本發(fā)明涉及腫瘤的細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，尤其涉及一種重組慢病毒及其應(yīng)用，具體為以腫瘤特異靶點(diǎn)GPC3為基礎(chǔ)的嵌合抗原受體T(CAR-T)細(xì)胞技術(shù)的構(gòu)建方法及其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：GPC3(Glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)基因定位于人染色體X26.10，參與了細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、發(fā)育以及細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)等生命過(guò)程。GPC3的功能預(yù)期在生物體內(nèi)的分布有密切關(guān)系，在人體的胚胎期，GPC3在胎盤(pán)、胚胎肝、胚胎肺和胚胎腎中都有表達(dá)。在成人正常組織中，在腦、肝臟、脾臟、胃、腸等均不表達(dá)，僅在卵巢、肺部及腎臟等部位有極低水平的表達(dá)(HsuHCetal.,1997CancerReseach)。遺傳性的GPC3基因突變?nèi)笔?，Hedgehog信號(hào)通路失去負(fù)面調(diào)控，引起Simpson-Golabi-Behmel(SGBS)綜合征(CapurroMIetal.,2008DevCell)。SGBS綜合征是一種X染色體連鎖遺傳病，主要特征是巨舌、多指(趾)、肋骨及脊柱畸形、肌張力低下等，同時(shí)胚胎性腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性增加。研究報(bào)道，GPC3在肝癌(CapurroMetal.,2003Gastroenterology)、腎細(xì)胞癌(ValsechiMCetal.,2014BMCCancer)、卵巢癌(MaedaDetal.,2009ModPathol)、肺癌(LinQetal.,2012ModPathol)、黑色素瘤(NakatsuraTetal.,2004ClinCancerRes)中特異性高表達(dá)。GPC3為腫瘤相關(guān)抗原，通過(guò)上調(diào)Wnt信號(hào)通路的自分泌和旁分泌產(chǎn)物，刺激肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)(LaiJPetal.,2010Hepatology)。同時(shí)，GPC3還是一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因。在卵巢癌細(xì)胞系中，GPC3基因表達(dá)常常會(huì)被甲基化沉默(LinHetal.,1999CancerRes)。通過(guò)基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)GPC3在肺腺癌(相對(duì)于正常肺癌細(xì)胞)、吸煙人群(相對(duì)于非吸煙人群)肺組織中高表達(dá)(KimHetal.,2003AmJRespirCellMolBiol)。GPC3在胰腺導(dǎo)管腺癌中高表達(dá)(相對(duì)于正常胰腺組織)，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有關(guān)，是胰腺導(dǎo)管腺癌診斷的候選標(biāo)記物(YaoHetal.,2016CancerBiomark)。作為檢出早期肝癌的分子標(biāo)志物，GPC3在肝癌中特異性呈高表達(dá)狀態(tài)，在不典型增生結(jié)節(jié)及其它腫瘤中檢測(cè)不到；且敏感性高，能夠在肝癌發(fā)生的早期被檢出。GPC3-AS1(ThelncRNAglypican3antisensetranscript1)，即GPC3反義轉(zhuǎn)錄子非編碼長(zhǎng)RNA，在肝癌中顯著高表達(dá)，且其表達(dá)水平與GPC3表達(dá)、腫瘤生長(zhǎng)、血管浸潤(rùn)、預(yù)后等有關(guān)聯(lián)(ZhuXTetal.,2016FEBSJ)。GPC3參與腫瘤組織中的炎癥反應(yīng)，GPC3可上調(diào)F4/80+CD86+巨噬細(xì)胞數(shù)量，引起GPC3特異性CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，延長(zhǎng)小鼠生存期(LuoCetal.,2014OncolRep)。通過(guò)GPC3多肽疫苗，激活CTL細(xì)胞對(duì)GPC3高表達(dá)肝癌細(xì)胞的殺傷作用，治療肝癌病人處于二期臨床試驗(yàn)(SawadaYetal.,2016Oncoimmunology)。臨床研究報(bào)道，可利用GPC3特異性樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗治療肝癌，激活GPC3+肝癌細(xì)胞的識(shí)別殺傷(TadaFetal.,2012IntJOncol)。相對(duì)于共刺激因子組合CD28、CD28聯(lián)合41BB，GPC3-41BB嵌合抗原受體T細(xì)胞具有更強(qiáng)的擴(kuò)增和抗腫瘤潛能(LiWetal.,2016HumGeneTher)?，F(xiàn)有技術(shù)中以GPC3為腫瘤的靶點(diǎn)，主要通過(guò)GPC3肽段疫苗、特異性靶向GPC3過(guò)繼性免疫、嵌合抗原受體T細(xì)胞等。而GPC3疫苗主要在腫瘤預(yù)防和腫瘤早期可起到一定的作用，而往往肝癌確診的時(shí)候都是肝癌中晚期，GPC3疫苗往往效果不明顯。GPC3抗原特異性的DC-CIK免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)識(shí)別殺傷效果比較低，免疫細(xì)胞活性較弱。CN102180969A公開(kāi)了一種抗肝癌活性單克隆抗體及其應(yīng)用。該單克隆抗體，是可以與GPC3抗原表位特異性結(jié)合的單克隆抗體；所述GPC3抗原表位的氨基酸序列為自GenBankaccessionNumber為AAA98132.1的氨基端端第359-580位氨基酸殘基。該發(fā)明制備了高效價(jià)、高特異、且具有免疫活性、并且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有毒殺活性的鼠抗人GPC3-C單克隆抗體。GPC3單克隆抗體可有效抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，然而，GPC3抗體容易形成耐藥，且能導(dǎo)致GPC3陰性肝癌細(xì)胞逃逸，埋下腫瘤復(fù)發(fā)的威脅。CN105949324A公開(kāi)了靶向GPC3的嵌合抗原受體及其用途，該嵌合抗原受體含有依次連接的CD8抗原的前導(dǎo)肽、抗GPC3單鏈抗體、人CD8α鉸鏈區(qū)、人CD8α跨膜區(qū)、人41BB胞內(nèi)區(qū)、人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)和任選的EGFR序列的含胞外結(jié)構(gòu)域III和胞外結(jié)構(gòu)域IV的片段。