一種分離提取糜蛋白酶的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明闡述一種分離提取糜蛋白酶的方法。該制備方法包括以下工藝步驟：(1)結(jié)晶；(2)活化；(3)鹽析；(4)透析；(5)凍干。本發(fā)明建立起一套規(guī)模化的生產(chǎn)工藝，具有簡(jiǎn)單、低成本等優(yōu)點(diǎn)，制備的糜蛋白酶精品效價(jià)高達(dá)1200單位/毫克以上，符合《中國(guó)藥典》(2010版)要求，具有極大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種分離提取糜蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，設(shè)計(jì)藥用糜蛋白酶的生化分離技術(shù)。具體地說(shuō)是采用鹽析、多重結(jié)晶結(jié)合透析等技術(shù)來(lái)提取糜蛋白酶。
【背景技術(shù)】
[0002]糜蛋白酶是從牛胰腺或豬胰腺中分離純化得到的一種蛋白酶。它在藥理和臨床上的功用主要有兩方面:一、消炎:對(duì)各種炎癥、炎性水腫、血腫、潰瘍及血栓等有較好療效。二、抗癌:能促進(jìn)抗癌藥物向病灶滲透，促使化療藥物發(fā)揮作用，局部大劑量使用時(shí)作用更強(qiáng)。大劑量使用可治療多種腫瘤，如乳腺癌、宮頸癌、胃癌等，并且無(wú)任何毒副作用或不良反應(yīng)。
[0003]中國(guó)專(zhuān)利CN1944641A公開(kāi)了一種分離提取糜蛋白酶的方法，采用親和層析工藝從糜蛋白酶原生產(chǎn)高純度糜蛋白酶，但是正如中國(guó)專(zhuān)利CN1013025B分析，也存在一些缺點(diǎn)，最主要的，親和層析介質(zhì)昂貴，可重復(fù)使用次數(shù)少，介質(zhì)的使用量大，不適合規(guī)模化大生產(chǎn)。而中國(guó)專(zhuān)利CN1013025B雖然解決了親和層析的不足，也能獲得高比活的糜蛋白酶，但同樣，比較起傳統(tǒng)工藝來(lái)，生產(chǎn)成本太高?？墒请S著糜蛋白酶的應(yīng)用廣泛，使得國(guó)際市場(chǎng)對(duì)本產(chǎn)品的需求不斷擴(kuò)大，質(zhì)量要求上也更加嚴(yán)格，要求產(chǎn)品有更高的質(zhì)量:《中國(guó)藥典》(2010版)規(guī)定，糜蛋白酶的效價(jià)不得少于1000單位/毫克。針對(duì)效價(jià)提高的要求，本發(fā)明對(duì)傳統(tǒng)工藝進(jìn)行了改進(jìn)和創(chuàng)新。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了生產(chǎn)高質(zhì)量的糜蛋白酶而又降低生產(chǎn)成本，對(duì)傳統(tǒng)工藝加以改造，尤其是參數(shù)的改造，提供了一種分離提取糜蛋白酶的方法，該方法包括如下步驟:
[0005](I)結(jié)晶工序
[0006]投料:取糜蛋白酶粗品，按5~9ml/g的比例加水溶解，調(diào)pH值至2.5~3.5，攪拌8~10小時(shí)后，靜置12~16小時(shí)。
[0007]結(jié)晶I
[0008]靜置結(jié)束后攪拌，并調(diào)pH值至2.0~3.0。按I~3ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，攪拌10~30分鐘，調(diào)pH值至4.5~5.5，置20~28°C條件下，保溫40~48小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，濾液棄去。
[0009]結(jié)晶II
[0010]按2~4ml/g的比例加入水溶解濾餅,調(diào)pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調(diào)pH值至4.5~5.5，置20~28°C條件下，保溫20~24小時(shí),過(guò)濾,收集濾餅。
[0011]結(jié)晶III
[0012]按2~4ml/g的比例加入水溶解濾餅,調(diào)pH值至2.0~3.0,再按0.5~2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調(diào)pH值至4.5~5.5，置20~28°C條件下，保溫20~24小時(shí),過(guò)濾,收集濾餅。
[0013]結(jié)晶IV
[0014]按2~4ml/g的比例加入水溶解濾餅，調(diào)pH值至2.0~3.0，再按0.5~2.0ml/g的比例加入飽和硫酸銨溶液，調(diào)pH值至4.5~5.5，置20~28°C條件下，保溫20~24小時(shí),過(guò)濾,收集濾餅。
[0015]⑵活化工序
[0016]稱(chēng)量濾餅重量，按2~4ml/g的比例加入水溶解，調(diào)pH值至7.0~8.5。
[0017]再按0.5~1.5ml/g濾餅的比例加入磷酸鹽緩沖液,攪拌,調(diào)節(jié)pH值至7.0~8.5。加入活化劑胰蛋白酶，比例為3~8mg/100ml料液，活化60~80小時(shí)。
[0018]⑶鹽析工序
[0019]活化結(jié)束后調(diào)pH值至3.0~5.0,量取活化液體積，按400~600g/L的比例加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，放置12~16小時(shí)。
[0020]過(guò)濾，棄濾液，收集濾餅。
[0021](4)透析工序
[0022]濾餅按I~1.5ml/g的比例加入水，攪拌溶解，透析4~6天。
