專利名稱：：一種蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及液相色譜柱的制備，具體地說是一種新型蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法。
背景技術(shù)：
：分子印跡(molecularimprinting)是近年來基于分子識別機(jī)理發(fā)展起來的一種對特定分子(模板分子或印跡分子)具有選擇性的聚合物合成技術(shù)。通常被描述為制造識別"分子鑰匙"的人工"鎖"的技術(shù)。例如在非共價(jià)型分子印跡中通常以目標(biāo)分子為模板，通過氫鍵、靜電作用、疏水作用等作用，將該分子與可聚合的功能單體進(jìn)行組裝，并于交聯(lián)劑發(fā)生聚合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后除去印跡分子，即可在聚合物中形成功能基團(tuán)精確排布的孔穴。該孔穴與印跡分子的形狀、大小、電荷分布具有互補(bǔ)性。因此，制備的分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymer,MIP)對印跡分子具有良好的選擇性。目前，以小分子為印跡分子制備的MIP已廣泛應(yīng)用于色譜填料、人工受體、模擬酶、催化劑以及傳感器等領(lǐng)域。然而，由于該方法本身的局限性，MIP面臨的主要挑戰(zhàn)之一是以蛋白質(zhì)為模板制備蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。這是由于蛋白質(zhì)體積大，將其包裹在聚合物網(wǎng)絡(luò)中后難以洗脫出來。此外，在反應(yīng)過程中還必須保持蛋白質(zhì)的構(gòu)象。目前，蛋白質(zhì)分子印跡聚合物的制備方法主要有包埋法、表面印跡法和抗原決定基法。包埋法也稱本體聚合法，是將印跡分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑按照一定比例溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲泻?，通過脫氣、除氧，經(jīng)引發(fā)聚合制備印跡聚合物。Liao等以血紅蛋白、生長激素、紅細(xì)胞色素、肌紅蛋白和核糖核酸酶為模板分子，以丙烯酰胺為功能單體合成了低交聯(lián)度的丙烯酰胺凝膠。然而制備的聚合物交聯(lián)度低，機(jī)械強(qiáng)度差。部分模板分子由于被包埋在顆粒內(nèi)洗脫困難。此外，吸附所需的平衡時(shí)間也較長(LiaaJ.L.,Wang,Y.，Hjert6n,S.,Chromatographia1996,42,259—262;Hjert6n,S.,Liao,J.L.,Nakazato,K.,Wang,Y.etal.，Chromatographia1997,44,227-234)。采用表面印跡技術(shù)可將模扳分子的識別位點(diǎn)置于顆粒表面，能克服本體聚合的弊端。通常是在微球或聚合物涂層上進(jìn)行印跡。Glud將轉(zhuǎn)鐵蛋白在溶液中與硼酸酯硅垸發(fā)生作用，然后在多孔硅膠顆粒上進(jìn)行聚合。由于硼酸酯基團(tuán)能與轉(zhuǎn)鐵蛋白上的硅酸鋁發(fā)生不可逆反應(yīng)，因此硼酸酯硅烷與轉(zhuǎn)鐵蛋白的預(yù)結(jié)合使得硼酸酯基團(tuán)能正確排列，確保了與轉(zhuǎn)鐵蛋白的特異性相互作用(GladM,NorrlC)wO,SellergrenB,SiegbahnN,MosbachK.J.Chromatogr.1985,347,11-23.)。但是這種方法制備的印跡聚合物吸附容3量比較低，制備過程繁瑣。Shi等先將蛋白質(zhì)吸附在云母表面，再將二糖分子薄層覆蓋在吸附的蛋白質(zhì)上。隨后將含氟聚合物薄膜通過射頻發(fā)光放電等離子體與糖分子交聯(lián)。去除云母并洗脫蛋白質(zhì)分子后即可在聚合物薄膜表面形成多糖覆蓋的蛋白質(zhì)印跡納米孔穴。該材料對二元蛋白質(zhì)溶液中的模板蛋白質(zhì)具有一定的選擇性吸附。但由于聚合物的表面積所限，此項(xiàng)技術(shù)只能用于蛋白質(zhì)的檢測，不適于對蛋白質(zhì)進(jìn)行識別分離(ShiH.,TsaiW.B.,GarrisonM.D.,FerrariS.,RatnerB.D.,Nature1999,398,593-597.)?？乖瓫Q定基法的原理是抗體在識別抗原時(shí)，只與抗原的決定基作用。因此具有相同決定基的抗原可以被同一種抗體識別。以代表蛋白質(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)的小部分裸露片斷的短肽作為模板，形成與之匹配的空間孔穴，即可識別多種具有該肽段的分子(RachkovA.,MinouraN.;BiochimicaetBiophysicaActa1544(2001)255-266)。