該嵌合抗原靶向效果并不十分理想，且腫瘤微環(huán)境會(huì)影響其治療效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)目前CAR-T技術(shù)治療腫瘤中靶向不十分理想，以及腫瘤微環(huán)境影響CAR-T技術(shù)治療效果的情況，本發(fā)明提供一種重組慢病毒及其應(yīng)用，本發(fā)明制備的GPC3CATT細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，且高表達(dá)Th1細(xì)胞因子，極大程度刺激非CART細(xì)胞引起的腫瘤殺傷效應(yīng)，可有效防止GPC3-腫瘤細(xì)胞的逃逸和潛在復(fù)發(fā)威脅。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體主要包括信號(hào)肽、抗原識(shí)別區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域和CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域串聯(lián)構(gòu)成；其中，所述胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域主要包括人TLR2胞內(nèi)區(qū)。本發(fā)明中，通過(guò)在GPC3CAR分子中引入人TLR2(TOLLLIKERECEPTOR2)胞內(nèi)信號(hào)域，構(gòu)建成的GPC3CART細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其免疫細(xì)胞因子分泌偏向于Th1類型，對(duì)肝癌細(xì)胞具有強(qiáng)烈的細(xì)胞殺傷效應(yīng)，且高表達(dá)Th1細(xì)胞因子，極大程度刺激非CART細(xì)胞引起的腫瘤殺傷效應(yīng)，可有效防止GPC3-肝癌細(xì)胞的逃逸和潛在復(fù)發(fā)威脅。根據(jù)本發(fā)明，所述人TLR2胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述人TLR2胞內(nèi)區(qū)的核酸序列如SEQIDNO.2所示。所述人TLR2胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO.1)如下：QAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS.所述人TLR2胞內(nèi)區(qū)的核酸序列(SEQIDNO.2)如下：5-CAGGCCAAAAGGAAGCCCAGGAAAGCTCCCAGCAGGAACATCTGCTATGATGCATTTGTTTCTTACAGTGAGCGGGATGCCTACTGGGTGGAGAACCTTATGGTCCAGGAGCTGGAGAACTTCAATCCCCCCTTCAAGTTGTGTCTTCATAAGCGGGACTTCATTCCTGGCAAGTGGATCATTGACAATATCATTGACTCCATTGAAAAGAGCCACAAAACTGTCTTTGTGCTTTCTGAAAACTTTGTGAAGAGTGAGTGGTGCAAGTATGAACTGGACTTCTCCCATTTCCGTCTTTTTGATGAGAACAATGATGCTGCCATTCTCATTCTTCTGGAGCCCATTGAGAAAAAAGCCATTCCCCAGCGCTTCTGCAAGCTGCGGAAGATAATGAACACCAAGACCTACCTGGAGTGGCCCATGGACGAGGCTCAGCGGGAAGGATTTTGGGTAAATCTGAGAGCTGCGATAAAGTCC-3.本發(fā)明的嵌合抗原受體還可以包括鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇，在此不做特殊限定，鉸鏈區(qū)的存在不會(huì)對(duì)本發(fā)明的嵌合抗原受體的性能產(chǎn)生影響。根據(jù)本發(fā)明，過(guò)表達(dá)特異性靶向GPC3的嵌合抗原受體(ChimericAntigenReceptor，CAR)T細(xì)胞，可特異性識(shí)別GPC3+腫瘤抗原，殺傷腫瘤細(xì)胞，具有顯著的體內(nèi)外擴(kuò)增和腫瘤殺傷作用，所述抗原識(shí)別區(qū)為特異性識(shí)別結(jié)合GPC3抗原的區(qū)域，優(yōu)選為抗GPC3抗體胞外段。根據(jù)本發(fā)明，所述信號(hào)肽為能夠指導(dǎo)嵌合抗原受體跨膜轉(zhuǎn)移的信號(hào)肽都是可行的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要選擇本領(lǐng)域常規(guī)的信號(hào)肽，所述信號(hào)肽為人IgM信號(hào)肽或人CD8α信號(hào)肽，優(yōu)選為人IgM信號(hào)肽。優(yōu)選地，所述的跨膜區(qū)為人CD28跨膜區(qū)或人CD8跨膜區(qū)，優(yōu)選為人CD28跨膜區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，所述胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域除了含有人TLR2胞內(nèi)區(qū)以外，還包括人CD28胞內(nèi)區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)、人CD27胞內(nèi)區(qū)、人CD28胞內(nèi)區(qū)、人OX40胞內(nèi)區(qū)、人CD30胞內(nèi)區(qū)、人CD40胞內(nèi)區(qū)、人PD-1胞內(nèi)區(qū)、人ICOS胞內(nèi)區(qū)、人淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1胞內(nèi)區(qū)、人CD2胞內(nèi)區(qū)、人CD7胞內(nèi)區(qū)、人LIGHT胞內(nèi)區(qū)、人NKG2C胞內(nèi)區(qū)、人B7-H3胞內(nèi)區(qū)或人CD83胞內(nèi)區(qū)中的任意一種或至少兩種的組合，所述組合例如可以是，優(yōu)選為人4-1BB胞內(nèi)區(qū)或CD28胞內(nèi)區(qū)，在本發(fā)明中，所述完整的胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域?yàn)槿薈D28胞內(nèi)區(qū)或人4-1BB胞內(nèi)區(qū)和人TLR2胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)構(gòu)成。