[0023](5)凍干工序
[0024]收集、合并透析液，過(guò)濾，量取體積，調(diào)pH值至5.5~6.7，裝盤(pán)、凍干。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0026]本發(fā)明采用鹽析、多重結(jié)晶結(jié)合透析等技術(shù)來(lái)提取糜蛋白酶，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)工藝的改進(jìn)和創(chuàng)新，不僅生產(chǎn)出了高質(zhì)量的糜蛋白酶，同時(shí)又具有簡(jiǎn)單、低成本等優(yōu)點(diǎn)。
[0027]本發(fā)明已建立起一套規(guī)?；纳a(chǎn)工藝，制備的糜蛋白酶精品效價(jià)高達(dá)1200單位/毫克以上，符合《中國(guó)藥典》(2010版)要求，具有極大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0029]實(shí)施例1
[0030](I)結(jié)晶工序
[0031]投料:取糜蛋白酶粗品20.0gJP 100ml純化水溶解，并加適量2.5mol/L H2S04溶液調(diào)節(jié)PH2.6，攪拌8小時(shí)后，靜置12小時(shí)。
[0032]結(jié)晶I
[0033]靜置結(jié)束后攪拌，并加2.5mol/L H2S04溶液調(diào)ρΗ2.I。加入飽和硫酸銨溶液20ml，攪拌10分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)pH4.6，置20°C條件下，保溫40小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重37.6g,濾液棄去。
[0034]結(jié)晶II
[0035]濾餅加76ml純化水溶解，用2.5mol/l硫酸調(diào)pH2.0,加飽和硫酸銨溶液18.8ml,用5mol/L NaOH調(diào)pH4.5，置20°C條件下，保溫20小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重33.lg。
[0036]結(jié)晶III
[0037]濾餅加66.2ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調(diào)pH2.0，加飽和硫酸銨溶液16.6ml,用5mol/L NaOH`調(diào)pH4.5，置20°C條件下，保溫20小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重30.7g。
[0038]結(jié)晶IV
[0039]濾餅加61.4ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調(diào)pH2.0，加飽和硫酸銨溶液15.4ml,用5mol/L NaOH調(diào)pH4.5，置20°C條件下，保溫20小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重30.4g0
[0040](2)活化工序
[0041]加60.8ml純化水溶解濾餅，加5mol/L NaOH溶液調(diào)ρΗ7.2。
[0042]加入磷酸鹽緩沖液15.2ml，攪拌片刻，調(diào)ρΗ7.2。加入活化劑胰蛋白酶0.5mg,活化60小時(shí)。
[0043](3)鹽析工序
[0044]用2.5mol/L硫酸調(diào)pH3.1，量取活化液體積155ml，加入固體硫酸銨62g進(jìn)行鹽析，放置12小時(shí)，過(guò)濾，棄濾液，收集濾餅，稱(chēng)重32g。
[0045](4)透析
[0046]濾 餅加入純化水32ml，攪拌溶解，透析4天。
[0047](5)凍干工序
[0048]收集、合并透析液，過(guò)濾，量取體積153ml,調(diào)節(jié)pH5.6,裝盤(pán)I盤(pán)、凍干,稱(chēng)重7.7g。
[0049](6)根據(jù)《中國(guó)藥典》(2010版)規(guī)定的糜蛋白酶效價(jià)檢測(cè)法對(duì)本品進(jìn)行檢驗(yàn)，本品的效價(jià)為1485單位/毫克。
[0050]實(shí)施例2
[0051](I)結(jié)晶工序
[0052]投料:取糜蛋白酶粗品20.3g，加180ml純化水溶解，并加適量2.5mol/L H2S04溶液調(diào)節(jié)PH3.2，攪拌10小時(shí)后，靜置15小時(shí)。
[0053]結(jié)晶I
[0054]靜置結(jié)束后攪拌，并加2.5mol/L H2S04溶液調(diào)ρΗ2.8。加入飽和硫酸銨溶液60ml，攪拌30分鐘，用5mol/L NaOH調(diào)pH5.4，置28°C條件下，保溫48小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重37.9g,濾液棄去。
[0055]結(jié)晶II
[0056]濾餅加151ml純化水溶解，用2.5mol/l硫酸調(diào)pH3.0，加飽和硫酸銨溶液75.8ml，用5mol/L NaOH調(diào)ρΗ5.3，置26°C條件下，保溫24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重33.3g。
[0057]結(jié)晶III
