含聚偏氟乙烯納米纖維的蛋白質(zhì)印跡復(fù)合膜及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜，其呈由聚偏氟乙烯(PVdF)納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化的形態(tài)形成，形成于無紡布上的納米纖維的克重為1gsm至50gsm且納米纖維的平均微孔大小為0.1μm至1μm。在本發(fā)明中，由納米纖維形成的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜具有如下有用的優(yōu)點(diǎn)，即，節(jié)減生產(chǎn)成本，且響應(yīng)特性優(yōu)秀，即使存在少量的蛋白質(zhì)的特定物質(zhì)的情況下，也能夠容易地進(jìn)行檢測(cè)。
【專利說明】含聚偏氟乙烯納米纖維的蛋白質(zhì)印跡復(fù)合膜及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及含有聚偏氟乙烯(PVdF, polyviniIidenflouride)納米纖維的蛋白質(zhì)印跡(western blot)用復(fù)合膜及其制備方法，具體地涉及以通過電紡絲制成的納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化的形態(tài)降低生產(chǎn)成本，且響應(yīng)特性優(yōu)秀，即使存在少量的蛋白質(zhì)的特定物質(zhì)的情況下，也能夠容易地進(jìn)行檢測(cè)的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)印跡(western blot)是從多個(gè)蛋白質(zhì)混合物中找出某種特定蛋白質(zhì)的技術(shù)，若將從細(xì)胞或組織中提取的蛋白質(zhì)與樣品緩沖液(s ample buffer)相混合而放置在由丙烯酰胺(acrylamide)制成的分子篩(molecular sieve)上并進(jìn)行電泳,貝U樣品緩沖液中的被稱為十二烷基硫酸鈉(SDS, sodium dodecyl sulfate,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-page, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectr ophoresis))的物質(zhì)使整個(gè)蛋白質(zhì)帶有陰電(_)，從而使蛋白質(zhì)吸引到陽電(+)側(cè)。此時(shí)，分子篩妨礙蛋白質(zhì)的進(jìn)行，使得小分子移動(dòng)較快，大分子移動(dòng)較慢，從而形成多個(gè)大小的帶(band)，此時(shí)，若在根據(jù)大小分離的凝膠(gel)上放置膜使其帶電，則蛋白質(zhì)以分離的狀態(tài)轉(zhuǎn)移到膜。在這里，上述蛋白質(zhì)印跡是用X射線(X-ray)將使對(duì)要檢測(cè)的特定蛋白質(zhì)的抗體(antibody)結(jié)合，再次在上述抗體結(jié)合特異性的第二抗體，從而通過發(fā)色和熒光來顯現(xiàn)的反應(yīng)進(jìn)行圖像化的方法。
[0003]此時(shí)所使用的膜將容易與蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性結(jié)合(hydrophobic interaction)的硝酸纖維素(nitrocellulose)、尼龍(nylon)、聚偏氟乙烯(PVdF,polyviniIidenflouride)等用作原料，且平均微孔大小為0.2 μ m和0.45 μ m。這種膜通過如同基于在水等非溶劑中倒入溶劑和高分子來制備的相分離法(phase separation)的干式(dry)、濕式(w et)、干濕式(dry-wet casting)等方法制成,但因參與到相轉(zhuǎn)化工序中的復(fù)雜的因子的影響，很難控制相分離方法，從而很難獲得具有均勻的微孔分布的膜。并且，也有因微孔的形態(tài)在相分離過程中形成，從而形成無法從表面連接至背面的二維的關(guān)閉結(jié)構(gòu)(closed pore)，導(dǎo)致難以期待高的氣孔度及比表面積的問題。
[0004]最近，膜的制備方法之一的電紡絲法是在高分子溶液中利用高電壓的電場(chǎng)來獲得三維無紡布上的納米纖維的方法。這種納米纖維具有可控制基于纖維直徑和后處理的微孔結(jié)構(gòu)，且可提供高的氣孔度及比表面積的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]到目前為止，作為利用納米纖維的蛋白質(zhì)印跡用膜的制備方法，本發(fā)明人提出了韓國(guó)公開特許第10-2011-0035454號(hào)“蛋白質(zhì)印跡用納米纖維膜及其制備方法韓國(guó)公開特許第10-2011-0058957號(hào)“蛋白質(zhì)印跡用一體型膜及其制備方法等。