該方法的缺點(diǎn)是選擇性較差。印跡聚合物不僅可以識別模板分子，而且可以識別與模板具有相同氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。綜上所述，目前已有的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)僅限于合成聚合物顆粒。其蛋白質(zhì)模板分子包埋嚴(yán)重，選擇性差，無法對蛋白質(zhì)進(jìn)行識別分離。因此均不適于制備蛋白質(zhì)印跡整體柱。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)印跡整體柱的制備方法，以期解決在制備蛋白質(zhì)印跡三維聚合物時(shí)難以將蛋白質(zhì)模板從聚合物內(nèi)部洗脫的關(guān)鍵問題。該發(fā)明以常溫緩沖溶液為溶劑，溶解模板蛋白質(zhì)、功能單體、交聯(lián)劑以及引發(fā)劑；在低溫聚合時(shí)水逐漸形成冰粒，成為聚合反應(yīng)的致孔劑。同時(shí)單體在溶液中的濃度增大，聚合速度加快。當(dāng)聚合反應(yīng)完成后，溫度升至常溫，冰粒融化，聚合物內(nèi)部即可形成多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些孔道不僅具有很高的比表面，而且內(nèi)表面上印跡的蛋白質(zhì)非常易于從孔道中洗脫。通過該方法即可獲得具有較大吸附容量的蛋白質(zhì)印跡聚合物，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在色譜固定相上的識別分離。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，以丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺為功能，體，功能單體與交聯(lián)劑溶于10mM的pH4.57.5的磷酸鹽緩沖溶液中；緩沖溶液中功能單體的重量濃度為3.06.5%，交聯(lián)劑的重量濃度0.35~0.7%;通入氮?dú)獬鹾蠹尤肽０宸肿?，模板分子于緩沖溶液中的重量濃度為0.15~0.55%，并在04。C下靜置2~5分鐘；隨后加入引發(fā)劑過硫酸銨和增速劑N,N,N、,N、-四甲基乙二胺，緩沖溶液中引發(fā)劑的重量濃度為0.080.2%，增速劑的重量濃度為0.1~0.15%;混合均勻后迅速注入液相色譜柱管中，放入-5-2(TC環(huán)境中聚合112小時(shí)；聚合反應(yīng)結(jié)束后，用含有重量濃度9-11%十二烷基磺酸鈉的體積濃度為9-11%乙酸混合液洗脫聚合物上的模板蛋白，獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體柱；最后，用pH4.57.5磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至色譜基線平衡即4可使用，所述模板分子為牛血清白蛋白、溶菌酶或細(xì)胞色素C。所述功能單體除丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺外，其中還含有重量濃度為0.10.4%的甲基丙烯酸；所述交聯(lián)劑為N,N、-亞甲基雙丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺。本發(fā)明的優(yōu)越性(l)采用低溫時(shí)水結(jié)冰形成的冰粒為聚合反應(yīng)的致孔劑，不需要加入其它致孔劑；(2)制備的蛋白質(zhì)印跡聚合物具有大孔結(jié)構(gòu)；(3)蛋白質(zhì)模板分子從聚合物中的洗脫非常容易；(4)制備的蛋白質(zhì)印跡整體聚合物具有較快的傳質(zhì)速率和較強(qiáng)的分子識別特性；(5)制備過程簡單，合成成本低。圖l.牛血清白蛋白印跡整體柱對牛血清白蛋白的識別效果；圖中Hb指血紅蛋白；SA指牛血清白蛋白；圖2.溶菌酶印跡整體柱對溶菌酶的識別效果；圖中，l為指碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑，2為溶菌酶。具體實(shí)施例方式實(shí)施例選用重量濃度為3.0~6.5%的丙烯酰胺禾口/或甲基丙烯酰胺與0.1~0.4%的甲基丙烯酸為功能單體，與重量濃度為0.35~0.7%的交聯(lián)劑N,N、-亞甲基雙丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺共同溶于IOmM的磷酸鹽緩沖溶液(pH4.5~7.5)中。通入氮?dú)獬テ渲腥芙獾难鯕夂蠹尤胫亓繚舛葹?.150.55%的模板蛋白質(zhì)分子溶菌酶、細(xì)胞色素C或牛血清白蛋白。在04X:放置25分鐘，加入重量濃度為0.08~0.2%的引發(fā)劑過硫酸銨和重量濃度0.1~0.15%的增速劑N,N，N、,N、-四甲基乙二胺。