[0058]濾餅加133.2ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調(diào)pH3.0，加飽和硫酸銨溶液66.6ml,用5mol/L NaOH調(diào)pH5.3，置26 V條件下，保溫24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重30.8g0
[0059]結(jié)晶IV
[0060]濾餅加123.2ml純化水溶解，用2.5mol/L硫酸調(diào)pH3.0，加飽和硫酸銨溶液41.6ml,用5mol/L NaOH調(diào)pH5.3，置26 V條件下，保溫24小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅，稱(chēng)重30.6g0
[0061](2)活化工序
[0062]加122.4ml純化水溶解濾餅，加5mol/L NaOH溶液調(diào)pH8.4。[0063]加入磷酸鹽緩沖液61.2ml，攪拌片刻，調(diào)pH8.4。加入活化劑胰蛋白酶4.8mg,活化80小時(shí)。
[0064](3)鹽析工序
[0065]用2.5mol/L硫酸調(diào)pH4.8，量取活化液體積159ml，加入固體硫酸銨79g進(jìn)行鹽析，放置16小時(shí)，過(guò)濾，棄濾液，收集濾餅，稱(chēng)重33g。
[0066](4)透析
[0067]濾餅加入純化水49.5ml，攪拌溶解，透析6天。
[0068](5)凍干工序
[0069]收集、合并透析液，過(guò)濾，量取體積155ml,調(diào)節(jié)pH6.6,裝盤(pán)I盤(pán)、凍干,稱(chēng)重7.8g。
[0070](6)根據(jù)《中國(guó)藥典》(2010版)規(guī)定的糜蛋白酶效價(jià)檢測(cè)法對(duì)本品進(jìn)行檢驗(yàn)，本品的效價(jià)為1378單位/毫克。
[0071]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種分離提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)結(jié)晶；(2)活化；(3)鹽析；(4)透析；(5)凍干。
2.權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，各步驟具體為: (1)結(jié)晶工序 糜蛋白酶粗品加水溶解，調(diào)PH值至2.5~3.5，靜置8~12小時(shí)；結(jié)晶:將糜蛋白酶粗品溶解液再調(diào)PH值至2.0~3.0 ;加入飽和硫酸銨溶液，調(diào)pH值至4.0~6.0,置25±3°C條件下，保溫20~48小時(shí)，過(guò)濾，收集濾餅； 濾餅加水溶解，重復(fù)上述結(jié)晶操作3次，收集濾餅； (2)活化工序 用水溶解上步中所得濾餅，調(diào)pH值至7.0~9.0 ; 加磷酸鹽緩沖液，調(diào)PH值至7.0~9.0 ;加入活化劑，活化60~80小時(shí)； (3)鹽析工序 活化液調(diào)pH值至3.0~5.0，加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析，過(guò)濾，收集濾餅； (4)透析工序 濾餅加水溶解，放透析袋，透析4~6天。 (5)凍干工序` 收集、合并透析液，過(guò)濾，調(diào)節(jié)pH值至5.5~6.7,裝盤(pán)、凍干。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分離提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，飽和硫酸銨溶液與粗品溶液的體積比為I~3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分離提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(2)中加入活化劑的比例為3~8mg/100ml料液，活化60~80小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種分離提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述活化劑為膜蛋白酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分離提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(3)中活化液按400~600g/L的比例加入固體硫酸銨進(jìn)行鹽析。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分離提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，濾餅加水溶解的比例為I~1.5ml/g。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種分離提取糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述步驟(5)中凍干前PH調(diào)節(jié)為6.0~6.5。
9.一種糜蛋白酶，其特征在于，所述糜蛋白酶通過(guò)權(quán)利要求1-8任意之一的方法制備得到，其效價(jià)為1200~1500單位/毫克。
【文檔編號(hào)】C12N9/76GK103725667SQ201310638707
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】劉乃山, 李靜潔, 安迪, 劉君 申請(qǐng)人:青島康原藥業(yè)有限公司