一種雙表達盒高抗草甘膦載體及其在水稻上的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領域。本發(fā)明公開了一種載體，該載體可在水稻的生長發(fā)育期全程表達，并且在幼穗分化期花器官組織特異性地增強表達?？捎糜谂嘤共莞熟⒆魑铩Ｔ撦d體由雙表達盒組成，其中一個表達盒由水稻幼穗分化期特異表達基因Rfl啟動子、水稻葉綠體轉運肽、抗草甘膦基因和終止子組成；另一個表達盒由組成型啟動子Ubiquitin、葉綠體轉運肽、抗草甘膦基因以及終止子組成。利用該載體獲得的轉基因水稻，其在生長發(fā)育的所有組織器官對草甘膦有較高抗性外，在水稻幼穗分化期提高花器官組織對草甘膦的抗性，解除草甘膦對水稻花器官的損害，保證水稻的產(chǎn)量。
【專利說明】
一種雙表達盒高抗草甘膦載體及其在水稻上的應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及植物基因工程領域，尤其是涉及一種載體可在水稻營養(yǎng)生長期所有組織中表達，同時特異性地在幼穗分化期花器官組織中增強表達及其在培育抗草甘膦水稻中的應用。
【背景技術】
[0002]草甘膦是目前使用最為廣泛的除草劑品種。由于草甘膦是傳導性廣譜除草劑，可以有效防除大多數(shù)一年生、多年生雜草以及一些與糧食作物親緣關系近的難治雜草，如:野生稻、赤稻、李氏禾稻、匍匐剪股穎等，被廣泛應用于水稻等重要糧食作物的雜草防治;而且草甘膦具有價格低廉、在人和哺乳動物植物體內(nèi)不代謝、對環(huán)境友好，無殘留活性、植物不易產(chǎn)生抗性等特點，自1974年在美國注冊登記以來，已使用30多年，現(xiàn)在仍然是世界銷量最大的農(nóng)藥。
[0003]草甘膦是一種非選擇性除草劑，它通過競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)干擾芳香族氨基酸的生物合成而發(fā)揮毒性作用。其作用機理是草甘膦與EPSPS和三磷酸莽草酸S3P結合形成非常穩(wěn)定的EPSPS - S3P -草甘膦復合體，此復合體抑制EPSPS的活性導致分支酸合成受阻，阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最終導致一些激素和關鍵性代謝物如類黃酮、木質(zhì)素和酚類化合物代謝失調(diào)，從而擾亂了生物體正常的氮代謝而使植物死亡。
[0004]草甘膦作為一種非選擇性除草劑，它所影響的植物生理生長過程是雜草和作物都具有的，因而具有無法有效區(qū)分作物和雜草的缺點，這很大程度上的限制了草甘膦的應用。從上世紀八十年代起，抗草甘膦作物基因工程一直備受關注，眾多EPSPS抗性突變體被分離后均被轉化到植物中進行草甘膦抗性檢測，以期獲得草甘膦抗性作物。以孟山都研發(fā)的轉CP4EPSPS轉基因大豆為主的抗草甘膦大豆在全世界廣泛種植，至2015年全球種植轉基因大豆近22200萬公頃，其中絕大部分為抗除草劑性狀或是兼具抗除草劑及其他性狀的復合性狀轉基因大豆。
[0005]水稻幼穗分化與水稻產(chǎn)量密切相關，幼穗分化期對環(huán)境非常敏感，不良的環(huán)境條件極易影響水稻幼穗的正常分化，進而影響產(chǎn)量。在水稻幼穗分化期前后，如果草甘膦施用不當，就會造成水稻減產(chǎn)。因此培育兼具營養(yǎng)生長期高效表達和幼穗分化期花器官特異表達的抗除草劑水稻，不僅在營養(yǎng)生長期能夠解除草甘膦對水稻的毒害，在水稻幼穗分化關鍵期也能有效緩解草甘膦對水稻幼穗分化的影響，這對于保證轉基因抗草甘膦水稻的產(chǎn)量具有積極意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種能在水稻營養(yǎng)生長期所有組織中高效表達并且在水稻幼穗發(fā)育期花器官組織特異表達的植物表達載體，該載體包含2個表達盒。所述載體由2個表達盒組成，表達盒I由Rf I啟動子、轉運肽、抗草甘膦基因和終止子組成;表達盒2由Ubiquitin啟動子、轉運肽、抗草甘膦基因以及終止子組成。
[0007]所述載體包含的表達盒之一由水稻幼穗發(fā)育特異表達基因Rfl啟動子、水稻轉運肽OsCTP、水稻抗草甘膦突變基因epspM和T-no s組成，該表達盒具有使水稻莖端及幼穗分化期高效表達抗草甘膦基因epspM的作用。
