一種T7 RNA 聚合酶介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明主要屬于高等生物體基因組編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建方法。所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7啟動子的高度特異性識別原理，首先構(gòu)建T7啟動子?sgRNA，將T7啟動子?sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒以及T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞，T7 RNA聚合酶催化T7啟動子啟動sgRNA的轉(zhuǎn)錄，從而引導(dǎo)Cas9在靶位點處，進(jìn)行切割，完成基因編輯過程。本發(fā)明所述方法利用T7啟動子表達(dá)sgRNA，簡化了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計步驟，使得更多的人能夠快速簡便使用CRISPR/Cas9這一基因編輯工具研究感興趣的基因位點。
【專利說明】一種T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的CR I SPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明主要屬于高等生物體基因組編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種T7RNA聚合酶介導(dǎo)的CRI SPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]打靶高等動物基因組位點的基因編輯工具的發(fā)現(xiàn)和改造對于基因工程和遺傳工程的研究應(yīng)用都有很大意義。高等生物體的基因網(wǎng)絡(luò)錯綜復(fù)雜，能改造出一個簡便且高效的可適用于高等生物體基因組編輯的工具可以為高等生物遺傳研究提供很大的幫助。近年來，細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)正被廣泛研究以及應(yīng)用。
[0003]CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由Cas9核酸內(nèi)切酶和單導(dǎo)向RNA(single guide RNA,sgRNA)組成的，sgRNA上有20bp的引導(dǎo)序列，是與基因組靶序列匹配的。
[0004]細(xì)菌的II型CRISPR/Cas系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因組編輯中，從釀膿鏈球菌中分離得到的SpCas9核酸內(nèi)切酶通過人工修飾的單個引導(dǎo)RNA(single-guide RNA，sgRNA)的導(dǎo)向作用可以打靶DNA序列的5 ’-N20-NGG-3 ’(N代表任何脫氧核苷酸堿基)，N20是與sgRNA的5 ’序列相同的20個喊基，NGG是PAM區(qū)(protospacer-ad jacent motif) <Xas9核酸內(nèi)切酶會在PAM附近的區(qū)域切害UDNA雙鏈，造成DNA雙鏈斷裂。這種可以人為修飾的導(dǎo)向RNA和基因組中PAM的高發(fā)率使得Cas9-sgRNA幾乎可以打靶所有的基因元件來實現(xiàn)基因組編輯。
[0005]現(xiàn)階段，普遍使用的基因編輯技術(shù)是將Cas9表達(dá)盒與sgRNA表達(dá)盒放在一個載體上打靶特定位點，這種方法使更換sgRNA上的引導(dǎo)序列變得復(fù)雜，需要通過II型酶酶切和引物退火的方式更換載體上sgRNA中20bp引導(dǎo)序列，構(gòu)建出一個新的打革El載體，該操作過程繁瑣，限制了 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的普及與應(yīng)用。
[0006]現(xiàn)有研究中，已經(jīng)有學(xué)者直接化學(xué)合成crRNA:tracrRNA，通過將其與Cas9共顯微注射到小鼠受精卵中，成功得到了帶有功能性的表達(dá)盒的基因敲入小鼠。但是化學(xué)合成全長crRNA: tracrRNA難度高并且耗資較高，不是適合廣泛推廣使用。
[0007]針對上述問題，亟需開發(fā)一種簡便、高效、成本低且適用于高等生物的基因編輯工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對上述問題，本發(fā)明提供一種涉及T7RNA聚合酶介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建方法，所述方法將T7啟動子-sgRNA片段、Cas9表達(dá)質(zhì)粒和T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入細(xì)胞，T7RNA聚合酶可以催化T7啟動子啟動sgRNA的轉(zhuǎn)錄，從而引導(dǎo)Cas9在靶位點出進(jìn)行切割。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0010]一種應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，所述方法基于T7RNA聚合酶和T7啟動子的高度特異性識別原理，首先構(gòu)建T7啟動子-sgRNA，將T7啟動子-sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒以及T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞，T7RNA聚合酶催化T7啟動子啟動sgRNA的轉(zhuǎn)錄，從而引導(dǎo)Cas9在靶位點處進(jìn)行切割，完成基因編輯。
