專(zhuān)利名稱(chēng)：糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種糜蛋白酶的新用途，具體是糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
使用有機(jī)殺蟲(chóng)劑(農(nóng)藥)是消滅農(nóng)業(yè)和衛(wèi)生害蟲(chóng)，保障農(nóng)作物增產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)及人類(lèi)健康的經(jīng)濟(jì)有效的手段。目前使用的有機(jī)殺蟲(chóng)劑以有機(jī)磷和菊酯類(lèi)為主。長(zhǎng)期以來(lái)，由于過(guò)多過(guò)濫地使用殺蟲(chóng)劑，致使農(nóng)產(chǎn)品、土壤和水源中的殺蟲(chóng)劑大量殘留，污染日趨嚴(yán)重。尋求有效的方法降解殺蟲(chóng)劑，減少對(duì)環(huán)境及人體健康的危害是目前迫切需要解決的問(wèn)題。
生物處理戰(zhàn)略對(duì)根除和減少殺蟲(chóng)劑殘留具有較大的潛力。例如，可將污染的農(nóng)產(chǎn)品、水源和土壤通過(guò)含酶的生物發(fā)生器，降解殺蟲(chóng)劑，從而減少其殘留水平和時(shí)間。
糜蛋白酶屬絲氨酸蛋白酶家族，生理學(xué)功能包括攝食蛋白的消化、血液凝固、免疫反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、激素活化和發(fā)育，其在昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)中腸大量表達(dá)，參與攝食蛋白的消化。有研究顯示，鱗翅類(lèi)昆蟲(chóng)中腸絲氨酸蛋白酶可降解其體內(nèi)病原體蘇云金桿菌的伴孢晶體蛋白，從而抵抗蘇云金桿菌對(duì)昆蟲(chóng)的殺傷力。申請(qǐng)人在先前的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?2112820.0)的說(shuō)明書(shū)第1頁(yè)，提到“糜蛋白酶基因在抗溴氰菊酯淡色庫(kù)蚊中高表達(dá)，因此推測(cè)淡色庫(kù)蚊糜蛋白酶基因可能與淡色庫(kù)蚊抗溴氰菊酯抗藥性有關(guān)?！钡?，該申請(qǐng)僅根據(jù)糜蛋白酶基因在抗溴氰菊酯淡色庫(kù)蚊中高表達(dá)的特點(diǎn)，不能充分表明該基因(淡色庫(kù)蚊糜蛋白酶)與淡色庫(kù)蚊抗溴氰菊酯抗藥性有關(guān)，有待進(jìn)一步的深入研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種糜蛋白酶的新用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案是糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用。
上述技術(shù)方案中所說(shuō)的有機(jī)殺蟲(chóng)劑可以是但不限于有機(jī)磷類(lèi)、菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑。
上述技術(shù)方案中所說(shuō)的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑可以是但不限于馬拉硫磷、二嗪農(nóng)殺蟲(chóng)劑，菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑可以是但不限于溴氰菊酯、高效氯氰菊酯殺蟲(chóng)劑。
上述技術(shù)方案中所說(shuō)的糜蛋白酶優(yōu)選但不限于淡色庫(kù)蚊糜蛋白酶、牛源性糜蛋白酶。
發(fā)明人應(yīng)用基因重組及蛋白表達(dá)技術(shù)，將在殺蟲(chóng)劑抗性蚊蟲(chóng)中高表達(dá)的糜蛋白酶基因片段克隆到pET-32a(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建pET-32a(+)/NYD-Ch重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳金屬螯合親和層析后獲得重組蛋白，復(fù)性為活性蛋白；將糜蛋白酶活性蛋白與溴氰菊酯共同對(duì)蚊四齡幼蟲(chóng)進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果蚊敏感和抗性品系的LC50分別提高0.022和2.8ug/ml，表明表達(dá)的糜蛋白酶能使溴氰菊酯降解。
用NYD-Ch表達(dá)蛋白作用溴氰菊酯后進(jìn)行氣相色譜分析顯示，隨著NYD-Ch濃度的增加，溴氰菊酯含量逐漸下降，表明糜蛋白酶對(duì)溴氰菊酯有直接降解作用；質(zhì)譜分析進(jìn)一步顯示，NYD-Ch可將溴氰菊酯分解為對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)毒的二溴乙烯二甲基環(huán)丙烷羧酸(Br2CA)和苯氧基安息香酸(3-PBA)。在24小時(shí)內(nèi)，10mg NYD-Ch表達(dá)蛋白可降解4.03ug溴氰菊酯，降解率達(dá)80.6％。
上述的糜蛋白酶對(duì)高效氯氰菊酯、馬拉硫磷、二嗪農(nóng)殺蟲(chóng)劑也表現(xiàn)出降解作用。牛源性糜蛋白酶與NYD-Ch同屬于絲氨酸蛋白酶超家族成員，氨基酸比對(duì)顯示出比較高的同源性。進(jìn)一步用牛源性糜蛋白酶進(jìn)行對(duì)殺蟲(chóng)劑降解測(cè)定，亦獲得相似結(jié)果。