[0008]所述水稻幼穗發(fā)育特異表達基因Rfl啟動子的堿基如SEQ ID NO:1所示。該序列是啟動5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因在莖端以及幼穗分化期超高表達的序列。
[0009]所述水稻轉運肽OsCTP的堿基如SEQID NO:2所示。該序列所表達的蛋白的作用是將5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)蛋白轉運到葉綠體中。
[0010]所述水稻抗草甘膦突變基因為epspM(—種水稻EPSP合酶突變體及其編碼基因、獲得方法與應用，ZL200510002739.7)。
[0011]所述終止子為T-nos。
[0012]所述載體包含的表達盒之二由Ubiquitin啟動子、水稻轉運肽OsCTP、水稻抗草甘膦突變基因epspM和T-nos組成，該載體具有使水稻在營養(yǎng)生長中所有組織高效表達抗草甘膦基因epspM的作用。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點在于:水稻幼穗分化與水稻產(chǎn)量密切相關，幼穗分化期對環(huán)境極其敏感，不良的環(huán)境條件極易影響水稻幼穗的正常分化，進而影響產(chǎn)量?，F(xiàn)有的轉單基因組成型抗草甘膦水稻，不足以保護幼穗分化期前，草甘膦施用不當，就會造成水稻減產(chǎn)。因此培育兼具營養(yǎng)生長期高效表達和幼穗分化期花器官特異表達的抗除草劑水稻，不僅在營養(yǎng)生長期能夠解除草甘膦對水稻的毒害，在水稻幼穗分化關鍵期也能有效緩解草甘膦對水稻幼穗分化的影響，這對于保證轉基因抗草甘膦水稻的產(chǎn)量具有積極意義。
【附圖說明】
[0014]圖1雙表達盒抗草甘膦植物表達載體pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rfl-Osctp-OsEpspsM圖譜。
[0015]圖2 轉pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf1-Osctp-OsEpspsM水稻Hyg基因擴增結果；1-10為轉基因陽性株;N為非轉基因植株陰性對照；12為重組質(zhì)粒陽性對照;M為DL2000 DNA Marker。
[0016]圖3用濃度為0.39g/m2(平均每株純受藥量為0.0216g)的草甘膦藥液處理14天后的轉基因水稻植株。其中:A為清水處理的非轉基因水稻植株對照;B為噴施草甘膦的非轉基因植株對照;C是噴施草甘膦后的轉雙表達盒載體重組質(zhì)粒pCDMAR-Ub1-0sctp-0sEpspsM-Tnos-Rf 1-Osctp-OsEpspsM 的轉基因植株。
[0017]圖4用濃度為0.39g/m2(平均每株純受藥量為0.0216g)的草甘膦藥液處理后，轉基因水稻穎花分化后期幼穗發(fā)育情況。其中A1-D1:為轉單表達盒的Ub1-OsEpspsM轉基因植株;A2-D2:轉雙表達盒 pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf 1-Osctp-OsEpspsM 的轉基因植株;A3-D3:為不噴藥的非轉基因材料。A1、A2、A3:噴施草甘膦前的幼穗發(fā)育情況;B1、B2、B3:施用草甘膦后的第7天;C1、C2、C3:施用草甘膦后的第14天;D1、D2、D3:施用草甘膦后的第23天幼穗剝查情況。
【具體實施方式】
[0018]以下結合具體實施對本發(fā)明的技術路線進一步詳細說明。
[0019]實施例一雙表達盒抗草甘膦植物表達載體
1.Rfl啟動子克隆:采用CTAB法提取水稻基因組DNA。從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找水稻Rf I基因序列，截取Rf I基因起始密碼子5 ’上游2000 bp為啟動子區(qū)，設計引物:F: 5 ’ -TACAAAAATTTCGACTAAACTCG-3 ’，R: 5 ’-TTTATCGTCATCATGGCCACCGC-3 ’ 克隆啟動子，獲得長度為2001bp的片段?；厥詹⒓兓撈?，測序后加polyA尾。
[0020]2.雙表達盒高效特異植物表達載體構建
⑴將 PUEP(pCAMBIA1300-Ub1-epspsM-Tnos)中 Ubi 啟動子切除。