[0011 ]進(jìn)一步地，所述構(gòu)建T7啟動子-SgRNA具體為:選取上游引物與下游引物，以Cas9_sgRNA共表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴增，得到T7啟動子-sgRNA的PCR產(chǎn)物。
[0012]進(jìn)一步地，所述上游引物包括T7啟動子序列、20bp sgRNA引導(dǎo)序列以及20bpsgRNA scaffold序列;所述下游引物為一段與sgRNA scaffold序列3’_5’方向匹配的序列。
[0013]進(jìn)一步地，構(gòu)建所述T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒具體為:
[0014]提取細(xì)菌BL21菌株的基因組，設(shè)計用于擴增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7RNA?014和下游引物了71?嫩pol-R，通過PCR反應(yīng)得到T7RNA聚合酶PCR產(chǎn)物；
[0015]在所述上游引物T7RNA pol_F中引入BamHI酶切位點，在所述下游引物T7RNA pol-R中引入EcoR頂每切位點；
[0016]利用引入的BamHI和EcoRI酶切位點，將T7RNA聚合酶基因片段克隆進(jìn)pcDNA3.1( + )載體中，得到T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒。
[0017]進(jìn)一步地，將T7啟動子_sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒以及T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞具體為:利用轉(zhuǎn)染試劑將T7啟動子-sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒、T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒以及報告載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，紅色熒光數(shù)代表轉(zhuǎn)染效率，綠色熒光數(shù)代表系統(tǒng)的工作效率，通過觀察熒光數(shù)來檢測系統(tǒng)的工作效率。
[0018]本發(fā)明的有益技術(shù)效果:
[0019](I)本發(fā)明利用T7RNA聚合酶專一性識別T7啟動子的原理，利用T7啟動子啟動下游sgRNA的轉(zhuǎn)錄，只需合成帶有T7啟動子序列的sgRNA序列，即可利用PCR反應(yīng)，將T7-sgRNA以PCR產(chǎn)物的形式轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，從而引導(dǎo)Cas9成功打靶基因組位點，發(fā)揮CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯功能的同時提供一種更換sgRNA結(jié)構(gòu)中20bp引導(dǎo)序列的簡單方法。
[0020](2)本發(fā)明將T7RNA聚合酶和T7啟動子的高度特異性識別的原理與CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向切割功能結(jié)合起來，利用T7啟動子表達(dá)sgRNA，簡化了 CRI SPR/Cas9系統(tǒng)的設(shè)計步驟，使得能夠快速簡便使用CRISPR/Cas9這一基因編輯工具研究感興趣的基因位點。
[0021](3)本發(fā)明將Cas9和T7RNA聚合酶由兩個載體分別表達(dá)，T7RNA聚合酶能特異性識別并催化T7啟動子啟動，通過PCR反應(yīng)得到的大量的“T7啟動子-sgRNA”產(chǎn)物，T7啟動子啟動下游s gRNA轉(zhuǎn)錄，成功轉(zhuǎn)錄的s gRNA將引導(dǎo)Ca s 9到革E位點處進(jìn)行切割。
[0022](4)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述方法構(gòu)建方便，適用于高等動物等。
【附圖說明】
[0023]圖1為構(gòu)建T7啟動子-sgRNA過程中所用上游引物的示意圖；
[0024]圖2為Cas9表達(dá)載體；
[0025]圖3為T7RNA聚合酶表達(dá)載體。
【具體實施方式】
[0026]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0027]相反，本發(fā)明涵蓋任何由權(quán)利要求定義的在本發(fā)明的精髓和范圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。進(jìn)一步，為了使公眾對本發(fā)明有更好的了解，在下文對本發(fā)明的細(xì)節(jié)描述中，詳盡描述了一些特定的細(xì)節(jié)部分。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說沒有這些細(xì)節(jié)部分的描述也可以完全理解本發(fā)明。
