本發(fā)明屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于懸浮培養(yǎng)技術(shù)的血清4型禽腺病毒滅活苗。

背景技術(shù)：

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，分為5個種(A-E)，12個血清型。雖然在世界各地均有報(bào)道，F(xiàn)AdV感染一般引起亞臨床狀況，而急性感染主要引起包涵體肝炎、心包積液以及肌胃糜爛等。自2013年，國內(nèi)雞群由FAdV引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多。到2015年，F(xiàn)AdV感染在國內(nèi)多個省份雞群爆發(fā)。目前FAdV爆發(fā)不僅發(fā)生在3-4周齡肉雞，還發(fā)生于10-20周齡的蛋雞，給國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。病毒分離鑒定發(fā)現(xiàn)，目前高致病性血清4型FAdV在國內(nèi)雞群流行較廣泛。然目前尚無針對血清4型FAdV的商品化疫苗。在疫苗的研制中，病毒效價的高低不僅影響免疫效果，而且直接影響疫苗成本及價格。病毒的雞胚接種是禽用病毒疫苗常用的擴(kuò)增技術(shù)。雖然血清4型FAdV病毒能在雞胚中生長復(fù)制，但是雞胚中擴(kuò)增的血清4型FAdV病毒滴度較低，不能滿足疫苗生產(chǎn)高效價的要求。另外，血清4型FAdV病毒雖然能在雞肝細(xì)胞中有效復(fù)制，但是普通細(xì)胞培養(yǎng)也很難滿足疫苗的規(guī)?；a(chǎn)要求。病毒的懸浮培養(yǎng)技術(shù)可大大提高病毒效價，是高效價病毒疫苗規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)展趨勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供一基于懸浮培養(yǎng)技術(shù)的血清4型禽腺病毒滅活苗。本發(fā)明的原理和最核心的關(guān)鍵技術(shù)是利用雞肝細(xì)胞，通過激流式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)高效擴(kuò)增血清4型禽腺病毒，并研制出高效價血清4型禽腺病毒滅活苗。

一種基于懸浮培養(yǎng)技術(shù)的血清4型禽腺病毒滅活苗，所述的滅活苗的抗原為通過懸浮培養(yǎng)方法獲得的效價不低于10⁹TCID₅₀/ml的滅活后的血清4型禽腺病毒。

所述的滅活苗的抗原通過下述方法獲得：將血清4型禽腺病毒接種于雞肝細(xì)胞，利用激流式生物反應(yīng)器擴(kuò)增血清4型禽腺病毒；反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為40r/min、200g載體初始細(xì)胞接種為1×109個、細(xì)胞生長液為10％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液、病毒感染及維持液為含2％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、最適PH為7.0-7.2、病毒接種量MOI為0.1以及病毒收獲時間為接種后96小時。

本發(fā)明還公開了一種制備高效價血清4型禽腺病毒滅活苗的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)：將血清4型禽腺病毒接種于雞肝細(xì)胞，利用激流式生物反應(yīng)器擴(kuò)增血清4型禽腺病毒；懸浮培養(yǎng)激流式生物反應(yīng)器主要培養(yǎng)條件參數(shù)為：反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為40r/min、200g載體初始細(xì)胞接種為1×10⁹個、細(xì)胞培養(yǎng)液為10％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液、病毒感染及維持液為含2％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、最適PH為7.0-7.2、病毒接種量MOI為0.1以及病毒收獲時間為接種后96小時；感染后96小時后收集病毒、分裝，并測定病毒效價；

(2)血清4型禽腺病毒滅活苗制備：將以上擴(kuò)增獲得的血清4型禽腺病毒按終濃度0.1％的比例加入甲醛溶液，置37℃滅活24小時，并進(jìn)行滅活及無菌檢驗(yàn)；將滅活血清4型禽腺病毒稀釋至4×10^7.0TCID₅₀/mL，按V/V為4％的比例，向滅活病毒液中加入滅菌吐溫-80，并使吐溫-80徹底溶解，獲得水相；將3份油相導(dǎo)入乳化罐中，同時緩慢加入1份水相進(jìn)行乳化，制成血清4型禽腺病毒滅活疫苗，分裝。