[0006]但是，所提出的上述膜都是由納米纖維單獨(dú)制成或者將納米纖維與紙貼合來制成的，當(dāng)執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡法時(shí)，就由納米纖維單獨(dú)制成的膜而言，在膜與蛋白質(zhì)分離的凝膠之間產(chǎn)生氣泡時(shí)，由于納米纖維膜的僵硬度弱，因而不僅很難去除氣泡，而且為了當(dāng)將納米纖維膜放置在凝膠上時(shí)，可以防止因納米纖維的柔性及靜電力而產(chǎn)生的納米纖維相互之間的附著或重疊現(xiàn)象，而有需要規(guī)定程度的厚度的情況，因此導(dǎo)致存在工序費(fèi)用上漲的問題。
[0007]并且，在納米纖維與紙貼合的情況下，在甲醇預(yù)處理過程中，在因基于甲醇的聚偏氟乙烯納米纖維和紙的膨脹率不同而產(chǎn)生納米纖維從紙游離的現(xiàn)象，且與納米纖維相比紙的僵硬度太大，導(dǎo)致在凝膠與膜的接觸面產(chǎn)生氣泡的情況下，很難去除上述氣泡，從而很難執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡法。
[0008]因此，需要具有均勻的微孔分布和高的氣孔度，且容易去除氣泡，并具有適當(dāng)?shù)娜嵝缘牡鞍踪|(zhì)印跡用膜。本發(fā)明人對(duì)此進(jìn)行了反復(fù)研究，其結(jié)果得知，將納米纖維網(wǎng)與無紡布接合并進(jìn)行復(fù)合化，就可以解決上述問題，從而完成了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]技術(shù)問題
[0010]因此，本發(fā)明的目的在于，將納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化，來提供更低廉、容易處理，且檢測(cè)靈敏度得到提高的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜及其制備方法。
[0011]解決問題的手段
[0012]為了達(dá)成這種目的，根據(jù)本發(fā)明，提供蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，包括:將聚偏氟乙烯類高分子物質(zhì)溶解于溶劑中，來制備紡絲溶液的步驟；通過電紡絲方法來從上述紡絲溶液中獲得聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)的步驟；以及將獲得的上述聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化，來獲得蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的步驟。
[0013]并且，例如，可單獨(dú)利用由均聚物(homopolymer)組成的聚偏氟乙烯及由共聚物(copolymer)組成的聚偏氟乙烯等的氟類高分子來形成上述聚偏氟乙烯類高分子物質(zhì),或者將它們進(jìn)行復(fù)合化來形成聚偏氟乙烯類高分子物質(zhì)，但不受這些的特別限制。
[0014]并且,本發(fā)明的特征在于,優(yōu)選地,上述納米纖維的含量在Igsm至50gsm的范圍內(nèi)，上述納米纖維的平均微孔的大小在0.Ιμπι至Ι.Ομπι的范圍內(nèi)。
[0015]并且，根據(jù)本發(fā)明，上述納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化將納米纖維網(wǎng)與無紡布貼合，或者在上述無紡布上直接紡絲納米纖維來將上述納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化。并且，本發(fā)明的特征在于，上述納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化是通過選自壓接、加壓、壓延、軋制、熱接合以及超聲波接合中的某一種方法來執(zhí)行的。
[0016]此時(shí)，上述納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化也可以伴隨有60至200°C溫度下的熱處理。
[0017]并且，根據(jù)本發(fā)明，提供蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜，其特征在于，將通過電紡絲方法制成的納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化，使得納米纖維的含量在Igsm至50gsm的范圍內(nèi)，納米纖維的平均微孔的大小在0.1 μ tm至1.0 μ m的范圍內(nèi)。
