合物乳膠球的制備方法為由苯乙烯與膦酸功能單體或胍基功能單體通過無 皂乳液聚合制備聚合物乳膠球，苯乙烯的重量濃度為5.0% 10.0%，膦酸功能單體的重 量濃度為1. 0 % 3. 0 %，胍基功能單體的重量濃度為0. 8 % 2. 5 %，引發(fā)劑過硫酸鉀， 用碳酸氫鈉調(diào)PHlO左右，合成后經(jīng)分離洗滌即得；其中膦酸功能單體為2-甲基-2-丙烯 酸-2-(膦酰氧基)乙酯，胍基功能單體為2-甲基-2-丙烯酸-2-(胍基)乙酯，合成的聚合 物乳膠球含有胍基或膦酸基的特異親和基團(tuán)，可用作為模板蛋白固定基質(zhì)及致孔劑，其粒 徑為50 250nm ；功能單體為丙烯酰胺與甲基丙烯酸或甲基丙烯酰胺與甲基丙烯酸組合， 其中甲基丙烯酸的重量濃度為0. 08% 0. 5% ；交聯(lián)劑為N，N:亞甲基雙丙烯酰胺或哌嗪 二丙烯酰胺；(2)在上述混合后的磷酸鹽緩沖液中通入氮?dú)獬?，加入模板分子，混合均勻，?板分子在緩沖溶液中的重量終濃度為0. 35% 0. 70%，模板分子為人血清白蛋白、IgG或 轉(zhuǎn)鐵蛋白；(3)繼續(xù)加入引發(fā)劑過硫酸銨和增速劑N，N，N\N:四甲基乙二胺，其中引發(fā)劑的 重量終濃度為0. 05% 0. 25%，增速劑的重量終濃度為0. 12% 0. 25%;混合均勻后迅速 注入色譜柱管中，放入20 30°C環(huán)境中聚合3 24小時(shí)進(jìn)行聚合反應(yīng)；(4)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用甲苯洗脫聚合物乳膠球，用含有重量濃度為5% 15% 十二烷基磺酸鈉以及體積濃度為5% 15%乙酸的水溶液洗脫聚合物上的模板分子，再用 60. 0-100. 0mLpH2. 5 10. 0磷酸鹽緩沖液沖洗，獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體分離材料。
權(quán)利要求
一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，其特征在于步驟是如下(1)取聚合物乳膠球、功能單體、交聯(lián)劑混合于10mM的pH2.5～10.0的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌均勻，聚合物乳膠球的重量終濃度為3.0％～6.0％，功能單體的重量終濃度為2.5％～7.5％，交聯(lián)劑的重量終濃度1.3％～4.0％，聚合物乳膠球含有胍基或膦酸基的特異親和基團(tuán)；(2)在上述混合后的磷酸鹽緩沖液中通入氮?dú)獬酰尤胫亓拷K濃度為0.35％～0.70％模板分子，模板分子為人血清白蛋白、IgG或轉(zhuǎn)鐵蛋白；(3)繼續(xù)加入重量終濃度分別為0.05％～0.25％的過硫酸銨和0.12％～0.25％的N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，混合均勻后迅速注入色譜柱管中，放入20～30℃環(huán)境中3～24小時(shí)進(jìn)行聚合反應(yīng)；(4)聚合反應(yīng)結(jié)束后，用甲苯洗脫聚合物乳膠球，用含有重量濃度為5％～15％十二烷基磺酸鈉以及體積濃度為5％～15％乙酸的水溶液洗脫聚合物上的模板分子，再用pH2.5～10.0磷酸鹽緩沖液沖洗，獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，其特征在 于所述聚合物乳膠球制備的原料的種類及含量為苯乙烯的重量濃度為5. 0% 10. 0%, 膦酸功能單體的重量濃度為1. 0% 3. 0%，胍基功能單體的重量濃度為0. 8% 2. 5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，其特征在 于所述膦酸功能單體為2-甲基-2-丙烯酸-2-(膦酰氧基)乙酯，所述胍基功能單體為 2-甲基-2-丙烯酸-2-(胍基)乙酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，其特征在 于所述聚合物乳膠球的粒徑為50 250nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，其特征在 于所述功能單體為丙烯酰胺與甲基丙烯酸的混合物、或甲基丙烯酰胺與甲基丙烯酸的混 合物，其中甲基丙烯酸的重量濃度為0. 08% 0. 5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，其特征在 于所述交聯(lián)劑為N，亞甲基雙丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體材料的制備方法，步驟是聚合物乳膠球、功能單體、交聯(lián)劑混合于10mM的pH2.5～10.0的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌均勻；通入氮?dú)獬?，加入模板分子，繼續(xù)加入過硫酸銨、N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，混合均勻后迅速注入色譜柱管中，放入20～30℃環(huán)境中聚合3～24小時(shí)進(jìn)行聚合反應(yīng)；反應(yīng)后進(jìn)行洗脫。本發(fā)明制備出的蛋白質(zhì)分子印跡整體材料具有大孔結(jié)構(gòu)，孔徑分布均勻，使整體材料具有較好的選擇性和親和性，也具有較快的傳質(zhì)速率和較強(qiáng)的分子選擇性和特異性。
文檔編號(hào)B01J20/30GK101845117SQ20101017373
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者李燕麗, 鄧啟良 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)