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用于修飾核酸的方法

文檔序號:510075閱讀:1108來源:國知局
用于修飾核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及:用于修飾樣品中所含的核酸的方法,所述方法包括在酸性多糖和/或核苷酸存在下使樣品與核酸修飾劑接觸的步驟;和用于選擇性地檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸的方法,所述方法包括下述步驟:(a)根據(jù)修飾樣品中所含的核酸的方法來修飾樣品中所含的核酸的步驟,所述方法包括在酸性多糖和/或核苷酸存在下使樣品與核酸修飾劑接觸的步驟;和(b)從步驟(a)以后的樣品選擇性地檢測未修飾的核酸的步驟。本發(fā)明另外涉及用于這些方法中的試劑盒和組合物。
【專利說明】用于修飾核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于修飾核酸的方法,所述方法可有效地減少當(dāng)進(jìn)行核酸檢測方法時(shí)由樣品中含有的核酸衍生出的信號;用于所述方法中的試劑盒;和用于它們的組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]目前,核酸檢測技術(shù)是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中的常用研究工具,且已經(jīng)被廣泛地用于定性和定量測量中。尤其是與以PCR方法為代表的核酸擴(kuò)增方法相組合的這樣的核酸檢測技術(shù),能夠檢測到非常少的細(xì)胞或微生物的存在,這通過靶向這些細(xì)胞或微生物特有的核酸來實(shí)現(xiàn)。因此,核酸檢測技術(shù)已經(jīng)被廣泛地用作高靈敏度分析方法用于基礎(chǔ)研究以及用于工業(yè)中。核酸檢測技術(shù)還被用于分銷渠道追蹤和鑒定,其中將特定序列的核酸人工地?fù)饺氩牧匣蛭锲分幸詷?biāo)記它。
[0003]另一方面,利用核酸擴(kuò)增方法的檢測方法具有干擾其它樣品的分析的問題,該問題是由在檢測工作期間核酸擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸造成。由于核酸擴(kuò)增反應(yīng)會通過對數(shù)核酸擴(kuò)增產(chǎn)生巨大數(shù)目的擴(kuò)增產(chǎn)物分子,無意中存在于其它樣品、試劑、試驗(yàn)裝置或試驗(yàn)環(huán)境中的擴(kuò)增產(chǎn)物可以作為模板被擴(kuò)增,并由此可能得到錯(cuò)誤的分析結(jié)果。
[0004]為了防止對擴(kuò)增產(chǎn)物的這種人工擴(kuò)增的目的,除了對樣品、試劑、試驗(yàn)裝置等的嚴(yán)謹(jǐn)操作和試驗(yàn)環(huán)境的清潔的一般·性注意以外,還已經(jīng)開發(fā)了用于防止擴(kuò)增核酸干擾其它試驗(yàn)的手段。例如,已知生產(chǎn)對尿嘧啶-N-糖基化酶敏感的擴(kuò)增核酸的方法,該方法包括:在含有脫氧尿嘧啶三磷酸的反應(yīng)溶液中擴(kuò)增核酸。通過在擴(kuò)增反應(yīng)之前用尿嘧啶-N-糖基化酶處理樣品或反應(yīng)溶液,可以降解從其它試驗(yàn)衍生出的擴(kuò)增核酸。另外,還報(bào)道了防止核酸在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中充當(dāng)模板的方法,該方法包括:用光活化的補(bǔ)骨脂素化合物通過共價(jià)鍵來修飾核酸(非專利文獻(xiàn)I)。
[0005]用于修飾核酸以防止它在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中充當(dāng)模板的技術(shù)還已經(jīng)用于微生物的檢測中。據(jù)稱,源自死細(xì)胞的DNA會在樣品中保留至細(xì)胞死亡后幾天至3周。當(dāng)DNA是通過平常程序從樣品中提取時(shí),它們包括源自活細(xì)胞和死細(xì)胞兩者的DNA。因而,例如,當(dāng)對樣品進(jìn)行滅菌處理時(shí),如果使用核酸作為指標(biāo),微生物檢測方法不會完全反映滅菌的結(jié)果。
[0006]作為上述問題的解決方案,已經(jīng)報(bào)道了區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的方法,所述方法包括核酸修飾劑與核酸擴(kuò)增方法的組合(非專利文獻(xiàn)2,專利文獻(xiàn)I)。該基于核酸的檢測方法是通過使用擴(kuò)增的存在或速率作為指標(biāo)來將活細(xì)胞與死細(xì)胞區(qū)分開的方法,所述方法包括:與諸如實(shí)時(shí)PCR等核酸擴(kuò)增方法聯(lián)合使用核酸修飾劑諸如單疊氮乙錠(ethidiummonoazide,EMA)或單疊氮丙淀(propidium monoazide,PMA)。例如,據(jù)報(bào)道,EMA會在可見光下活化以與核酸共價(jià)地鍵合,使得核酸擴(kuò)增反應(yīng)受到抑制。與此同時(shí),在樣品中保持處于游離狀態(tài)的未結(jié)合的EMA通過與水分子的反應(yīng)而被失活。