[0021]⑵將Rfl啟動子片段連接到上述的去除Ubi啟動子的HJEP骨架中，用HindIII +EcoRV雙酶部分切5min，得到Rf l-Osctp-epspsM-Tnos表達框片段。
[0022]⑶用BamM酶切pCDMAR-Hyg載體，Klenow酶補平、CIAP去磷酸化。
[0023]⑷將pCDMAR-Hyg 載體骨架與 Rf l-Osctp-epspsM-Tnos表達框連接得到pCDMAR-Rfl-Osctp-epspsM-Tnos載體，用HindIII酶切鑒定。
[0024](5)口001\^1?-1^1-08(^口-6口8口8]\1-1'110 8用31]1&1酶切后，連接另一個表達框Ub1-Osctp-epspsM-Tnos得到雙元表達載體，pCDMAR-Rf 1-Osc tp-epspsM-Tno s-Ub1-Osctp-epspsM-Tnos，用 BgLII 和把11(1111分別單酶切鑒定，經(jīng)鑒定，兩個1^1-08(^。-6。8。8]\1-1'1108和Ub1- Osctp-epspsM-Tnos表達框方向是相對的。
[0025]實施例二轉pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf1-Osctp-OsEpspsM水稻材料獲得
米用農(nóng)桿菌介導法獲得轉 pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf 1-Osctp-OsEpspsM 水稻，具體步驟如下:
1.胚性愈傷組織的誘導與繼代
取水稻授粉后15-20d的未成熟穗，剝殼后用75%乙醇浸泡lmin，再轉入25wt.%的次氯酸鈉溶液中振蕩滅菌25min，于超凈工作臺中無菌水沖洗3-5次，將消毒后種子的幼胚挑出并接種于誘導培養(yǎng)基中，每皿約30粒，于28°C暗培養(yǎng)7d，切除胚根，繼續(xù)培養(yǎng)7d，待愈傷長大后進行繼代培養(yǎng)。從第三代開始可以選擇適當?shù)呐咝杂鷤糜谵r(nóng)桿菌轉化。
[0026]2.愈傷組織的預培養(yǎng)
選取自然分散、顏色鮮黃、直徑約為2-3_的顆粒狀愈傷，轉接到預培養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于27 °C暗培養(yǎng)4天。
[0027]3.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及處理
從低溫(_85°C)凍存管中刮取少量菌液于附加卡那霉素50 mg.!/1和利福平50 mg-L—1YEB固體培養(yǎng)基劃線，然后在28°C暗培養(yǎng)36?72h進行活化;取活化平板上的單菌落轉接劃菌，28°C培養(yǎng)兩天后，用適量添加有100μΜ.L—1乙酰丁香酮的AAM培養(yǎng)基(配方見附錄3)將菌洗脫，懸浮于添加有ΙΟΟμΜ.!/1乙酰丁香酮20 ml AAM培養(yǎng)基中，劇烈搖動Imin后，調(diào)整菌液濃度至0D600nm=l.5~2.0，靜置Ih，以便讓農(nóng)桿菌形成懸浮液。
[0028]4.共培養(yǎng)
取經(jīng)預培養(yǎng)的愈傷于滅菌的培養(yǎng)瓶中，加入上述處理的農(nóng)桿菌菌液，略微搖動后靜置30min，于無菌濾紙上瞭干愈傷后接種于共培養(yǎng)基上，25 °C暗培養(yǎng)3d。
[0029]5.洗除農(nóng)桿菌
挑取共培養(yǎng)后的愈傷于廣口培養(yǎng)瓶中，用無菌水沖洗3-5次，每次搖動數(shù)次，直至水中不見絲狀菌體。最后一次用含250 mg.!/1羧卞青霉素的無菌水靜置lh，然后置于無菌濾紙上晾干。
[0030]6.愈傷組織的篩選
將愈傷轉移至選擇培養(yǎng)基中進行抗性愈傷的篩選，每兩周轉接I次。
[0031]7.轉化植株再生
將抗性愈傷轉移至分化培養(yǎng)基上，2周后愈傷開始轉綠，3周后即可長出幼芽，隨后根也長出。將幼苗移至生根培養(yǎng)基上，每培養(yǎng)瓶I個克隆。待幼苗生根長成后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈根上的培養(yǎng)基后，移至溫室盆栽。
[0032]實施例三轉pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf1-Osctp-OsEpspsM水稻材料的分子檢測