[0018]本發(fā)明的特征在于，可在本發(fā)明中使用的溶劑為選自包含二甲基甲酰胺(DMF，d1-methyIformamide)、二 甲基乙酸胺(DMAc, d1-met hylacetamide)、四氫呋喃(THF,tetrahydrofuran)、丙酮(Acetone)、乙醇(Alcohol)類、氯仿(Chloroform)、二甲基亞諷(DMS0, dimet hyl sulfoxide)、二氯甲燒(dichloromethane)、醋酸(acetic acid)、蟻酸(formic acid)、N-甲基卩比咯燒酮(NMP, N-Methylpyrrolidone)以及氟乙醇類的組中的一種以上。
[0019]本發(fā)明的特征在于,上述紡絲方法為選自包含電紡絲(electrospi nning)、電噴射(electrospray)、電吹制紡絲(electrobrown spinning)、離心電紡絲(centrifugalelectrospinning)、閃蒸電紡絲(flash-electrosp inning)等的組中的一種。
[0020]本發(fā)明的特征在于，上述無紡布為選自包含聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET，Polyethylene terephthalate)、聚丙烯(PP, polyprophylene)以及聚酯(PE, polyester)類的組中的一種以上，上述無紡布的厚度或纖維直徑不受特別的限制。
[0021]發(fā)明的效果
[0022]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供降低生產(chǎn)成本，且蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度優(yōu)秀的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜，從而能夠有用地利用于蛋白質(zhì)分離、分析用以及多種檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為通過本發(fā)明制成的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)的掃描電子顯微鏡照片；(a)7gsm、(b)9gsm、(c) 14gsm。
[0024]圖2為通過本發(fā)明制成的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布貼合的截面的掃描電子顯微鏡照片；(a)7gsm、(b)9gsm、(c) 14gsm。
[0025]圖3為本發(fā)明中所使用的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布的掃描電子顯微鏡照片(a)和通過本發(fā)明制成的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布貼合的掃描電子顯微鏡照片(b)。
[0026]圖4為表示通過本發(fā)明制成的復(fù)合膜的由多孔材料有限公司(PM I)提供的結(jié)果的圖表。
[0027]圖5為表示利用通過本發(fā)明制成的復(fù)合膜的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片。
[0028]圖6為表示利用本發(fā)明和比較例的膜的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的照片。
【具體實(shí)施方式】
[0029]就本發(fā)明的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜而言，首先，將聚偏氟乙烯類高分子溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲校瑏硪钥杉徑z的濃度制備溶液，在向紡絲口移送之后，向噴嘴施加高電壓，從而通過利用電紡絲(electrospinning)等方法來進(jìn)行紡絲而與無紡布層疊并制備的方法和在無紡布上直接將聚偏氟乙烯類納米纖維進(jìn)行電紡絲來制備的方法，制備無紡布上的納米纖維的克重為Igsm至50gsm,納米纖維的平均微孔的大小為0.1至1.0 μ m的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜。
[0030]以下，按照各個(gè)步驟詳細(xì)說明。
[0031]聚偏氟乙烯類納米纖維紡絲溶液的制備
[0032]本發(fā)明中，例如，可單獨(dú)利用由均聚物(homopolymer)組成的聚偏氟乙烯及由共聚物(copolymer)組成的聚偏氟乙烯等的氟類高分子來形成聚偏氟乙烯類高分子物質(zhì),或者將它們進(jìn)行復(fù)合化來形成聚偏氟乙烯類高分子物質(zhì)，利用具有相容性的溶劑來制備可紡絲的濃度的紡絲溶液而使用。
[0033]在制備上述紡絲溶液的過程中，聚偏氟乙烯高分子物質(zhì)的含量適當(dāng)為5至50重量％，在聚偏氟乙烯高分子物質(zhì)的含量小于5重量％的情況下，相比于形成納米纖維，噴射成珠(bead)狀，導(dǎo)致難以形成膜，在聚偏氟乙烯高分子物質(zhì)的含量大于50重量％的情況下，具有由于粘度高，使得紡絲性不良，導(dǎo)致難以形成纖維的情況。因此，優(yōu)選地，使紡絲溶液具有容易形成纖維狀結(jié)構(gòu)的濃度，來控制纖維的形狀(形態(tài)學(xué)，morphology)。