[0028]實施例1
[0029]一種應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，所述方法基于T7RNA聚合酶和T7啟動子的高度特異性識別原理，首先構(gòu)建T7啟動子-sgRNA，將T7啟動子-sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒以及T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞，T7RNA聚合酶催化T7啟動子啟動sgRNA的轉(zhuǎn)錄，從而引導(dǎo)Cas9在靶位點出進(jìn)行切割，完成基因編輯。
[0030]T7RNA聚合酶是一種RNA聚合酶，專門催化5，-3 ’方向的RNA的形成過程;T7RNA聚合酶具有高度啟動子專一性，只轉(zhuǎn)錄T7噬菌體中位于T7啟動子下游的DNA片段或DNA復(fù)制品。
[0031]T7啟動子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流啟動子，啟動子功能強大且專一性高，是原核表達(dá)的首選啟動子。
[0032]所述方法具體為:
[0033](I)構(gòu)建T7啟動子-sgRNA:選取上游引物與下游引物，以Cas9-sgRNA共表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴增，得到T7啟動子-sgRNA(即T7promoter-sgRNA)的PCR產(chǎn)物；
[0034]所述Cas9_sgRNA共表達(dá)載體為現(xiàn)有技術(shù)中常用的Cas9_sgRNA共表達(dá)載體(px330)；
[0035]所述上游引物包括T7啟動子序列、20bp sgRNA引導(dǎo)序列以及20bp sgRNAscaffold序列；在本實施例中，所述上游引物為合成的靶向CCR5a位點的上游引物T7-sgRNA(CCR5a)-F，該引物含有T7啟動子序列、20bp靶向CCR5a位點的sgRNA引導(dǎo)序列以及20bpsgRNA scaffold序列(如圖1所示)；
[0036]所述下游引物(SgRNA-R)為一段與sgRNA scaffold序列3’_5’方向匹配的序列。
[0037](2)T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒的合成:
[0038]提取細(xì)菌BL21菌株的基因組，設(shè)計用于擴增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7RNApol-F和下游引物T7RNA pol-R，通過PCR反應(yīng)得到T7RNA聚合酶PCR產(chǎn)物；
[0039]在所述上游引物T7RNA pol_F中引入BamHI酶切位點，在所述下游引物T7RNA pol-R中引入EcoR頂每切位點；
[0040]所述上游引物T7RNApol-F 為:T7RNApol-BamH1-F:GCTGGATCCATGAACACGATTAACATCGCTAAG；
[0041 ]所述下游弓I 物 T7RNA pol_R 為:T7RNA pol—EcoRI—R:GACGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG；
[0042] 利用引入的BamHI和EcoRI酶切位點，將T7RNA聚合酶基因片段克隆進(jìn)pcDNA3.1( + )載體中，得到T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒，命名為pcDNA3.1-CMV-T7RNA pol(如圖2所示)；
[0043 ] (3)將T7啟動子-sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒以及T7RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞具體為:
[0044]I)利用廈門太陽馬公司的梭華so-f ast轉(zhuǎn)染試劑，將T7啟動子-sgRNA的PCR產(chǎn)物、表達(dá)Cas9的載體P113.7-CMV_hSpCas9 (如圖3所示)、表達(dá)T7RNA聚合酶的載體(pcDNA3.1 -CMV-T7RNA pol)以及報告載體Re.SSA(EFla).CCR5a共轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞，紅色熒光數(shù)代表轉(zhuǎn)染效率(單位面積內(nèi)紅色熒光數(shù)越多代表轉(zhuǎn)染效率越高)，綠色熒光數(shù)代表系統(tǒng)的工作效率(單位面積內(nèi)綠色熒光越多代表系統(tǒng)工作效率越高)，通過觀察熒光來檢測系統(tǒng)的工作效率；
[0045]2)利用T7啟動子啟動sgRNA的轉(zhuǎn)錄，對于sgRNA的轉(zhuǎn)染使用濃度做了梯度試驗，并選擇工作效率最尚的濃度進(jìn)彳丁后續(xù)的實驗；