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述嵌合抗原受體由人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區(qū)、人4-1BB胞內(nèi)區(qū)、人TLR2胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域串聯(lián)構(gòu)成，即IgM-GPC3-4-1BB-CD3ξ-TLR2(GTBBξ)；嵌合抗原受體由人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、人TLR2胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域串聯(lián)構(gòu)成，即IgM-GPC3-CD28-CD3ξ-TLR2(GT28ξ)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，所述嵌合抗原受體由人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體、人CD28跨膜區(qū)、人CD28或人4-1BB胞內(nèi)區(qū)、人TLR2胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域串聯(lián)構(gòu)成，其對(duì)腫瘤的識(shí)別殺傷效果最好，可靶向GPC3-腫瘤細(xì)胞，有效抑制肝癌生長(zhǎng)。優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體IgM-GPC3-CD28-CD3ξ-TLR2的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，所述嵌合抗原受體GT28ζ基因合成序列的氨基酸序列(SEQIDNO.3)如下：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS.優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體IgM-GPC3-41BB-CD3ξ-TLR2的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，所述嵌合抗原受體GTBBζ基因合成序列的的氨基酸序列(SEQIDNO.4)如下：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPPTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLKWIGALDPKTGDTAYSQKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTRFYSYTYWGQGTLVTVSAAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS.優(yōu)選地，所述的嵌合抗原受體通過(guò)其編碼的核酸序列轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)染的方式為通過(guò)病毒載體、真核表達(dá)質(zhì)粒或mRNA序列中的任意一種或至少兩種的組合轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞，優(yōu)選為通過(guò)病毒載體轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞。優(yōu)選地，所述病毒載體為慢病毒載體、腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為慢病毒載體。第二方面，本發(fā)明提供一種重組慢病毒，將包含如第一方面所述的嵌合抗原受體的病毒載體與包裝輔助質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2共轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞得到的重組慢病毒。第三方面，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受體和/或如第二方面所述的重組慢病毒。第四方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的嵌合抗原受體、如第二方面所述的重組慢病毒或如第三方面所述的組合物在制備嵌合抗原受體T細(xì)胞及其在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述腫瘤為GPC3陽(yáng)性腫瘤。根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體可特異性識(shí)別GPC3+腫瘤抗原，含有GPC3+腫瘤抗原的腫瘤細(xì)胞都可被識(shí)別和治療，所述GPC3陽(yáng)性腫瘤包括肝癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤或腎細(xì)胞癌中的任意一種或至少兩種的組合，其中，所述卵巢癌、肺癌、黑色素瘤或腎細(xì)胞癌中都含有GPC3+腫瘤抗原，其能夠被所述嵌合抗原受體識(shí)別，其機(jī)理與肝癌類似，所述嵌合抗原受體也能夠治療卵巢癌、肺癌、黑色素瘤或腎細(xì)胞癌，所述GPC3陽(yáng)性腫瘤優(yōu)選為肝癌。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：(1)本發(fā)明的嵌合抗原受體具有高效腫瘤識(shí)別殺傷效應(yīng)，可激活非CART細(xì)胞，體內(nèi)T、NK、巨噬細(xì)胞等腫瘤免疫相關(guān)細(xì)胞的腫瘤免疫效應(yīng)，靶向GPC3-腫瘤細(xì)胞，防治腫瘤免疫逃逸和復(fù)發(fā)威脅；(2)本發(fā)明的嵌合抗原受體偏向于Th1型細(xì)胞因子分泌，可正反饋激活CART腫瘤免疫效應(yīng)，還可在一定程度上減弱腫瘤微環(huán)境的腫瘤免疫抑制；(3)本發(fā)明表達(dá)此嵌合抗原受體的T細(xì)胞能最大程度的殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常組織的傷害程度很小，能突破腫瘤免疫抑制微環(huán)境，從而對(duì)實(shí)體瘤具有更好的療效。