1.提取轉基因水稻及費轉基因水稻葉片總DNA，根據(jù)基因序列設計特異性引物，F(xiàn):5’_GAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3’，R:5 ’-TGCTCCATACAAGCCAACCAC- 3’
進行PCR擴增檢測，篩選PCR擴增片段大小與預期大小一致的陽性株進行進一步的分子檢測。
[0033]2 JlPCR反應體系 Templatelug Primerl (5μΜ) IuL Primer2 (5μΜ) IuL Golden DNA Polymerase 0.4uL 2XReact1n Mix 12.5uL ddH20 9.1uL
3.PCR反應程序:
94°C 5min；{94°C 45s/90s，60°C/65°C/56°C(根據(jù)引物設定退火溫度)30s/ 60s，72°C 45s/90s(根據(jù)擴增片段長短確定延伸溫度)}35個循環(huán);72°C，10min。
[0034]
實施例四轉pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf1-Osctp-OsEpspsM水稻對草甘勝的抗性檢測
1.對移栽后35天的轉基因植株噴施濃度為高于商業(yè)推薦使用濃度3倍的草甘膦即(0.39g/m2，平均每株純受藥量為0.0216g)，同時以清水噴施非轉基因水稻為陰性對照，以同濃度草甘膦噴施非轉基因水稻為陽性對照，以轉單表達盒pCDMAR-Ub1-0sctp-0sEpspsM-Tnos的轉基因水稻為另一陽性對照。14天后調(diào)查結果顯示:非轉基因對照植株枯死;噴施草甘勝的轉單表達盒pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos和轉雙表達盒pCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf 1-Osctp-OsEpspsM基因水稻均生長良好，沒有產(chǎn)生明顯可見的藥害。
[0035]2.進一步對噴藥后的水稻材料莖尖每3天剝查，觀察草甘膦對水稻穎花發(fā)育的影響。結果顯示:噴藥后14天轉單表達盒pCDMAR-Ub1-0sctp-0sEpspsM-Tnos水稻與未噴藥的非轉基因植株比較，其穎花分化大大延遲，而轉雙表達盒pCDMAR-Ub1-0sctp-0sEpspsM-Tnos-Rf 1-Osctp-OsEpspsM水稻，其穎花分化幾乎與未噴藥的非轉基因水稻同步，沒有被延遲;噴藥后23天，轉單價載體的轉基因植株的穎花分化略有恢復，但是此時轉雙價載體的轉基因水稻和未噴藥的對照水稻的幼穗幾乎發(fā)育完成。研究結果表明轉雙表達盒PCDMAR-Ub1-Osctp-OsEpspsM-Tnos-Rf 1-Osctp-OsEpspsM基因水稻不僅在營養(yǎng)生長期能夠解除草甘膦對水稻的毒害，在水稻幼穗分化關鍵期也能有效緩解草甘膦對水稻幼穗分化的影響，這對于保證轉基因抗草甘膦水稻的產(chǎn)量具有積極意義。
[0036]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種抗草甘膦植物表達載體，其特征在于:所述載體由2個表達盒組成，表達盒I由Rf I啟動子、轉運肽、抗草甘膦基因和終止子組成;表達盒2由Ub iqui t in啟動子、轉運肽、抗草甘膦基因以及終止子組成。2.根據(jù)權利要求1所述的一種抗草甘膦植物表達載體，其特征在于:所述Rfl啟動子堿基序列如SEQ ID NO:1所不。3.根據(jù)權利要求1所述的一種抗草甘膦植物表達載體，其特征在于:所述轉運肽OsCTP喊基序列如SEQ ID NO:2所不。4.根據(jù)權利要求1所述的一種抗草甘膦植物表達載體，其特征在于:所述抗草甘膦基因來源于水稻epsps的突變基因epspsM。5.根據(jù)權利要求1所述的一種抗草甘膦植物表達載體，其特征在于:所述終止子為T-noso6.如權利要求1-5中任意所述的抗草甘膦植物表達載體在培育抗草甘膦水稻中的應用。
【文檔編號】C12N15/82GK105861541SQ201610444772
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】蘇軍, 王 鋒, 胡太蛟, 劉霞, 林智敏, 李剛, 顏靜宛
【申請人】福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所