[0034]高分子納米纖維網(wǎng)時(shí)形成
[0035]使用定量泵，來將制成的紡絲溶液移送到紡絲組件(spin pack),此時(shí),使用高電壓調(diào)節(jié)裝置來向紡絲組件施加電壓，從而實(shí)施電紡絲?？蓪⒋藭r(shí)所使用的電壓調(diào)節(jié)至0.5kV至IOOkV,集電板可接地或者帶有陰極而使用，優(yōu)選地，由導(dǎo)電性金屬、剝離紙、無紡布等構(gòu)成。集電板的情況下，優(yōu)選地，當(dāng)紡絲時(shí)，為了使纖維的集束順暢，附著捕集裝置(suctioncollector)來使用。
[0036]并且，優(yōu)選地，將紡絲組件到集電板的距離調(diào)節(jié)為5至50cm而使用。優(yōu)選地，對(duì)于紡絲時(shí)排出量，使用定量泵來以每個(gè)孔0.01至5cc/孔.分鐘(hole.min)排出并紡絲，當(dāng)紡絲時(shí)，在可調(diào)節(jié)溫度及濕度的腔室(chamber)內(nèi)在相對(duì)濕度為30至80%的環(huán)境下進(jìn)行紡絲。
[0037]高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化
[0038]如此制成的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚酯等的無紡布實(shí)現(xiàn)一體化，并通過壓接、軋制、熱接合、超聲波接合、壓延等多種方法來進(jìn)行層疊并制備復(fù)合體膜。
[0039]此時(shí)，可將納米纖維的克重多樣地制備為Igsm至50gsm。在本發(fā)明中，“克重”為表示納米纖維的含量的單位，用每平方米的重量(克)(gsm, gram per square meter)表示。在納米纖維的含量小于Igsm的情況下，存在由于聚偏氟乙烯納米纖維的量太少，導(dǎo)致不能以高靈敏度檢測(cè)蛋白質(zhì)的缺點(diǎn)，在納米纖維的含量大于50gsm的情況下，存在因高價(jià)的材料費(fèi)上漲，而使工序費(fèi)用增加的問題。
[0040]并且，納米纖維的平均微孔大小適當(dāng)為0.1至1.0 μ m，在納米纖維的平均微孔大小小于0.Ιμπι的情況下，后處理工序費(fèi)用上漲，轉(zhuǎn)移(t ransfer)時(shí)間延遲，在納米纖維的平均微孔大小大于1.0 μ m的情況下，轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)的濃度低而使檢測(cè)靈敏度下降，因而存在無法準(zhǔn)確分析的缺點(diǎn)。
[0041]另一方面，在本發(fā)明中，當(dāng)將納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化時(shí)，可根據(jù)需要伴隨有熱處理，優(yōu)選地，熱處理在不使高分子熔融的范圍，即在60至200°C的溫度范圍內(nèi)實(shí)施。在熱處理溫度小于60°C的情況下，由于熱處理溫度太低，因而納米纖維之間的熔敷處于不穩(wěn)定狀態(tài)，從而當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡之前的甲醇(methanol)預(yù)處理時(shí),進(jìn)行納米纖維之間的分離，導(dǎo)致難以執(zhí)行適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)印跡。并且，有如下情況，當(dāng)熱處理溫度大于200°C時(shí)，組成納米纖維的聚偏氟乙烯類高分子的一部分進(jìn)行熔融，使得微孔結(jié)構(gòu)被堵塞，從而無法適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行從十二燒基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-page)實(shí)現(xiàn)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移(transfer)，導(dǎo)致難以進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。
[0042]以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說明。這些實(shí)施例僅用于例示本發(fā)明，不應(yīng)解釋為本發(fā)明的范圍受這些實(shí)施例的限制，這對(duì)于本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
[0043](實(shí)施例1)
