本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種采用多聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對Ⅰ群禽腺病毒進(jìn)行快速檢測的通用PCR引物、通用PCR方法及檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，病毒粒子無囊膜，直徑約70-90nm，呈十二面體對稱，由衣殼、纖突、核酸芯髓及相關(guān)蛋白構(gòu)成。基因組為單分子、線狀、雙鏈DNA，大小不一，在26kb-45kb之間。根據(jù)群特異性抗原的不同，禽腺病毒可分為3群：I群、Ⅱ群和Ⅲ群。其中I群禽腺病毒包括從雞、火雞、鵝及其它禽類分離獲得的腺病毒，其包含12個血清型(1-11，8a，8b)和5個基因型(A-E)，各血清型之間有一定交叉保護(hù)。病毒可經(jīng)糞便、氣管和鼻腔粘膜水平傳播，也可發(fā)生垂直傳播，主要為種雞產(chǎn)蛋期感染后1～2周內(nèi)經(jīng)蛋傳播。雞群感染后表現(xiàn)為包涵體肝炎和心包積液的臨床癥狀，引起死亡率在10％-80％之間，近年來國內(nèi)報道此病毒感染有增多的趨勢。目前國內(nèi)市場上沒有商品化的疫苗，增加了FAdV-I的預(yù)防和控制的難度。

FAdV-I的診斷方法主要包括病毒的分離與鑒定，瓊脂擴(kuò)散試驗，酶聯(lián)免疫吸附試驗等。病毒的分離與鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可信，但是檢測周期長，操作繁瑣，不利于疾病的快速診斷。

生物技術(shù)的飛速發(fā)展極大地推動了生命科學(xué)各個領(lǐng)域的發(fā)展，疾病的診斷、病原的檢測已從細(xì)胞水平進(jìn)入分子水平。禽腺病毒分子結(jié)構(gòu)與基因序列分析的日益深入為其特異性診斷技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)不同基因型毒株存在的分子結(jié)構(gòu)差異，相繼建立了特異、快速的分子診斷技術(shù)，包括核酸探針技術(shù)、限制性核酸內(nèi)切酶分析和基因片段的體外擴(kuò)增技術(shù)等。這些技術(shù)不僅應(yīng)用于FAdV的檢測、鑒定和特性研究，還可以追蹤病毒的來源及流行情況。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外擴(kuò)增特異性基因片段的技術(shù)，在疾病的檢測方面有著廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用。PCR能夠選擇性地將病毒基因組的一個特異性短片段放大10萬倍以上，極大地增強(qiáng)了檢測的敏感性。PCR方法的建立極大地提高了疾病的診斷速度，對病毒的流行病學(xué)調(diào)查具有重要的應(yīng)用價值。大量研究結(jié)果證明，利用特異性引物對FAdV-I進(jìn)行PCR擴(kuò)增不失為一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測Ⅰ群禽腺病毒的通用PCR引物，以及使用了該引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測方法和檢測試劑盒，該PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測方法和檢測試劑盒操作簡便，通用性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高，成本低，可以同時進(jìn)行大批量樣本分析。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一對檢測Ⅰ群禽腺病毒的PCR引物，包括上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’(如序列表SEQ ID No.1所示)和下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’(如序列表SEQ ID No.2所示)，其中：上游引物中和下游引物中的Y、S、K和N均為簡并引物，Y＝C/T，S＝G/C，K＝G/T，N＝A/T/C/G。

本發(fā)明還提供了一種包含上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’和下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’的檢測試劑盒。

本發(fā)明還提供了一種檢測Ⅰ群禽腺病毒的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系，包括以下組分：

其中：上游引物為5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’，下游引物為5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’。20μM的上下游引物是指引物自身的濃度，而非其在PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中的終濃度。

在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實現(xiàn)方式中，所述反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；32個循環(huán)，每個循環(huán)為94℃45s，55℃45s，72℃35s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10min。

在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實現(xiàn)方式中，所述樣本取自待測菌懸液或禽類臨床病料，如：雞、火雞、鵝或其他禽類的臨床病料。

在上述反應(yīng)體系另外一種可能的實現(xiàn)方式中，當(dāng)樣本取自禽類臨床病料時，樣本總DNA提取前還包括樣本預(yù)處理的步驟，所述樣本預(yù)處理的方式為：取臟器組織樣本，將樣本在滅菌生理鹽水中研磨均勻并混懸，離心取上清。

本發(fā)明還提供了一種檢測Ⅰ群禽腺病毒的PCR方法，包括如下步驟：

1)樣本總DNA的提?。?/p>

2)利用上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’和下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’，對步驟1)所得的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3)分析步驟2)所得PCR產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物包含565bp的片段，則樣本為Ⅰ群禽腺病毒檢測陽性，否則為檢測陰性。即：需要對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶即為565bp的片段。