混合均勻后迅速注入液相色譜柱中，并放置在-5-20'C下反應(yīng)1~12小時(shí)。以上各物質(zhì)的重量濃度均為它們在緩沖溶液中的終濃度?？瞻讓φ瘴?，非分子印跡聚合物(NIP)的制備，除不加模板蛋白質(zhì)分子外，其他步驟同上。整體印跡柱的合成條件如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>按照上表中的用量制備整體柱后，用重量濃度10%十二烷基磺酸鈉和體積濃度10%乙酸混合溶液洗脫聚合物上的模板蛋白，可得大孔的整體印跡柱；接著用水、pH4.57.5磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至基線平衡即可使用。圖l為以牛血清白蛋白作為模板分子制備的分子印跡整體柱在液相色譜模式下，對血紅蛋白和牛血清白蛋白混合物中牛血清白蛋白的選擇性識別。從圖中可以看出雖然兩種蛋白的性質(zhì)相似，但該印跡整體柱對模板蛋白質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的保留。這說明通過本發(fā)明方法制備的分子印跡整體柱具有較好的蛋白質(zhì)印跡效果。圖2為以溶菌酶作為模板分子制備的分子印跡整體柱在液相色譜模式下，對指碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑和溶菌酶混合物中溶菌酶的選擇性識別。從圖中可以看出該印跡整體柱對模板蛋白質(zhì)表現(xiàn)出較強(qiáng)的保留。這說明通過本發(fā)明方法制備的分子印跡整體柱具有較好的蛋白質(zhì)印跡效果。權(quán)利要求1.一種蛋白質(zhì)分子印跡整體柱的制備方法，其特征在于以丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺為功能單體，功能單體與交聯(lián)劑溶于10mM的pH4.5～7.5的磷酸鹽緩沖溶液中；緩沖溶液中功能單體的重量濃度為3.0～6.5％，交聯(lián)劑的重量濃度0.35～0.7％；通入氮?dú)獬鹾蠹尤肽０宸肿樱０宸肿佑诰彌_溶液中的重量濃度為0.15～0.55％，并在0～4℃下靜置2～5分鐘；隨后加入引發(fā)劑過硫酸銨和增速劑N，N，N`，N`-四甲基乙二胺，緩沖溶液中引發(fā)劑的重量濃度為0.08～0.2％，增速劑的重量濃度為0.1～0.15％；混合均勻后迅速注入液相色譜柱管中，放入-5～-20℃環(huán)境中聚合1～12小時(shí)；聚合反應(yīng)結(jié)束后，用含有重量濃度9-11％十二烷基磺酸鈉的體積濃度為9-11％乙酸混合液洗脫聚合物上的模板蛋白，獲得大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體柱；最后，用pH4.5～7.5磷酸鹽緩沖液沖洗柱子至色譜基線平衡即可使用；所述模板分子為牛血清白蛋白、溶菌酶或細(xì)胞色素C。2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述功能單體除丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺外，其中還含有重量濃度為O.l~0.4%的甲基丙烯酸。3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述交聯(lián)劑為N，N:亞甲基雙丙烯酰胺或哌嗪二丙烯酰胺。全文摘要本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分子印跡整體聚合物的制備方法。將適當(dāng)配比的功能單體、交聯(lián)劑和蛋白質(zhì)模板分子在0～4℃下靜置2～5分鐘，隨后依次加入一定量的引發(fā)劑和增速劑。將上述混合物迅速注入液相色譜柱管后，放置于-5～-20℃環(huán)境中在1～12小時(shí)內(nèi)完成聚合反應(yīng)。用重量濃度為10％的十二烷基磺酸鈉與體積濃度為10％的乙酸溶液洗脫模板蛋白質(zhì)分子，即可制備大孔蛋白質(zhì)分子印跡整體柱。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為制備方法簡單、可靠，獲得的蛋白質(zhì)分子印跡整體柱具有較強(qiáng)的模扳分子識別特性。該技術(shù)為發(fā)展蛋白質(zhì)分子印跡整體柱提供了一種新型制備方法。文檔編號G01N30/56GK101464439SQ200710159108公開日2009年6月24日申請日期2007年12月21日優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日發(fā)明者喬曉強(qiáng),劉晉湘,張麗華,張玉奎,振梁,鵬趙,鄧啟良申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所