由于糜蛋白酶可直接降解有機(jī)殺蟲(chóng)劑，且通過(guò)基因工程可大量生產(chǎn)，其作為降解劑的應(yīng)用，可以理解，所說(shuō)的應(yīng)用可以具體是但不限于以下方式，如將糜蛋白酶添加于現(xiàn)有的蔬果清洗劑或清潔劑中、用糜蛋白酶來(lái)治理被有機(jī)殺蟲(chóng)劑污染的土壤和廢水以及用糜蛋白酶對(duì)有機(jī)殺蟲(chóng)劑中毒的人、畜進(jìn)行解毒等。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在，提供了一種糜蛋白酶的新用途，為大規(guī)模應(yīng)用于清除農(nóng)產(chǎn)品表面的殘留殺蟲(chóng)劑、治理被殺蟲(chóng)劑污染的土壤和廢水、對(duì)殺蟲(chóng)劑中毒后人、畜的解毒提供新的途徑。


圖1為重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)/NYD-Ch的構(gòu)建示意圖。
圖2為NYD-Ch在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)、純化的SDS-PAGE分析；其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為空載菌對(duì)照；2為未誘導(dǎo)的NYD-Ch重組菌對(duì)照；3為誘導(dǎo)表達(dá)的NYD-Ch重組菌；4為純化的NYD-Ch重組表達(dá)蛋白。
圖3為NYD-Ch重組蛋白的Western Blot鑒定分析；其中M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為誘導(dǎo)表達(dá)的NYD-Ch重組蛋白；2為空載對(duì)照。
圖4為pH對(duì)NYD-Ch酶活力的影響。
圖5為NYD-Ch及其降解產(chǎn)物的GC分析；其中A為NYD-Ch；B為溴氰菊酯；C為NYD-Ch與溴氰菊酯作用后的降解產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
實(shí)施例1淡色庫(kù)蚊糜蛋白酶(NYD-Ch)對(duì)溴氰菊酯的降解作用1)采用基因重組法，構(gòu)建NYD-Ch原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)根據(jù)淡色庫(kù)蚊糜蛋白酶基因全長(zhǎng)序列(參見(jiàn)GENBANK登記號(hào)AF468495)設(shè)計(jì)引物上游引物L(fēng)5′-CGGAATTCAACATGGCATCGAAACTGACGGT-3′下游引物R5′-ACTAGCGGCCGCTTA AGCATCCTGACGCAGCTG-3′在上游引物中引入EcoR I酶切位點(diǎn)(GAATTC)，并且在酶切位點(diǎn)的上游引進(jìn)保護(hù)性堿基CG；下游引物中引進(jìn)Not I酶切位點(diǎn)(GCGGCCGC)，其外側(cè)引進(jìn)保護(hù)性堿基ACTA，從而保證內(nèi)切酶的酶切效率。
采用PCR方法擴(kuò)增NYD-Ch全長(zhǎng)序列(813bp)，構(gòu)建原核克隆載體pGEM-T/NYD-Ch，構(gòu)建示意圖如圖1所示，PCR和測(cè)序鑒定無(wú)誤后通過(guò)雙酶切，將目的基因片斷亞克隆至表達(dá)載體pET-32a(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)/NYD-Ch并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化的重組菌用1mMIPTG在37℃誘導(dǎo)4小時(shí)以表達(dá)目的蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色判斷分子量大小。如圖2所示，可知在50kD處有明顯的表達(dá)蛋白，和理論上的NYD-Ch蛋白分子量一致。
2)采用金屬螯合親和層析方法純化NYD-Ch表達(dá)蛋白并鑒定表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)離心收集細(xì)菌總蛋白、超聲破碎細(xì)胞后，用Ni-NTA純化表達(dá)的目的蛋白。用Western blot方法鑒定特異性表達(dá)，如圖3所示，可知NC膜上出現(xiàn)50kD的顯色帶，和預(yù)設(shè)的相當(dāng)，空載對(duì)照組未見(jiàn)顯色條帶出現(xiàn)。
3)采用酶促底物法，用特異性底物測(cè)定表達(dá)蛋白的活性選用BTEE和S(Ala)2ProPhe-pNA作為糜蛋白酶特異性底物，在不同pH下對(duì)NYD-Ch表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定。將酶液與底物在pH為4.0，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，9.0，10.0的緩沖液中30℃反應(yīng)20min，各對(duì)應(yīng)的pH梯度分別以不加酶液的底物為對(duì)照，通過(guò)測(cè)定不同pH條件下的酶活力，確定酶的最適反應(yīng)PH。如圖4可知，NYD-Ch最大活力通過(guò)S(Ala)2ProPhe-pNA獲得，酶的活力隨著pH的增高而增大，在pH為8.00-11.0的范圍內(nèi)較高，在10.0時(shí)達(dá)最高。