源自活細(xì)胞(由于完整細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,EMA沒有侵入)的核酸不會經(jīng)歷EMA的作用。另一方面,源自死細(xì)胞(其已經(jīng)被EMA侵入)的核酸被EMA修飾,使得以后的核酸擴(kuò)增反應(yīng)受到抑制。因而,當(dāng)用上述核酸修飾劑處理由活細(xì)胞和死細(xì)胞的混合物組成的樣品時(shí),源自活細(xì)胞的核酸被選擇性地?cái)U(kuò)增。迄今為止,這樣的方法已經(jīng)應(yīng)用于許多微生物,以檢測與死細(xì)胞區(qū)分開的活細(xì)胞,所述微生物例如大腸桿菌(Escherichia coli) 0157、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、李斯特氏菌屬(Listeria)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)和軍團(tuán)菌屬(Legionella)。但是,已經(jīng)報(bào)道,高濃度的核酸修飾劑會造成對活細(xì)胞的損傷,盡管它會確保與源自死細(xì)胞的核酸的結(jié)合。
[0007]因而,核酸的修飾具有多種應(yīng)用。因此,需要更有效地修飾核酸的方法。
[0008]引文列表 專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn) 1: JP-B 4127847 非專利文獻(xiàn)。
[0009]非專利文獻(xiàn)1: Nucleic Acids Research,第 19 卷,第 99-107 頁,1991 非專利文獻(xiàn) 2: Appl.Environ.Microbiol.,第 73 卷,第 8028-8030 頁,2007
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0010]技術(shù)問題
本發(fā)明的一個(gè)目的是,提供有效地修飾核酸的方法,所述核酸需要防止被檢測出,從而改進(jìn)各種基于核酸的檢測技術(shù)的準(zhǔn)確度。
[0011]問題的解決方案 本發(fā)明的發(fā)明人做出了深入研究來解決上述問題。結(jié)果,他們發(fā)現(xiàn),通過使用修飾樣品中所含的核酸的方法,可以比使用常規(guī)方法時(shí)更有效地修飾核酸,所述修飾樣品中所含的核酸的方法包括下述步驟:在酸性多糖和/或核苷酸存在下,使樣品與核酸修飾劑接觸,然后完成了本發(fā)明。
[0012]也就是說,本發(fā)明一般地涉及下述的:
[I ]修飾樣品中所含的核酸的方法,所述方法包括下述步驟:在酸性多糖和/或核苷酸存在下,使樣品與核酸修飾劑接觸;
[2 ]根據(jù)[I]所述的方法,其中所述核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合
物;
[3 ]根據(jù)[2]所述的方法,其中所述核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物;
[4]根據(jù)[I]所述的方法,其中所述酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或所述核苷酸選自DNA和dNTP ;
[5 ]選擇性地檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸的方法,所述方法包括下述步驟:
(a)通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,修飾樣品中所含的核酸的步驟;和
(b)從步驟(a)以后的樣品選擇性地檢測未修飾的核酸的步驟;
[6 ]根據(jù)[5]所述的方法,其中所述核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合
物;
[7 ]根據(jù)[6]所述的方法,其中所述核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物;
[8]根據(jù)[5]所述的方法,其中所述酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或所述核苷酸選自DNA和dNTP ;[9 ]根據(jù)[5]所述的方法,其中所述步驟(b)通過核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行;
[I O ]根據(jù)[9]所述的方法,其中所述步驟(b)通過實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行;
[I I ]試劑盒,其用于通過根據(jù)[I]所述的方法修飾樣品中的核酸,所述試劑盒含有:
(a)核酸修飾劑;和
(b)酸性多糖和/或核苷酸,其將與(a)的核酸修飾劑一起使用;
[I 2 ]根據(jù)[11]所述的試劑盒,其中所述核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物;
[I 3 ]根據(jù)[12]所述的試劑盒,其中所述核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物;