[0046]3)基因組水平的檢測:利用廈門太陽馬公司的梭華so-fast轉(zhuǎn)染試劑，將T7_sgRNA的PCR產(chǎn)物、表達(dá)Cas9的載體(pll3.7-CMV-hSpCas9)、表達(dá)T7RNA聚合酶的載體(pcDNA3.1-CMV-T7RNA pol)以及可以通過puromycin篩選并富集基因編輯過的陽性細(xì)胞的報告載體pB-CMV-DsRed-CAG-CCR5a.200bp repeat.Puro-T2A_GFP共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。
[0047]4)轉(zhuǎn)染48h后向培養(yǎng)基(DEME)中加入終濃度為0.3yg/ml的puromycin并每天更換新鮮的培養(yǎng)基(DMEM)以去除死掉的細(xì)胞，連續(xù)篩選五天后撤掉puromycin，等待細(xì)胞長成細(xì)胞單克隆后挑取細(xì)胞單克隆入48孔細(xì)胞培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)；
[0048]5)待48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞單克隆長大后提取單克隆基因組，利用實驗室已有的CCR5a位點的上下游檢測引物CCR5a-F、CCR5a-R，以細(xì)胞單克隆基因組為模板，擴增細(xì)胞單克隆基因組的CCR5a位點基因片段；
[0049]6)PCR產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖膠檢測產(chǎn)物的特異性，切下特定大小的條帶并利用omega公司的DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA回收，回收產(chǎn)物測序公司進(jìn)行測序。
[0050]測序結(jié)果顯示:80%的樣品中CCR5a位點PAM附近都有堿基的插入和缺失(Indel)，該結(jié)果證明本發(fā)明可以成功地實現(xiàn)特定位點的基因編輯。
【主權(quán)項】
1.一種應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，其特征在于，所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7啟動子的高度特異性識別原理，首先構(gòu)建T7啟動子-SgRNA，將T7啟動子-sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒以及T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞，T7 RNA聚合酶催化T7啟動子啟動sgRNA的轉(zhuǎn)錄，從而引導(dǎo)Cas9在靶位點處進(jìn)行切割，完成基因編輯。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，其特征在于，所述構(gòu)建T7啟動子-sgRNA具體為:選取上游引物與下游引物，以Cas9-sgRNA共表達(dá)載體為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)擴增，得到T7啟動子-sgRNA的PCR產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，其特征在于，所述上游引物包括T7啟動子序列、20bp sgRNA引導(dǎo)序列以及20bp sgRNA scaffold序列;所述下游引物為一段與sgRNA scaffold序列3’-5’方向匹配的序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，其特征在于，構(gòu)建所述T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒具體為: 提取細(xì)菌BL21菌株的基因組，設(shè)計用于擴增T7RNA聚合酶基因的上游引物T7 RNA pol-F和下游引物T7 RNA pol-R，通過PCR反應(yīng)得到T7RNA聚合酶PCR產(chǎn)物； 在所述上游引物T7 RNA pol-F中引入BamHI酶切位點，在所述下游引物T7 RNA pol-R中引入EcoR頂每切位點； 利用引入的BamHI和EcoRI酶切位點，將T7 RNA聚合酶基因片段克隆進(jìn)pcDNA3.1 ( + )載體中，得到T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的方法，其特征在于，將T7啟動子-sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒以及T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入細(xì)胞具體為:利用轉(zhuǎn)染試劑將T7啟動子-sgRNA、Cas9表達(dá)質(zhì)粒、T7 RNA聚合酶表達(dá)質(zhì)粒以及報告載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，紅色熒光數(shù)代表轉(zhuǎn)染效率，綠色熒光數(shù)代表系統(tǒng)的工作效率，通過觀察熒光數(shù)來檢測系統(tǒng)的工作效率。
【文檔編號】C12N15/85GK105861552SQ201610261461
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月25日
【發(fā)明人】張智英, 邢佳妮, 閆強, 徐坤
【申請人】西北農(nóng)林科技大學(xué)