選用絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF、糜蛋白酶抑制劑TPCK通過(guò)對(duì)活性位點(diǎn)的抑制實(shí)驗(yàn)確定蛋白的特性。結(jié)果如表1，可知PMSF、TPCK能明顯的抑制NYD-Ch的活力，證實(shí)NYD-Ch具有糜蛋白酶活性。
表1 抑制劑對(duì)表達(dá)蛋白NYD-Ch和牛糜蛋白酶活力的影響

4)用氣相色譜結(jié)合質(zhì)譜分析的方法，測(cè)定NYD-Ch對(duì)溴氰菊酯的降解率在六份樣品中，分別各加入0、0.1、0.5、1、5、10mg的NYD-Ch表達(dá)蛋白和5ug的溴氰菊酯(純度＞98％，法國(guó)羅素優(yōu)克福公司產(chǎn)品)加水定容至1ml，29℃孵育24h。樣品液中加入1ml的丙酮，旋渦振蕩30s。加2ml環(huán)己烷充分混勻、提取，2,000rpm/min離心10min，吸取上層液；用環(huán)己烷重復(fù)提取2次后，合并所有上層液，在60℃水浴中用氮?dú)獯蹈扇軇?。?.2ml環(huán)己烷浸潤(rùn)、溶解殘留物，以0.6ul選樣量上色譜測(cè)定溴氰菊酯的含量，發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯的降解率與酶濃度在0.5-10mg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5及表2。GC/MS分析，表達(dá)蛋白NYD-Ch能使溴氰菊酯降解為Br2CA和3-PBA。
表2 不同劑量表達(dá)蛋白NYD-Ch對(duì)溴氰菊酯的降解率

實(shí)施例2 NYD-Ch降解溴氰菊酯后的代謝產(chǎn)物對(duì)淡色庫(kù)蚊不同品系四齡幼蟲(chóng)的毒性測(cè)定實(shí)驗(yàn)分敏感和抗性組，終體積為300ml。
敏感組測(cè)定A組溴氰菊酯對(duì)敏感品系淡色庫(kù)蚊四齡幼蟲(chóng)的毒性測(cè)定溴氰菊酯(ppm) 0 0.0010.0050.010.05 0.1 0.5四齡幼蟲(chóng)(條) 50 50 50 50 50 5050作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)B組
NYD-Ch作用溴氰菊酯后代謝產(chǎn)物對(duì)敏感淡色庫(kù)蚊四齡幼蟲(chóng)的毒性測(cè)定溴氰菊酯(ppm)0 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5NYD-Ch(mg/ml)1 1 1 1 1 1 1在28℃，作用24小時(shí)后，加入四齡幼蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)(條) 50 50 50 50 50 5050作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)C組溴氰菊酯(ppm)0 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5滅活的NYD-Ch(mg/ml) 1 1 1 1 1 1 1在28℃，作用24小時(shí)后，加入四齡幼蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)(條) 50 50 50 50 50 5050作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)D組NYD-Ch對(duì)抗性品系淡色庫(kù)蚊四齡的毒性測(cè)定NYD-Ch(mg/ml)010 100 2505001000四齡幼蟲(chóng)(條) 50 50 50 50 50 50作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)抗性品系的測(cè)定A組溴氰菊酯對(duì)抗性品系淡色庫(kù)蚊四齡幼蟲(chóng)的毒性測(cè)定溴氰菊酯(ppm) 00.1 0.5 1.0 5.0 10.0 20.0四齡幼蟲(chóng)(條) 50 5050505050 50作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)B組NYD-Ch作用溴氰菊酯后代謝產(chǎn)物對(duì)抗性淡色庫(kù)蚊四齡幼蟲(chóng)的毒性測(cè)定溴氰菊酯(ppm) 0 0.1 0.51.05.010.020.0NYD-Ch(mg/ml) 1010 10 10 10 10 10在28℃，作用24小時(shí)后，加入四齡幼蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)(條) 505050 50 50 5050作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)C組溴氰菊酯(ppm) 0 0.1 0.51.05.010.020.0滅活的NYD-Ch(mg/ml) 101010 10 10 10 10在28℃，作用24小時(shí)后，加入四齡幼蟲(chóng)四齡幼蟲(chóng)(條) 505050 50 50 5050作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)D組NYD-Ch對(duì)抗性品系淡色庫(kù)蚊四齡幼蟲(chóng)的毒性測(cè)定NYD-Ch(mg/ml) 0 10100250500 1000四齡幼蟲(chóng)(條) 505050 50 50 50