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中的嵌合抗原受體的合成基因序列圖譜；圖2為本發(fā)明CARGT28ξ慢病毒感染效率和CART細(xì)胞擴(kuò)增；圖3本發(fā)明CARGT28ξT細(xì)胞體外有效識(shí)別殺傷GPC3+肝癌細(xì)胞，其中，圖3(A)為針對(duì)GPC3+的Huh7-GL肝癌細(xì)胞，圖3(B)為針對(duì)GPC3+的HepG2-GL肝癌細(xì)胞，為Mock-CarT，為GPC3-CarT；圖4為本發(fā)明CAR-GT28ξT細(xì)胞的安全性驗(yàn)證，，為Mock-CarT，為GPC3-CarT；圖5為本發(fā)明CARGT28ξT細(xì)胞體外抑制GPC3+肝癌生長(zhǎng)，其中，圖5(A)為GPC3+的Huh7-GL肝癌細(xì)胞，圖5(B)為GPC3+的HepG2-GL肝癌細(xì)胞，為Mock-CarT，為GPC3-CarT；圖6為本發(fā)明GPC3抗原特異性激活的GT28ξCART細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子，其中，圖6(A)為分泌的IL-2因子，圖6(B)為分泌的INF-γ因子，“□”為Mock-CarT，“■”為GPC3-CarT；圖7為本發(fā)明CAR-GTBBξ、CAR-GT28ξ、CAR-G28BBξT細(xì)胞對(duì)GPC3+的HepG2-GL肝癌細(xì)胞的特異性識(shí)別殺傷。具體實(shí)施方式為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：嵌合抗原受體慢病毒載體的構(gòu)建(1)通過(guò)全基因合成人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體胞外段、人CD28跨膜區(qū)、人41BB胞內(nèi)區(qū)、人TLR2胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域，即CAR-GPC3-41BB-CD3ξ-TLR2(CAR-GTBBξ)，全基因合成人IgM信號(hào)肽、抗GPC3抗體胞外段、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、人TLR2胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域，即CAR-GPC3-CD28-CD3ξ-TLR2(CAR-GT28ξ)，其序列如SEQIDNO.4所示，再全基因合成CAR-CD19-CD28-CD3ξ-TLR2(Mock)核酸序列作為陰性對(duì)照，CAR-GPC3-41BB-CD28-CD3ξ(CAR-G28BBξ)核酸序列作為陽(yáng)性對(duì)照其基因序列圖譜如圖1所示，合成的基因C端含限制性內(nèi)切酶Pme1酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基和N端含限制性內(nèi)切酶Spe1酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基；(2)分別通過(guò)限制性內(nèi)切酶Pme1和Spe1雙酶切，凝膠電泳回收獲得含粘性末端的合成DNA片段CAR-GTBBξ、CAR-GT28ξ、CAR-G28BBξ和Mock，將CAR-GTBBξ、CAR-GT28ξ、CAR-G28BBξ、Mock和含粘性末端的pWPXLd-eGFP慢病毒載體的線性化DNA；(3)通過(guò)T4DNA連接酶(Invitrogent公司)，將線性化的pWPXLd-2A-EGFP與帶粘性末端的合成的DNA片段CAR-GTBBξ、CAR-GT28ξ、Mock進(jìn)行連接，獲得CAR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體pWPXLd-CAR-GTBBξ-2A-EGFP、pWPXLd-CAR-GT28ξ-2A-EGFP、pWPXLd-CAR-G28BBξ-2A-EGFP、pWPXLd-Mock-2A-EGFP。實(shí)施例2：GT28ξCAR慢病毒包裝(1)在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細(xì)胞，培養(yǎng)基為：DMEM高糖培養(yǎng)基+10％FBS(胎牛血清)+1％雙抗(100×青霉素-鏈霉素混合溶液)；(2)待150mm培養(yǎng)皿中的293T細(xì)胞密度達(dá)80-90％時(shí)，更換培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基+1％FBS+1％雙抗；(3)更換培養(yǎng)基培養(yǎng)2-6小時(shí)后，用PEI分別將pWPXLd-CAR-EGFP質(zhì)粒(pWPXLd-CAR-GTBBξ-2A-EGFP、pWPXLd-CAR-GT28ξ-2A-EGFP、pWPXLd-CAR-G28BBξ-2A-EGFP、pWPXLd-Mock-2A-EGFP)分別與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共同轉(zhuǎn)導(dǎo)入293T細(xì)胞，加入試劑及劑量如下：試劑劑量pWPXLd-CAR-EGFP質(zhì)粒9μgpMD2.G輔助質(zhì)粒3μgpsPAX212μgPEI72μg(4)分別于轉(zhuǎn)化后24、48和72小時(shí)，收集培養(yǎng)基上清，并加入新鮮培養(yǎng)基：DMEM高糖培養(yǎng)基+1％FBS+1％雙抗；(5)培養(yǎng)基上清收集完畢，將上清2500g離心0.5小時(shí)后；(6)取離心上清，用0.45um過(guò)濾器過(guò)濾后，利用超高速離心機(jī)28000rpm離心1.5小時(shí)；(7)超高速離心后，輕輕去除上清，加入200ulPBS，置于4℃12-16小時(shí)溶解，即得CAR慢病毒；(8)病毒溶解后，收集病毒溶液分裝于PCR管，凍存于-80℃待用。實(shí)施例3：CART細(xì)胞的構(gòu)建(1)人體T細(xì)胞的分離純化：通過(guò)Ficoll密度梯度法分離出人體血液中的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)紅細(xì)胞裂解液裂解去除紅細(xì)胞后，再通過(guò)MACSPan-T磁珠分選出T細(xì)胞；(2)將分選出來(lái)的T細(xì)胞用培養(yǎng)基：AIM-V培養(yǎng)基+5％FBS+青霉素100U/ml+鏈霉素0.1mg/ml稀釋至細(xì)胞濃度2.5×106個(gè)/mL待用；(3)通過(guò)包被CD2、CD3、CD28抗體的磁珠(德國(guó)美天旎)刺激T細(xì)胞，即包被磁珠與T細(xì)胞以1:2比例混合，T細(xì)胞最終密度應(yīng)為5×106個(gè)/mL/cm2。