專利名稱：一種使用液相色譜-質(zhì)譜檢測轉(zhuǎn)基因大豆中痕量黃酮類代謝物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因大豆中痕量黃酮類代謝物的方法及黃酮類物質(zhì)分子印跡聚合物的合成方法。
背景技術(shù)：
自抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆商品化以來，已經(jīng)建立了不少的檢測方法，以檢測核酸為目標(biāo)的各種PCR檢測技術(shù)以及PCR快速檢測試劑盒；以檢測外源蛋白為目標(biāo)的ELISA檢測技術(shù)以及酶聯(lián)免疫快速檢測試紙條、試劑盒，這些檢測方法都可以為鑒定轉(zhuǎn)基因作物以及為轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全評價提供技術(shù)支持。但是自中國2009年批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)安全證書的釋放，成為第一個批準(zhǔn)主糧商業(yè)化種植的國家后，對轉(zhuǎn)基因作物安全性評價、特別是轉(zhuǎn)基因作物在食品安全性評價方面提出更高的要求。生物信息是按DNA — mRNA—蛋白質(zhì)一代謝產(chǎn)物方向流動的，代謝物是細(xì)胞調(diào)控過程的終產(chǎn)物，它們的種類和數(shù)量變化被視為生物系統(tǒng)對基因或環(huán)境變化的最終響應(yīng) (Fiehn, 2002)，轉(zhuǎn)基因作物均是通過調(diào)控基因的表達(dá)來控制目的性狀的改變，基因表達(dá)上極微小的變化即可導(dǎo)致代謝物種類、含量、分布的大幅改變。因此，對轉(zhuǎn)基因作物代謝物的分離鑒定，檢測分析可以為生物安全、特別是食品安全相關(guān)預(yù)警信號提供一個預(yù)知平臺。由于植物代謝物在時間和空間都具有高度的動態(tài)性(Stitt et al.，2003)，尤其是次生代謝物種類繁多、結(jié)構(gòu)迥異，且產(chǎn)生和分布通常有種屬、器官、組織以及生長發(fā)育時期的特異性，難于進(jìn)行分離分析，所以人們一直在尋找更為強(qiáng)大的檢測分析工具與方法。對代謝組的分析力求可檢測樣品中的每種代謝物，并可監(jiān)測各種條件變化下代謝物的變化。 在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食品安全分析上，利用代謝組學(xué)工具發(fā)現(xiàn)外源基因在目標(biāo)植物體內(nèi)表達(dá)的相關(guān)代謝物標(biāo)志物可以為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在安全性評價方面提供一種新的技術(shù)。代謝組學(xué)的研究方法與蛋白質(zhì)組學(xué)的方法類似，通常有兩種方法。一種方法稱作代謝物指紋分析(Metabolomic fingerprinting)，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的方法，比較不同樣品中各自的代謝產(chǎn)物以確定其中所有的代謝產(chǎn)物。代謝指紋分析涉及比較不同個體中代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰，最終了解不同化合物的結(jié)構(gòu)，建立一套完備的識別這些不同化合物特征的分析方法。另一種方法是代謝輪廓分析(Metabolomic profiling)，研究人員假定了一條特定的代謝途徑，并對此進(jìn)行更深入的研究，再結(jié)合模式識別方法，有可能找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物(Biomarker)。用于代謝物檢測的主要技術(shù)手段是核磁共振(NMR)，質(zhì)譜(MS)，色譜(HPLC，GC)。 對于代謝產(chǎn)物來說，不僅只有質(zhì)譜峰這個特征，由于質(zhì)譜只能檢測離子化的物質(zhì)，但有些代謝產(chǎn)物在質(zhì)譜儀中不能被離子化，因此，質(zhì)譜(MS)并不能檢測出所有的代謝產(chǎn)物。此外，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物的同質(zhì)性不高，由于缺乏均勻性，使色譜分析變得更加困難，無法識別出樣品中的未知物質(zhì)。采用核磁共振(NMR)的方法，可以彌補(bǔ)色譜的不足，但由于核磁共振檢測的靈敏度不高，所以只用于分析低豐度代謝產(chǎn)物。因此，對代謝產(chǎn)物的分析最大的挑戰(zhàn)就是對代謝產(chǎn)物的識別以及高效的檢測方法?？共莞熟⑥D(zhuǎn)基因大豆中外源EPSPS基因的表達(dá)可能導(dǎo)致黃酮類代謝物在種類以及含量上的差異，我們探索通過分析轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因大豆間黃酮類代謝物的差異，進(jìn)而判斷是否是轉(zhuǎn)基因大豆的技術(shù)難點(diǎn)在于如何分離富集大豆中的黃酮，提高檢測的靈敏度和特異性。本發(fā)明就是利用可以特異性吸附黃酮的分子印跡聚合物作為分離富集材料，從基質(zhì)中分離黃酮，并與液相色譜_質(zhì)譜聯(lián)機(jī)建立在線檢測方法，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆中痕量黃酮的準(zhǔn)確檢測。