本發(fā)明以NCBI數(shù)據(jù)庫中FAdV-D分離株HBQ12(GenBank登錄號為KM096545)基因組序列作為參考，參照GenBank登錄的檢測不同基因型FAdV-I DNA polymerase基因的保守區(qū)序列設(shè)計和篩選特異性檢測引物。通過新型引物，擴(kuò)增FAdV-I的DNA polymerase基因中的保守區(qū)序列長度約565bp的核苷酸序列，上游引物對應(yīng)于DNA polymerase基因的7631bp-7650bp之間，下游引物對應(yīng)于DNA polymerase基因的8177bp-8194bp之間。整體思路為：提取樣本總DNA，利用本申請引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，采用下列反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃5min；32個循環(huán)(94℃45s，55℃45s，72℃35s)，最后經(jīng)過72℃10min延伸，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，利用紫外凝膠成像儀檢測目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為FAdV-I檢測陽性，否則為陰性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1)擴(kuò)增的目的片段位于FAdV-I的DNA polymerase基因的高度保守區(qū)，且核苷酸序列為565bp，敏感性好、操作方便、對不同基因型的FAdV-I均有較好檢出，即通用性好；

2)將FAdV-I病毒樣本DNA進(jìn)行10倍系列稀釋后，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行10000倍稀釋后利用本方法仍能檢測到FAdV-I特異性條帶，表明使用本申請引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測方法和檢測試劑盒具有較高的靈敏度；

3)使用本申請引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測方法和檢測試劑盒對其它常見禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒的檢測結(jié)果皆為陰性，沒有交叉反應(yīng)，表明使用本申請引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測方法和檢測試劑盒亦具有良好的特異性；

4)使用本申請引物的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系、PCR檢測方法和檢測試劑盒適用于養(yǎng)禽生產(chǎn)中進(jìn)行FAdV-I的檢測，具有高特異性、高靈敏度、高效率、低成本的特點，可在4h內(nèi)對臨床病料進(jìn)行快速鑒別診斷，克服了傳統(tǒng)檢測方法通過絨毛尿囊膜途徑接種于10-11日齡SPF雞胚，觀察雞胚絨毛尿囊膜是否增厚、出現(xiàn)痘斑，以及瓊脂擴(kuò)散試驗、包涵體觀察耗時較長等缺點。由于國內(nèi)疑似FAdV感染的病例有增多的趨勢且該病目前尚沒有商業(yè)化的疫苗，而國內(nèi)對于FAdV的了解和研究相對較少，而該方法適合大批量臨床樣本的分析與檢測，對FAdV-I的早期快速診斷，為進(jìn)一步開展全國范圍內(nèi)病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查研究提供可靠技術(shù)手段。

附圖說明

圖1是根據(jù)FAdV-I hexon基因所繪制的遺傳進(jìn)化樹，圖中●標(biāo)示出了不同基因型的FAdV-I代表性毒株，用于本方法的通用性檢測。

圖2是對不同基因型FAdV-I進(jìn)行檢測的電泳結(jié)果。點樣順序為M：DNA Maker II；P：陽性對照；N：陰性對照；1：JSJ13株(FAdV-C)；2：CHF13株(FAdV-C)；3：CELO(FAdV-A)；4：HBQ12株(FAdV-D)；5：340(FAdV-B)；6：SD株(FAdV-E)。

圖3是該引物對FAdV-I的靈敏度檢測電泳結(jié)果。點樣順序為M：DNA maker II；P：陽性對照；N：陰性對照；1：DNA稀釋10倍；2：DNA稀釋10²倍；3：DNA稀釋10³倍；4：DNA稀釋10⁴倍；5：DNA稀釋10⁵倍。

圖4是對其它常見禽病病原進(jìn)行檢測的電泳結(jié)果。其中M：DNA Maker II；P：陽性對照；N：陰性對照；1：H5亞型禽流感病毒；2：H7亞型禽流感病毒；3：H9亞型禽流感病毒；4：新城疫病毒(NDV)；5：傳染性支氣管炎病毒(IBV)；6：傳染性法氏囊病毒(IBDV)；7：禽呼腸孤病毒(REOV)；8：禽傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實施方式的限制。

下列實施例中常規(guī)的實驗方法，參見Sambrook等編寫的分子克隆。儀器的使用參照儀器操作說明。本申請中實施例中所使用的各個毒株和菌株均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽疫病診斷中心保藏和提供。

實施例1禽類臨床病料樣本的預(yù)處理

1、實驗試劑和主要儀器

主要試劑：滅菌生理鹽水

主要儀器：LEGEND MICRO 17R低溫臺式離心機(jī)，為Thermo公司產(chǎn)品；VS-1渦旋振蕩器購自鼎昊源科技有限公司；TL-2010S組織研磨震蕩器購自鼎昊源科技有限公司。