混合后，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激48小時(shí)；(4)慢病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞：將激活的T細(xì)胞-磁珠混合液中的磁珠通過(guò)磁場(chǎng)作用去除，300g離心5min，去上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸，分別加入表達(dá)CAR和GFP(空白對(duì)照)慢病毒(病毒加入量為MOI＝10)后，加入8μg/mL的polybrene和300IU/mLIL-2，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，300g離心5min，去上清，用含300IU/mLIL-2的新鮮培養(yǎng)基重懸，即得過(guò)表達(dá)CAR質(zhì)粒的T細(xì)胞；(5)CART細(xì)胞擴(kuò)增：將CART細(xì)胞密度維持在1×106個(gè)/mL左右，每2-3天進(jìn)行一次半量換液，兩周后，CART細(xì)胞數(shù)可擴(kuò)增100倍，GFP陽(yáng)性的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，GFP陽(yáng)性比例通過(guò)流式進(jìn)行檢測(cè)，即得到CAR-GTBBξT、CAR-GT28ξT、CAR-G28BBξT、MockT細(xì)胞或陰性對(duì)照(未經(jīng)處理)T胞的比例，結(jié)果如圖2所示，可以看出加入TLR2胞內(nèi)區(qū)的嵌合抗原受體T細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)染率，且可促進(jìn)T細(xì)胞更好的擴(kuò)增。實(shí)施例4：其他胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域的CART細(xì)胞的構(gòu)建(1)通過(guò)全基因合成人CD8α信號(hào)肽、抗GPC3抗體胞外段、人CD28跨膜區(qū)、胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域、人TLR2胞內(nèi)區(qū)和人CD3ζ信號(hào)傳導(dǎo)域，其中胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域?yàn)槿薈D27胞內(nèi)區(qū)、人CD28胞內(nèi)區(qū)、人OX40胞內(nèi)區(qū)、人CD30胞內(nèi)區(qū)、人CD40胞內(nèi)區(qū)、人PD-1胞內(nèi)區(qū)、人ICOS胞內(nèi)區(qū)、人淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1胞內(nèi)區(qū)、人CD2胞內(nèi)區(qū)、人CD7胞內(nèi)區(qū)、人LIGHT胞內(nèi)區(qū)、人NKG2C胞內(nèi)區(qū)、人B7-H3胞內(nèi)區(qū)或人CD83中的任意一種，共合成14個(gè)嵌合抗原受體，合成的基因C端含限制性內(nèi)切酶Pme1酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基和N端含限制性內(nèi)切酶Spe1酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基；(2)分別通過(guò)限制性內(nèi)切酶Pme1和Spe1雙酶切，凝膠電泳回收獲得含粘性末端的合成DNA片段和含粘性末端的pWPXLd-eGFP慢病毒載體的線性化DNA；(3)通過(guò)T4DNA連接酶(Invitrogent公司)，將線性化的pWPXLd-2A-EGFP與帶粘性末端的合成的DNA片段連接，獲得CAR質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體。慢病毒的包裝步驟同實(shí)施例2，CART細(xì)胞的構(gòu)建步驟同實(shí)施例3，可以制備得到不同胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域的14個(gè)CART細(xì)胞。實(shí)施例5：CAR-GT28ξT細(xì)胞的體外腫瘤殺傷(1)將實(shí)施例2制備的CAR-GT28ξT、MockT細(xì)胞與的GPC3+肝癌細(xì)胞分別以1：3、1：1、3：1、5：1比例混合，加入到96孔U型板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，250g離心5min后，置于37度5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)18h；(2)體外評(píng)估CAR-GT28ξT細(xì)胞對(duì)GPC3+肝癌細(xì)胞的識(shí)別殺傷功能，腫瘤細(xì)胞分別選用Huh7-GL、HepG2-GL帶熒光素酶的人肝癌細(xì)胞系；(3)熒光素酶(Luciferase)定量殺傷效率評(píng)估方法：CART細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng))后18小時(shí)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100μl/孔的熒光素酶底物(1×)，將細(xì)胞重懸混勻，立即通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定RLU(relativelightunit)，測(cè)定時(shí)間設(shè)為1秒。殺傷比例計(jì)算公式：100％×(對(duì)照孔讀數(shù)-實(shí)驗(yàn)孔讀數(shù))/對(duì)照孔讀數(shù)(不加細(xì)胞的空白組讀數(shù)可以忽略)；其結(jié)果如圖3(A)-圖3(B)所示，結(jié)果表明，CAR-GT28ξT細(xì)胞對(duì)GPC3+的Huh7-GL、HepG2-GL肝癌細(xì)胞具有顯著的體外殺傷效率。CAR-G28BBξT細(xì)胞對(duì)GPC3+的Huh7-GL、HepG2-GL肝癌細(xì)胞的殺傷效果與CAR-GT28ξT細(xì)胞類似，而選擇其他胞內(nèi)共刺激信號(hào)傳導(dǎo)域的14個(gè)CAR-T細(xì)胞雖然對(duì)GPC3+的Huh7-GL、HepG2-GL肝癌細(xì)胞具有殺傷效果，但效果不如CAR-G28BBξT細(xì)胞和CAR-GT28ξT細(xì)胞。實(shí)施例6：CART細(xì)胞安全性試驗(yàn)(1)將實(shí)施例2制備的CAR-GT28ξT、MockT細(xì)胞與GPC3-腫瘤細(xì)胞分別以1：3、1：1、3：1、5：1比例混合，加入到96孔U型板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，250g離心5min后，置于37度5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)18h；(2)體外評(píng)估CAR-GT28ξT細(xì)胞對(duì)GPC3-腫瘤細(xì)胞的非特異性識(shí)別殺傷作用，GPC3-腫瘤細(xì)胞分別選用A549-GL帶熒光素酶的人肺腺癌細(xì)胞系；(3)熒光素酶(Luciferase)定量殺傷效率評(píng)估方法：CART細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng))后18小時(shí)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100μl/孔的熒光素酶底物(1×)，將細(xì)胞重懸混勻，立即通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定RLU(relativelightunit)，測(cè)定時(shí)間設(shè)為1秒。