[0044]將20重量％的由作為疏水性高分子的均聚物組成的聚偏氟乙烯(Kynar761)溶解在溶劑二甲基乙酰胺(DMAc, Dimethylacetamide)中。利用定量泵來將制成的紡絲溶液移送到紡絲噴嘴，并在施加電壓為25kV、紡絲口與集電體的距離為20cm、且每分鐘排出量為
0.01cc/g.holl的條件下，在常溫及常壓條件下實(shí)施了電紡絲，使得聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)的克重分別為7gsm、9gsm、14gsm。
[0045]圖1示出了通過本實(shí)施例進(jìn)行電紡絲的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)的掃描電子顯微鏡照片。如圖1所示，可以確認(rèn)，組成聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)的大部分纖維呈現(xiàn)300nm至400nm范圍的直徑分布，且納米纖維與無紡布之間的微孔為三維的打開微孔(3_D openpore)結(jié)構(gòu)，從表面均勻地打開至背面。
[0046]在140°C溫度下，將如此制成的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布一起進(jìn)行壓延并復(fù)合化，將利用掃描電子顯微鏡來分析聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布的復(fù)合體的截面形狀的結(jié)果顯示在圖2中。如圖2所示，可以確認(rèn)在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布上復(fù)合化有聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)。
[0047]圖3示出了本發(fā)明中所使用的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布的掃描電子顯微鏡照片(a)和可確認(rèn)己電紡絲的納米纖維網(wǎng)與無紡布纖維的直徑差的電子顯微鏡照片(b)。由此可知，聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布的情況下，具有納米纖維的500倍的直徑，S卩，直徑為20 μ m。
[0048]圖4示出了使用毛細(xì)管流氣孔計(jì)(Capillary Flow porometer,多孔材料有限公司(PMI))裝備來分析根據(jù)本發(fā)明貼合的復(fù)合膜的氣孔分布的結(jié)果。如圖4所示，可知納米纖維的克重越從7gsm增加至14gsm，平均微孔大小就越減少，而這是因?yàn)榧{米纖維的重量增加。
[0049](實(shí)施例2)
[0050]除了在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布上直接實(shí)施電紡絲，來形成在聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布上電紡絲的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)之外，通過與實(shí)施例1的方法相同的方法，來獲得聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)與聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯無紡布的復(fù)合體之后，通過以140°C加熱的輥對(duì)上述復(fù)合體實(shí)施壓延，來制備了蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜。此時(shí)確認(rèn)到，所制成的納米纖維也與實(shí)施例1相似地，平均直徑為400nm至500nm,并且可以確認(rèn)壓延后納米纖維以無斷開或脫離的方式均勻地進(jìn)行復(fù)合化。
[0051](比較例)
[0052]為了比較，使用僅由克重為70gsm的聚偏氟乙烯納米纖維網(wǎng)形成的膜，來將蛋白質(zhì)印跡與實(shí)施例1相同地實(shí)施。
[0053]蛋白質(zhì)印跡試齡
[0054]利用實(shí)施例1和實(shí)施例2的樣品，來實(shí)施了蛋白質(zhì)印跡。
[0055]首先，將實(shí)施例1中制成的樣品以長(zhǎng)X寬分別為8cmX9cm的方式預(yù)先切割，并以在凝膠(gel)內(nèi)蛋白質(zhì)與膜進(jìn)行疏水性結(jié)合(hydro phobic interaction)的方式浸潰于100%的甲醇約I分鐘來進(jìn)行活性化。