2、實驗步驟

組織樣本處理：取100mg臟器組織樣本加入0.5ml滅菌生理鹽水并用研磨器進(jìn)行研磨混懸，組織懸液3000rpm離心30min后取上清用于檢測。

實施例2樣本總DNA的提取

1、實驗試劑和主要儀器

主要試劑：用DNA Vzol提取試劑，為威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品，購自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司；無水乙醇和75％乙醇購自北京華美智博科技有限公司；Rnase-free的離心管與槍頭北京購自華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司。

主要儀器：LEGEND MICRO 17R低溫臺式離心機(jī)，為Thermo公司產(chǎn)品；1300SEVIES A2生物安全柜，為Thermo公司產(chǎn)品。

2、實驗步驟

(1)取實施例1預(yù)處理所得禽類臨床病料樣本懸液250μl，加入800μl DNA Vzol，顛倒混勻，裂解產(chǎn)物應(yīng)呈澄清的透明粘稠液體。

(2)加入無水乙醇量為400μl，輕輕顛倒混勻5-8次，室溫放置2-3min?？梢奃NA在液體中行程團(tuán)塊狀沉淀，室溫5000g離心5min，以收取DNA，棄去剩余液體。

(3)加入1ml 75％乙醇至離心管中，顛倒數(shù)次以重懸DNA，室溫2000g離心3-5min，吸除洗滌液。再重復(fù)洗滌一次。

(4)仔細(xì)吸去剩余乙醇，不要完全晾干DNA，加入100μl水或TE緩沖液，使DNA沉淀溶解?？捎梦^緩緩吹打助溶或放置4℃過夜待其自溶，存放于4℃或-20℃。

實施例3目的片段的PCR擴(kuò)增

1、實驗試劑和主要儀器

主要試劑：DNA溶液；2×Taq PCR master mix，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特異性引物(上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’；下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’)；Marker II DNA Ladder購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要儀器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀購自北京市六一儀器廠；α凝膠成像儀購自鼎昊源科技有限公司。

2、實驗步驟

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，55℃45s，72℃35s，進(jìn)行32個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為FAdV-I檢測陽性，否則為檢測陰性。

利用上述方法分別對不同基因型FAdV-I(A-E)進(jìn)行檢測，結(jié)果均有較好的檢出，如圖2所示，表明本方法具有良好的通用性。

實施例4敏感性檢測

1、實驗試劑和主要儀器

主要試劑：DNA溶液；2×Taq PCR master mix，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；dd H2O；特異性引物(上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’；下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’)；Marker II DNA Ladder購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要儀器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀購自北京市六一儀器廠；α凝膠成像儀購自鼎昊源科技有限公司。

2、實驗步驟

將DNA溶液進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度為10、10²、10³、10⁴和10⁵倍，分別以稀釋后的模板按如下體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，55℃45s，72℃35s，進(jìn)行32個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為FAdV-I檢測陽性，否則為檢測陰性。

利用上述方法分別對FAdV-I進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示對FAdV-I DNA稀釋10⁴倍后，仍能檢測到病毒DNA，如圖3所示，表明本方法具有良好的敏感性。

實施例5特異性檢測

1、實驗試劑和主要儀器

主要試劑：DNA溶液；2×Taq PCR master mix，購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；特異性引物(上游引物5’-TGYTCGTTGTGGATSGTGAA-3’；下游引物5’-CTTYGTKKTGGGNTGGTCG-3’)；Marker II DNA Ladder購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

主要儀器：Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品，購自北京誠茂興業(yè)科技發(fā)展有限公司；MINI-Smart小型臺式離心機(jī)為HERO公司產(chǎn)品；DYY-8C電泳儀購自北京市六一儀器廠；α凝膠成像儀購自鼎昊源科技有限公司。

2、實驗步驟

在0.2ml離心管中加入下列成分：

輕輕混勻后，進(jìn)行如下反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，55℃45s，72℃35s，進(jìn)行32個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束72℃延伸10min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1×TAE電泳緩沖液制備1％瓊脂糖凝膠并按照參考比例混入熒光染料Gelsafe。取7μl PCR產(chǎn)物加入凝膠孔中，選擇合適的電壓(4V/cm-10V/cm)進(jìn)行電泳，電泳時間為20-30min，電泳結(jié)束后將凝膠塊置于凝膠成像儀上觀察并拍照，根據(jù)電泳結(jié)果確定樣本中能否擴(kuò)增出目的條帶，如果擴(kuò)增出目的條帶則證明為FAdV-I檢測陽性，否則為檢測陰性。

利用上述方法對其它常見的禽病病原，如禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊病毒、禽呼腸孤病毒和禽傳染性喉氣管炎病毒進(jìn)行檢測，其結(jié)果如圖4所示，結(jié)果皆為陰性，表明本方法具有良好的特異性。

實施例5對臨床樣本的檢測

表1 PCR檢測方法對臨床病料檢測的應(yīng)用

由表1可以看出，本申請建立用于檢測Ⅰ群禽腺病毒的PCR方法與病毒分離結(jié)果或測序結(jié)果均符合，準(zhǔn)確性高，同時對來自不同采樣時間和地點的病料樣本均適用。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對示例性實施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。