(6)當(dāng)將絕緣子組裝到火花塞中時(shí)進(jìn)行耐電壓測(cè)試如圖1所示的火花塞通過(guò)使用各個(gè)絕緣子制備。本實(shí)施方案每個(gè)火花塞的主金屬殼體的螺釘部分的直徑設(shè)定為12mm。該火花塞與四閥發(fā)動(dòng)機(jī)(具有2000cc的排氣量)相連。當(dāng)在最高速度下放電和發(fā)動(dòng)機(jī)速度為6000r.p.m.時(shí)電壓控制在35至38kV，絕緣子尖端(位于圖1中的較低區(qū)域)的溫度設(shè)定為約700℃，并且發(fā)動(dòng)機(jī)連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。在經(jīng)過(guò)50小時(shí)后，評(píng)估絕緣子中是否有問(wèn)題。未發(fā)現(xiàn)問(wèn)題的絕緣子以環(huán)(○)標(biāo)記，而在不到50小時(shí)就發(fā)生絕緣損害(火花擊穿)的絕緣子標(biāo)記為叉(×)。
表1

A組馬拉硫磷0.07ug/mlNYD-Ch(mg/ml)0 0.05 0.10.150.2四齡幼蟲(chóng)(條) 50 5050 50 50作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)B組二嗪農(nóng)0.5ug/mlNYD-Ch(mg/ml)0 0.050.10.150.2四齡幼蟲(chóng)(條) 50 50 50 50 50作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)C組高效氯氰菊酯0.04ug/mlNYD-Ch(mg/ml)0 0.050.10.150.2四齡幼蟲(chóng)(條) 50 50 50 50 50作用24小時(shí)后，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 不同有機(jī)殺蟲(chóng)劑及其代謝產(chǎn)物對(duì)淡色庫(kù)蚊四齡幼蟲(chóng)的毒力測(cè)定

權(quán)利要求
1.糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用，其特征在于其中所說(shuō)的有機(jī)殺蟲(chóng)劑是菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑
3.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用，其特征在于其中所說(shuō)的菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑是溴氰菊酯殺蟲(chóng)劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所說(shuō)的糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用，其特征在于其中所說(shuō)的菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑是高效氯氰菊酯殺蟲(chóng)劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用，其特征在于其中所說(shuō)的有機(jī)殺蟲(chóng)劑是有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所說(shuō)的糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用，其特征在于其中所說(shuō)的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑是馬拉硫磷殺蟲(chóng)劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所說(shuō)的糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用，其特征在于其中所說(shuō)的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑是二嗪農(nóng)殺蟲(chóng)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所說(shuō)的糜蛋白酶作為殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用，其特征在于其中所說(shuō)的糜蛋白酶是淡色庫(kù)蚊糜蛋白酶或牛源性糜蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種糜蛋白酶的新用途，具體是糜蛋白酶作為有機(jī)殺蟲(chóng)劑降解劑的應(yīng)用。由于糜蛋白酶可直接降解有機(jī)殺蟲(chóng)劑，且通過(guò)基因工程可大量生產(chǎn)，這就為大規(guī)模應(yīng)用于清除農(nóng)產(chǎn)品表面的殘留殺蟲(chóng)劑、治理被殺蟲(chóng)劑污染的土壤和廢水、對(duì)殺蟲(chóng)劑中毒后人、畜的解毒提供新的途徑。
文檔編號(hào)A01N53/08GK1860871SQ20061008524
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2006年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月7日
發(fā)明者李秀蘭, 孫立新, 孫艷, 錢(qián)瑾, 孫靜, 公茂慶, 沈波, 田海生, 馬磊, 朱昌亮 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)