殺傷比例計(jì)算公式：100％×(對(duì)照孔讀數(shù)-實(shí)驗(yàn)孔讀數(shù))/對(duì)照孔讀數(shù)(不加細(xì)胞的空白組讀數(shù)可以忽略)；其結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明，CAR-GT28ξT細(xì)胞對(duì)GPC3-的A549-GL肺癌細(xì)胞沒(méi)有非特異性殺傷效應(yīng)。CAR-G28BBξT細(xì)胞對(duì)GPC3-的A549-GL肺癌細(xì)胞也沒(méi)有非特異性殺傷效應(yīng)。實(shí)施例7：CARGT28ξT細(xì)胞的體內(nèi)腫瘤殺傷(1)將細(xì)胞數(shù)為1×105的GPC3+肝癌細(xì)胞移植入NOD/SCIDIL2rg-/-免疫缺陷小鼠體內(nèi)，構(gòu)建肝癌異種移植小鼠模型；(2)體內(nèi)評(píng)估CAR-GT28ξT細(xì)胞對(duì)GPC3+肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，腫瘤細(xì)胞分別選用Huh7-GL、HepG2-GL帶熒光素酶的人肝癌細(xì)胞系；(3)腫瘤移植7、14天后，分別在肝癌異種移植小鼠模型中靜脈注射細(xì)胞數(shù)為2×106的CAR-GT28ξT、MockT細(xì)胞，共兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組設(shè)置五個(gè)重復(fù)；(3)于腫瘤移植后第7、10、13、16、19、21天，用游標(biāo)卡尺分別量取兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠皮下腫瘤塊大小，并記錄，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖；結(jié)果如圖5(A)-圖5(B)所示，結(jié)果表明，CAR-GT28ξT細(xì)胞在體內(nèi)可識(shí)別殺傷GPC3+肝癌細(xì)胞Huh7-GL、HepG2-GL，有效抑制肝癌生長(zhǎng)。CAR-G28BBξT細(xì)胞也可在體內(nèi)可識(shí)別殺傷GPC3+肝癌細(xì)胞Huh7-GL、HepG2-GL，有效抑制肝癌生長(zhǎng)。實(shí)施例8：激活的CARGT28ξT細(xì)胞細(xì)胞因子分泌(1)將實(shí)施例2制備的CAR-GT28ξT、MockT細(xì)胞(陰性對(duì)照，非特異性靶向GPC3)與的GPC3+肝癌細(xì)胞分別以1：1比例混合，加入到96孔U型板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，250g離心5min后，置于37度5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)18h；(2)細(xì)胞因子分泌評(píng)估中GPC3+腫瘤細(xì)胞分別選用Huh7-GL、HepG2-GL帶熒光素酶的人肝癌細(xì)胞系，GPC3-腫瘤細(xì)胞選用A549-GL帶熒光素酶的人肺癌細(xì)胞系；(3)共培養(yǎng)18h后，取不同實(shí)驗(yàn)組的共培養(yǎng)上清，通過(guò)ELISA檢測(cè)上清中的Th1型細(xì)胞因子(IL2和IFNγ)的表達(dá)水平；結(jié)果如圖6(A)-圖6(B)所示，結(jié)果表明，CAR-GT28ξT細(xì)胞在GPC3抗原的特異性激活下，細(xì)胞因子IL-2、IFNγ的表達(dá)水平顯著高于MockT細(xì)胞。實(shí)施例9：不同胞內(nèi)區(qū)的CAR-GPC3T細(xì)胞的體外腫瘤殺傷(1)將實(shí)施例2制備的CAR-GTBBξ、CAR-GT28ξ、CAR-G28BBξ(陽(yáng)性對(duì)照)、Mock(陰性對(duì)照)T細(xì)胞與的GPC3+肝癌細(xì)胞分別以1：3、1：1、3：1比例混合，加入到96孔U型板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，250g離心5min后，置于37度5％CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)18h；(2)體外評(píng)估CAR-GT28ξT細(xì)胞對(duì)GPC3+肝癌細(xì)胞的識(shí)別殺傷功能，腫瘤細(xì)胞分別選用HepG2-GL帶熒光素酶的人肝癌細(xì)胞系；(3)熒光素酶(Luciferase)定量殺傷效率評(píng)估方法：CART細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)對(duì)照組為腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng))后18小時(shí)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100μL/孔的熒光素酶底物(1×)，將細(xì)胞重懸混勻，立即通過(guò)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定RLU(relativelightunit)，測(cè)定時(shí)間設(shè)為1秒。殺傷比例計(jì)算公式：100％×(對(duì)照孔讀數(shù)-實(shí)驗(yàn)孔讀數(shù))/對(duì)照孔讀數(shù)(不加細(xì)胞的空白組讀數(shù)可以忽略)；其結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，對(duì)HepG2的殺傷效果CAR-GTBBξ>CAR-GT28ξ>CAR-G28BBξ，相對(duì)于對(duì)照組Mock有明顯的殺傷作用，表明共刺激信號(hào)分子TLR2胞內(nèi)區(qū)可有效提高嵌合抗原受體T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別殺傷作用。綜上所述，本發(fā)明的嵌合抗原受體偏向于Th1型細(xì)胞因子分泌，可正反饋激活CART腫瘤免疫效應(yīng)，還可在一定程度上減弱腫瘤微環(huán)境的腫瘤免疫抑制，本發(fā)明表達(dá)此嵌合抗原受體的T細(xì)胞能最大程度的殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常組織的傷害很小，能突破腫瘤免疫抑制微環(huán)境，從而對(duì)實(shí)體瘤具有更好的療效。