發(fā)明內(nèi)容
利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)痕量檢測轉(zhuǎn)基因大豆中黃酮類代謝物的方法。1、一種可以檢測轉(zhuǎn)基因大豆植株中痕量黃酮的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其特征在于使用具備對轉(zhuǎn)基因大豆植株中黃酮類化合物有特異性吸附的分子印跡材料作為填充材料的固相萃取柱與液相色譜-質(zhì)譜儀在線聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因大豆中痕量黃酮的準(zhǔn)確檢測。2、黃酮分子印跡材料的制備方法包括下面兩個步驟1)使用蘆丁作為模板分子，二烯丙基胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，模板分子、交聯(lián)劑和功能單體按照摩爾比例為1 6 9溶解到含水30%的乙醇中，加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈，緩慢通入氮?dú)?5min，365nm紫外光照射引發(fā)聚合12h ；2)反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)過粉碎、過篩，取粒徑大小為80-125 μ m的顆粒，以50mL乙醇和50mL 1. Omol L—1鹽酸的混合溶液攪拌洗滌6h，用體積比為9 1的乙醇-冰乙酸混合溶液索氏提取24h，進(jìn)一步去除模板分子，將除去模板分子的聚合物在70°C真空干燥10h， 即可作為固相萃取柱的填充材料；3、分子印跡材料在固相萃取柱中的填料量決定于萃取柱的容量，一般為萃取柱體積的5%，本發(fā)明使用容積為2毫升的萃取柱，分子印跡材料填料為10毫克；4、固相萃取柱與流動注射儀的連接方式為將流動注射儀的出樣端與固相萃取柱的進(jìn)樣端聯(lián)接，萃取柱的出樣端與液相色譜進(jìn)樣口相聯(lián)，通過液相色譜分離和質(zhì)譜檢測可以同時檢測大豆植株中27種黃酮類化合物，具體化合物見下表
權(quán)利要求
1.一種可以檢測轉(zhuǎn)基因大豆植株中痕量黃酮的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其特征在于使用具備對轉(zhuǎn)基因大豆植株中黃酮類化合物有特異性吸附的分子印跡材料作為填充材料的固相萃取柱與液相色譜-質(zhì)譜儀在線聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因大豆中痕量黃酮的準(zhǔn)確檢測。
2.權(quán)利要求1所述及的黃酮分子印跡材料，其制備方法包括如下步驟1)使用蘆丁作為模板分子，二烯丙基胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，模板分子、交聯(lián)劑和功能單體按照摩爾比例為1 6 9溶解到含水30%的乙醇中， 加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈，緩慢通入氮?dú)?5min，365nm紫外光照射引發(fā)聚合12h ；2)反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)過粉碎、過篩，取粒徑大小為80-125μ m的顆粒，以50mL乙醇和 50mLl. Omol Γ1鹽酸的混合溶液攪拌洗滌6h，用體積比為9 1的乙醇-冰乙酸混合溶液索氏提取24h，進(jìn)一步去除模板分子，將除去模板分子的聚合物在70°C真空干燥10h，即可作為固相萃取柱的填充材料。
3.權(quán)利要求1所述及的固相萃取柱其特征在于所使用的分子印跡材料填料為10毫克。
4.權(quán)利要求1所述及的檢測方法，其特征在于將固相萃取柱通過流動注射儀與液相色譜_質(zhì)譜儀連接，可以同時檢測大豆植株中27種黃酮類化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)基因大豆中痕量黃酮的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，其主要的技術(shù)要點(diǎn)是使用蘆丁作為模板分子，二烯丙基胺作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑，模板分子、交聯(lián)劑和功能單體按照摩爾比例為1∶6∶9溶解到含水30％的乙醇中，加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈，緩慢通入氮?dú)?5min，365nm紫外光照射引發(fā)聚合12h，合成分子印跡材料作為固相萃取柱的填充材料，將所制備的固相萃取柱與液相色譜-質(zhì)譜通過流動注射儀聯(lián)接，建立在線檢測方法，實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因大豆中痕量黃酮的準(zhǔn)確檢測。所建立的檢測方法可以為鑒定抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆提供一種新的手段。
文檔編號G01N30/02GK102466660SQ20101054558
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者林敏 , 王俊平, 王俊英 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所