血清4型禽腺病毒滅活苗免疫保護(hù)效果評價：將以上制備的滅活疫苗采用皮下接種方式免疫21日齡SPF雞，并設(shè)立未免疫雞；在免疫后21天采血分離血清，測定中和抗體水平。免疫后21天，通過胸部肌肉接種方式對免疫雞進(jìn)行100個LD50病毒量進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后連續(xù)觀察14日，統(tǒng)計(jì)免疫保護(hù)率。非免疫對照組雞為100％死亡，觀察期內(nèi)發(fā)病雞多表現(xiàn)精神沉郁、羽毛粗亂、食欲不振，剖檢可見心包積液、肝臟病變等相關(guān)組織病變；免疫組雞為100％保護(hù)，觀察期內(nèi)未見任何異?，F(xiàn)象，剖檢未見腺病毒相關(guān)組織病變。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：通過懸浮培養(yǎng)技術(shù)，研制出高效價血清4型禽腺病毒滅活苗，該疫苗效價可達(dá)10⁹TCID₅₀/ml，是傳統(tǒng)雞胚疫苗效價的100倍。高效價血清4型禽腺病毒滅活苗的制備可大大降低疫苗的成本，提供疫苗免疫效果，具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：PCR擴(kuò)增血清4型禽腺病毒特異性DNA片段

泳道1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道M：1Kb DNA Ladder。

具體實(shí)施方式

血清4型禽腺病毒JH株:(梁廣成,高巍,謝泉,張建軍,邵紅霞,秦愛建,葉建強(qiáng).一株高致病性血清4型禽腺病毒的分離與鑒定.《中國家禽》,2016年,38(19),5-28.)。

本發(fā)明以血清4型禽腺病毒JH株為例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，不應(yīng)理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例：

1、血清4型禽腺病毒JH株的分離鑒定：取疑似禽腺病毒感染的病死雞的肝臟，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成懸液；5000r/min離心15min，取上清液；加入青霉素和鏈霉素各 1000IU/ml，37℃反應(yīng)30min；經(jīng)0.45um微孔濾器過濾后，以0.2ml/胚的劑量，經(jīng)尿囊腔接種8日齡SPF雞胚，接種后96-120小時后收取尿囊液；－20℃保存。取尿囊液400μL于1.5mL指形管內(nèi)，加入400μL細(xì)胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混勻后放置56℃水浴鍋?zhàn)饔?小時；加入400uLTris平衡酚，充分混勻后10000r/min離心10分鐘，取上清液于另一1.5mL指形管；加入400μL酚：氯仿：異戊醇，充分混勻后10000r/min離心5分鐘，取上清液于另一1.5mL指形管；加入800μL無水乙醇，顛倒混勻后放入-20℃孵育30分鐘，12000r/min離心15分鐘，棄盡上清液；室溫自然干燥后向沉淀加入30μL滅菌超純水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得病毒基因組，置-20℃?zhèn)溆?。?μL提取的病毒DNA作為模板,利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(上游引物：5’-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3’SEQ ID NO.1；

下游引物：5’-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3’SEQ ID NO.2)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：模板1μL，5×Buffer10uL，10mM dNTP Mix 1μL，上游引物為10μmol 2uL，下游引物為10μmol 2uL，高保真酶1μL，加入滅菌超純水至50μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4分鐘，隨后進(jìn)行30個循環(huán)(95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分鐘)，72℃延伸10分鐘。PCR結(jié)束后，PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析(如圖1所示)。切下PCR特異性產(chǎn)物片段送至南京金斯瑞公司進(jìn)行序列分析。