[0056]將如此進(jìn)行活性化的膜移到轉(zhuǎn)移緩沖溶液(IXtransfer buffer)之后，放置了10分鐘。此時(shí)，上述轉(zhuǎn)移緩沖溶液由3.03g/L的三羥甲基氨基甲烷(trisma-base)、14.4g/L的甘氨酸(Glycine)、20%甲醇(200ml/L)組成。將要轉(zhuǎn)移的凝膠稍微浸濕在轉(zhuǎn)移緩沖溶液中，并以注意防止在膜上產(chǎn)生氣泡并放在上面。使凝膠與膜緊貼之后，在雙面貼預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖溶液浸濕的3M紙(3M paper),并安裝于轉(zhuǎn)移試劑盒(transfer kit)。
[0057]使用微型凝膠(Min1-gel)轉(zhuǎn)移試劑盒來在100V條件下實(shí)施了 I小時(shí)的轉(zhuǎn)移，為了阻斷此時(shí)產(chǎn)生的熱，將轉(zhuǎn)移容器(transfer tank)放置在冰中而實(shí)施該轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，拆卸裝置，分離膜，并稍微沾上1XTBST(0.05%與20%之間的三羥甲基氨基甲烷緩沖生理鹽水(t ris-buffered saline))。此時(shí)，TBST 的結(jié)構(gòu)由 0.2M 的 Tris pH8(24.2g 的三輕甲基氨基甲燒(trisma base)) > 1.37M NaCl (80g NaCl)以及調(diào)整成ρΗ7.6 的濃HCl (AdjustpH7.6by conc HCl)來組成。
[0058]此時(shí)，從口腔上皮細(xì)胞腫瘤KB細(xì)胞株提取的總蛋白質(zhì)濃度為20μ g、10l.! g、5y g、
2.5 μ g以及l(fā)ug,并利用了 10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳凝膠(SDS-pagegel) ο整個(gè)轉(zhuǎn)移時(shí)間(transfer time)約為I小時(shí)40分鐘，阻斷時(shí)間為(blocking time)為I小時(shí)30分鐘。
[0059]檢測(cè)對(duì)象蛋白質(zhì)為β_肌動(dòng)蛋白(β-actin),第一抗體(first Antib ody)為從小鼠獲得的肌動(dòng)蛋白抗體(圣克魯茲(santa cruz), sc-47778)，以1: 5000將這些稀釋，從而在4°C溫度下與轉(zhuǎn)移膜反應(yīng)一天左右。之后，與作為結(jié)合有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)(從辣根提取的過氧化氫分解酶)的第二抗體(secondaryAntibody)的山羊抗小鼠 IgG-HRP (goat ant1-mouse IgG-HRP (圣克魯茲(santa cruz)，sc-2005，將小鼠免疫球蛋白注入于山羊而制成的抗體))進(jìn)行反應(yīng)，再放入作為對(duì)于辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)的基質(zhì)的過氧化氫溶液(peroxide solution)和魯米諾增強(qiáng)劑溶液(Lumino IEnhancer Solution)(借助過氧化氫分解酶分解的氧自由基使魯米諾(Luminol)氧化，并發(fā)出熒光；LF-QC1010、阿博福倫泰爾(ABFR0 NTIER)公司、韓國(guó)(Korea))并使它們反應(yīng)I分鐘。與基質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)的轉(zhuǎn)移膜在X射線(X_ray)膜露出2分鐘，來確認(rèn)了肌動(dòng)蛋白蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0060]圖5示出了使用本發(fā)明的實(shí)施例1中制成的復(fù)合體膜來施行蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。如圖5所示,在本發(fā)明的實(shí)施例1中，即使納米纖維的克重分別變?yōu)?gsm、9gsm以及14gsm,蛋白質(zhì)印跡結(jié)果沒有太大的變化，且所有樣品中明確又突出地出現(xiàn)了帶。只是，在納米纖維的克重為7gsm的情況下，即使在蛋白質(zhì)濃度(protein concentration)比較低的2.5 μ g中，也較弱，但由于出現(xiàn)檢測(cè)帶，因而可以確認(rèn)檢測(cè)靈敏度稍微優(yōu)秀的事實(shí)。
[0061]從這種結(jié)果可知，即使在根據(jù)本發(fā)明將納米纖維網(wǎng)與無紡布接合而進(jìn)行復(fù)合化來使納米纖維的克重少的情況下，當(dāng)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法時(shí)，也不引起處理性惡化的問題，反而，若納米纖維的克重變少，則膜的氣孔度增加，使得蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度提高。由此，根據(jù)本發(fā)明，可提供降低工序費(fèi)用，且檢測(cè)靈敏度優(yōu)秀的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜。