申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>深圳市體內(nèi)生物醫(yī)藥科技有限公司<120>一種重組慢病毒及其應(yīng)用<130>2016<160>4<170>PatentInversion3.3<210>1<211>159<212>PRT<213>人工合成序列<400>1GlnAlaLysArgLysProArgLysAlaProSerArgAsnIleCysTyr151015AspAlaPheValSerTyrSerGluArgAspAlaTyrTrpValGluAsn202530LeuMetValGlnGluLeuGluAsnPheAsnProProPheLysLeuCys354045LeuHisLysArgAspPheIleProGlyLysTrpIleIleAspAsnIle505560IleAspSerIleGluLysSerHisLysThrValPheValLeuSerGlu65707580AsnPheValLysSerGluTrpCysLysTyrGluLeuAspPheSerHis859095PheArgLeuPheAspGluAsnAsnAspAlaAlaIleLeuIleLeuLeu100105110GluProIleGluLysLysAlaIleProGlnArgPheCysLysLeuArg115120125LysIleMetAsnThrLysThrTyrLeuGluTrpProMetAspGluAla130135140GlnArgGluGlyPheTrpValAsnLeuArgAlaAlaIleLysSer145150155<210>2<211>477<212>DNA<213>人工合成序列<400>2caggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtt60tcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaac120ttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatc180attgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaa240aactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtcttttt300gatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccatt360ccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggccc420atggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc477<210>3<211>645<212>PRT<213>人工合成序列<400>3MetLeuLeuLeuValThrSerLeuLeuLeuCysGluLeuProHisPro151015AlaPheLeuLeuIleProAspValValMetThrGlnThrProLeuSer202530LeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerIleSerCysArgSerSer354045GlnSerLeuValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuHisTrpTyrLeu505560GlnLysProGlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAsn65707580ArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThr859095AspPheThrLeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspLeuGlyVal100105110TyrPheCysSerGlnAsnThrHisValProProThrPheGlySerGly115120125ThrLysLeuGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer130135140GlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeu145150155160ValArgProGlyAlaSerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyr165170175ThrPheThrAspTyrGluMetHisTrpValLysGlnThrProValHis180185190GlyLeuLysTrpIleGlyAlaLeuAspProLysThrGlyAspThrAla195200205TyrSerGlnLysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSer210215220SerSerThrAlaTyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerGluAspSer225230235240AlaValTyrTyrCysThrArgPheTyrSerTyrThrTyrTrpGlyGln245250255GlyThrLeuValThrValSerAlaAlaAlaAlaIleGluValMetTyr260265270ProProProTyrLeuAspAsnGluLysSerAsnGlyThrIleIleHis275280285ValLysGlyLysHisLeuCysProSerProLeuPheProGlyProSer290295300LysProPheTrpValLeuValValValGlyGlyValLeuAlaCysTyr305310315320SerLeuLeuValThrValAlaPheIleIlePheTrpValArgSerLys325330335ArgSerArgLeuLeuHisSerAspTyrMetAsnMetThrProArgArg340345350ProGlyProThrArgLysHisTyrGlnProTyrAlaProProArgAsp355360365PheAlaAlaTyrArgSerArgValLysPheSerArgSerAlaAspAla370375380ProAlaTyrGlnGlnGlyGlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeu385390395400GlyArgArgGluGluTyrAspValLeuAspLysArgArgGlyArgAsp405410415ProGluMetGlyGlyLysProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeu420425430TyrAsnGluLeuGlnLysAspLysMetAlaGluAlaTyrSerGluIle435440445GlyMetLysGlyGluArgArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyr450455460GlnGlyLeuSerThrAlaThrLysAspThrTyrAspAlaLeuHisMet465470475480GlnAlaLeuProProArgGlnAlaLysArgLysProArgLysAlaPro485490495SerArgAsnIleCysTyrAspAlaPheValSerTyrSerGluArgAsp500505510AlaTyrTrpValGluAsnLeuMetValGlnGluLeuGluAsnPheAsn515520525ProProPheLysLeuCysLeuHisLysArgAspPheIleProGlyLys530535540TrpIleIleAspAsnIleIleAspSerIleGluLysSerHisLysThr545550555560ValPheValLeuSerGluAsnPheValLysSerGluTrpCysLysTyr565570575GluLeuAspPheSerHisPheArgLeuPheAspGluAsnAsnAspAla580585590AlaIleLeuIleLeuLeuGluProIleGluLysLysAlaIleProGln595600605ArgPheCysLysLeuArgLysIleMetAsnThrLysThrTyrLeuGlu610615620TrpProMetAspGluAlaGlnArgGluGlyPheTrpValAsnLeuArg625630635640AlaAlaIleLysSer645<210>4<211>687<212>PRT<213>人工合成序列<400>4MetLeuLeuLeuValThrSerLeuLeuLeuCysGluLeuProHisPro151015AlaPheLeuLeuIleProAspValValMetThrGlnThrProLeuSer202530LeuProValSerLeuGlyAspGlnAlaSerIleSerCysArgSerSer354045GlnSerLeuValHisSerAsnGlyAsnThrTyrLeuHisTrpTyrLeu505560GlnLysProGlyGlnSerProLysLeuLeuIleTyrLysValSerAsn65707580ArgPheSerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThr859095AspPheThrLeuLysIleSerArgValGluAlaGluAspLeuGlyVal100105110TyrPheCysSerGlnAsnThrHisValProProThrPheGlySerGly115120125ThrLysLeuGluIleLysGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer130135140GlyGlyGlyGlySerGlnValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeu145150155160ValArgProGlyAlaSerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyr165170175ThrPheThrAspTyrGluMetHisTrpValLysGlnThrProValHis180185190GlyLeuLysTrpIleGlyAlaLeuAspProLysThrGlyAspThrAla195200205TyrSerGlnLysPheLysGlyLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSer210215220SerSerThrAlaTyrMetGluLeuArgSerLeuThrSerGluAspSer225230235240AlaValTyrTyrCysThrArgPheTyrSerTyrThrTyrTrpGlyGln245250255GlyThrLeuValThrValSerAlaAlaAlaAlaIleGluValMetTyr260265270ProProProTyrLeuAspAsnGluLysSerAsnGlyThrIleIleHis275280285ValLysGlyLysHisLeuCysProSerProLeuPheProGlyProSer290295300LysProPheTrpValLeuValValValGlyGlyValLeuAlaCysTyr305310315320SerLeuLeuValThrValAlaPheIleIlePheTrpValArgSerLys325330335ArgSerArgLeuLeuHisSerAspTyrMetAsnMetThrProArgArg340345350ProGlyProThrArgLysHisTyrGlnProTyrAlaProProArgAsp355360365PheAlaAlaTyrArgSerLysArgGlyArgLysLysLeuLeuTyrIle370375380PheLysGlnProPheMetArgProValGlnThrThrGlnGluGluAsp385390395400GlyCysSerCysArgPheProGluGluGluGluGlyGlyCysGluLeu405410415ArgValLysPheSerArgSerAlaAspAlaProAlaTyrGlnGlnGly420425430GlnAsnGlnLeuTyrAsnGluLeuAsnLeuGlyArgArgGluGluTyr435440445AspValLeuAspLysArgArgGlyArgAspProGluMetGlyGlyLys450455460ProArgArgLysAsnProGlnGluGlyLeuTyrAsnGluLeuGlnLys465470475480AspLysMetAlaGluAlaTyrSerGluIleGlyMetLysGlyGluArg485490495ArgArgGlyLysGlyHisAspGlyLeuTyrGlnGlyLeuSerThrAla500505510ThrLysAspThrTyrAspAlaLeuHisMetGlnAlaLeuProProArg515520525GlnAlaLysArgLysProArgLysAlaProSerArgAsnIleCysTyr530535540AspAlaPheValSerTyrSerGluArgAspAlaTyrTrpValGluAsn545550555560LeuMetValGlnGluLeuGluAsnPheAsnProProPheLysLeuCys565570575LeuHisLysArgAspPheIleProGlyLysTrpIleIleAspAsnIle580585590IleAspSerIleGluLysSerHisLysThrValPheValLeuSerGlu595600605AsnPheValLysSerGluTrpCysLysTyrGluLeuAspPheSerHis610615620PheArgLeuPheAspGluAsnAsnAspAlaAlaIleLeuIleLeuLeu625630635640GluProIleGluLysLysAlaIleProGlnArgPheCysLysLeuArg645650655LysIleMetAsnThrLysThrTyrLeuGluTrpProMetAspGluAla660665670GlnArgGluGlyPheTrpValAsnLeuArgAlaAlaIleLysSer675680685當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3