2、血清4型禽腺病毒懸浮培養(yǎng)：利用激流式生物反應(yīng)器擴(kuò)增血清4型禽腺病毒。懸浮培養(yǎng)激流式生物反應(yīng)器主要培養(yǎng)條件參數(shù)為反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為40r/min、溶氧值不低于50％，200g載體初始細(xì)胞接種為1×10⁹個、細(xì)胞培養(yǎng)液為10％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)液、病毒感染及維持液為含2％FBS血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、最適PH為7.0-7.2、病毒接種量MOI為0.1以及病毒收獲時間為接種后96小時。簡要步驟如下：接種雞肝細(xì)胞后，每隔24h取樣測糖耗。當(dāng)殘?zhí)橇康陀?.5g/L，定量補(bǔ)充葡萄糖或進(jìn)行換液。當(dāng)細(xì)胞生長6天后進(jìn)行病毒的接種。通過激流袋將灌注袋及激流袋的細(xì)胞培養(yǎng)液全部排出，然后在激流袋中加入6L含200ml胎牛血清的DMEM/F12維持液，在灌注袋中接入4L不含血清的4型禽腺病毒(MOI為0.1TCID₅₀)DMEM/F12，吸附2h后，開始循環(huán)培養(yǎng)。在感染后96小時，收集病毒上清、分裝，并測定病毒效價。結(jié)果顯示通過懸浮培養(yǎng)擴(kuò)增的三批血清4型禽腺病毒效價分別達(dá)到10^9.16，10^9.25以及10^9.0TCID₅₀/ml(如表1)。

3、血清4型禽腺病毒滅活苗制備：將以上擴(kuò)增獲得的血清4型禽腺病毒按終濃度0.1％的比例加入甲醛溶液，置37℃滅活24小時。每份滅活樣接種10日齡SPF雞胚10枚進(jìn)行滅活及無菌檢驗(yàn)，并盲傳1代后，雞胚均存活，見表1。將滅活的血清4型禽腺病毒稀釋至4×10^7.0TCID₅₀/mL，按V/V為4％的比例，向滅活病毒液中加入滅菌冷卻后的吐溫-80，邊加邊 攪拌，使吐溫-80徹底溶解后即為水相。并取注射用白油94份，加入6份司本，混勻后攪拌至透明，121℃高壓滅菌30分鐘，冷卻后制備成油相。將3份油相導(dǎo)入乳化罐中，開動電機(jī)，緩慢攪拌，同時緩慢加入1份水相。通過4000轉(zhuǎn)/分剪切乳化，使油相和水相以3:1的比例進(jìn)行乳化。乳化結(jié)束后，取樣10mL疫苗加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過0.5mL，即為滅活疫苗。

4、血清4型禽腺病毒滅活苗免疫保護(hù)效果評價：將以上制備的滅活疫苗采用皮下接種方式免疫21日齡SPF雞，0.3mL/只，10只/組，并設(shè)立未免疫雞；在免疫后21天采血分離血清，測定中和抗體水平。中和抗體水平測定簡要步驟如下：將血清作2倍系列倍比稀釋后，取2^-3～2^-910個梯度與100TCID₅₀/0.1mL的標(biāo)準(zhǔn)抗原各100μL，37℃作用1小時后接種雞肝細(xì)胞，同時設(shè)陽性對照孔和正常細(xì)胞對照孔，6孔/組。置37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)觀察5日，記錄病變孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算各血清的抗禽腺病毒中和抗體效價。在免疫后21天，通過胸部肌肉接種方式對免疫雞進(jìn)行100個LD50病毒量進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后連續(xù)觀察14日，統(tǒng)計(jì)免疫免疫保護(hù)率。中和抗體檢測結(jié)果顯示，免疫組雞于免疫后21天，1501、1502和1503三個批次疫苗免疫組中和抗體效價分別為1:110.4、1:92.4和1:97.1，對照組于免疫后21天中和抗體效價均不高于1:2(表2)。

表2免疫和攻毒結(jié)果

攻毒保護(hù)結(jié)果顯示(表2)，免疫后21天攻毒，非免疫對照組雞為100％死亡，觀察期內(nèi)發(fā)病雞多表現(xiàn)精神沉郁、羽毛粗亂、食欲不振，剖檢可見心包積液、肝臟病變等相關(guān)組織病變；免疫組雞為100％保護(hù)，觀察期內(nèi)未見任何異?，F(xiàn)象，剖檢未見腺病毒相關(guān)組織病變。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

國藥集團(tuán)揚(yáng)州威克生物工程有限公司

福建圣維生物科技有限公司

<120> 一種血清4型禽腺病毒滅活苗及其制備方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatttcgacc ccatgacgcg ccagg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggcgaaagg cgtacggaag taagc 25