[0062]圖6示出了使用本發(fā)明的實(shí)施例1的7gsm與比較例的樣品來實(shí)施蛋白質(zhì)印跡的比較結(jié)果。如圖6所示，與由納米纖維單獨(dú)形成的膜(比較例)的情況相比，在本發(fā)明的情況下，出現(xiàn)了相對(duì)更大更清晰的印跡大小。從這種結(jié)果可知，與比較例相比，在本發(fā)明的情況下，還可以僅用更少量的蛋白質(zhì)來進(jìn)行檢測(cè)，因而對(duì)于蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度更優(yōu)秀。
[0063]以上，例舉特定的優(yōu)選的實(shí)施例來圖示并說明了本發(fā)明，但本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，在不脫離本發(fā)明的精神的范圍內(nèi)，能夠由本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員進(jìn)行各種變更和修改。
[0064] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性[0065]存在少量的蛋白質(zhì)的特定物質(zhì)的情況下，本發(fā)明也能夠適用于可容易地進(jìn)行檢測(cè)的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，包括: 將聚偏氟乙烯類高分子物質(zhì)溶解于溶劑中，來制備紡絲溶液的步驟； 通過電紡絲方法來從上述紡絲溶液中獲得聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)的步驟；以及 將獲得的上述聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化，來獲得蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，上述聚偏氟乙烯類高分子物質(zhì)由選自包含均聚物及共聚物聚偏氟乙烯的組中的一種或兩種以上復(fù)合--? 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，與上述聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)進(jìn)行復(fù)合化的無紡布為選自包含聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚酯以及聚丙烯類的組中的一種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，上述納米纖維的含量在Igsm至50gsm的范圍內(nèi)，上述納米纖維的平均微孔的大小在0.Ιμπι至Ι.Ομηι的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，上述聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化是將聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布貼合來進(jìn)行復(fù)合化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，上述聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化是在上述無紡布上直接紡絲聚偏氟乙烯類高分子納米纖維來進(jìn)行復(fù)合化的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，上述聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化是通過選自壓接、加壓、壓延、軋制、熱接合以及超聲波接合中的一種方法來執(zhí)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，上述聚偏氟乙烯類高分子納米纖維網(wǎng)與無紡布的復(fù)合化伴隨有60至200°C溫度下的熱處理。
9.一種蛋白質(zhì)印跡用復(fù)合膜，其特征在于，將通過電紡絲方法制成的納米纖維網(wǎng)與無紡布進(jìn)行復(fù)合化，使得納米纖維的含量在Igsm至50gsm的范圍內(nèi)，納米纖維的平均微孔的大小在0.1 μ m至1.0 μ m的范圍內(nèi)。
【文檔編號(hào)】G01N33/544GK103930784SQ201280048052
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月4日
【發(fā)明者】金燦, 趙唯辰, 徐尚哲, 徐寅踴 申請(qǐng)人:阿莫綠色技術(shù)有限公司, 阿莫麥迪有限公司