[I 4]根據(jù)[11]所述的試劑盒,其中所述酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或所述核苷酸選自DNA和dNTP ;
[I 5 ]試劑盒,其用于通過根據(jù)[5]所述的方法選擇性地檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸,所述試劑盒含有:
(a)核酸修飾劑;
(b)酸性多糖和/或核苷酸,其將與(a)的核酸修飾劑一起使用;和 (C)用于核酸檢測的試劑;
[I 6 ]根據(jù)[15]所述的試劑盒,其中所`述核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物;
[I 7 ]根據(jù)[16]所述的試劑盒,其中所述核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物;
[I 8 ]根據(jù)[15]所述的試劑盒,其中所述酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或所述核苷酸選自DNA和dNTP ;
[I 9] 一種組合物,其包含:
(a)核酸修飾劑;和
(b)酸性多糖和/或核苷酸;
[2 O ]根據(jù)[19]所述的組合物,其中所述核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物;
[2 I ]根據(jù)[20]所述的組合物,其中所述核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物;和
[2 2 ]根據(jù)[19]所述的組合物,其中所述酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或所述核苷酸選自DNA和dNTP。
[0013]發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明的方法,在使樣品與核酸修飾劑接觸的處理中,可以增加核酸修飾效率,并且就增加食品衛(wèi)生檢查和臨床試驗(yàn)的準(zhǔn)確度而言,這是非常有用的。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面將詳細(xì)描述本發(fā)明。
[0015]( I )本發(fā)明的核酸修飾方法
本發(fā)明的核酸修飾方法是修飾樣品中所含的核酸的方法,所述方法包括下述步驟:在酸性多糖和/或核苷酸存在下,使樣品與核酸修飾劑接觸。
[0016]作為本發(fā)明方法的對象的樣品包括其中可存在核酸的所有樣品。其例子包括:食品、農(nóng)產(chǎn)品、海產(chǎn)品、生物組織和體液(例如,血液、尿、脊髓液和胸腔積液)、細(xì)胞培養(yǎng)液、化學(xué)產(chǎn)品(例如,藥物、農(nóng)用化學(xué)品和試劑)、工業(yè)用水、城市給水、地下水、河水、水庫水(impounded water)、雨水、排水(drainage)和土壤。具體地,所述食品包括飲料、甜點(diǎn)、乳制品、功能食品等。在本發(fā)明中,所述樣品可以是上述產(chǎn)品、生物樣品或環(huán)境樣品本身,或者可以對它進(jìn)行預(yù)處理諸如溶解、混懸、稀釋、濃縮或純化。預(yù)處理的例子包括熱處理、過濾、離心等。作為預(yù)處理,也可以對樣品進(jìn)行減少存在于樣品中的雜質(zhì)(諸如蛋白和脂肪)的處理,例如,使用蛋白水解酶和脂解酶的酶處理。
[0017]在本發(fā)明中使用的核酸修飾劑是這樣的物質(zhì):其可以通過它的作用而將核酸修飾成為不可檢測形式。也就是說,核酸修飾劑的一個(gè)例子是造成選自下述的任一種的物質(zhì):與核酸的互補(bǔ)鏈雜交的能力的變化,作為互補(bǔ)鏈復(fù)制模板的功能的變化,原始序列的變化,和核酸的片段化,或它們的復(fù)數(shù)組合。因此,如在本發(fā)明中使用的核酸修飾包括:核酸修飾劑向核酸堿基對中的嵌入,核酸修飾劑與核酸的共價(jià)鍵合,核酸的交聯(lián),核酸堿基的置換,和核酸修飾劑對核酸的切割。適合用于本發(fā)明的核酸修飾劑的例子包括=EMA (單疊氮乙錠)、PMA (單疊氮丙錠)、二疊氮乙錠(ethidium diazide)、補(bǔ)骨脂素化合物[補(bǔ)骨脂素、4 ’ -AMDMIP (4 ’ -氨基甲基-4,5 ’ - 二甲基異補(bǔ)骨脂素)、AMIP (5-氨基甲基異補(bǔ)骨脂素)、5_MIP (5-甲基異補(bǔ)骨脂素)、8_甲氧基異補(bǔ)骨脂素(8-methoxysopsorale)等]和碘化丙錠。另外,可以使用商購可得的試劑,例如,商品名SYTO Red Fluorescent、BODIPY(4,4_ 二氟-4-硼 _3a, 4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省(indacene))、Y0-PR0_1 染料、Alexa Fluor488膜聯(lián)蛋白 V、C4-B0DIPV500/510CY、和 Hoechst 33258 (都由 Molecular Probes Inc.制造)。上述核酸修飾劑可以單獨(dú)使用,或作為2種或更多種的混合物使用。此外,也可能使用在商購可得的試劑盒中含有的修飾劑,所述試劑盒例如LIVE/DEAD BacLight BacterialViability Kit、ViaGram Red + Bacterial Gram Stain 或 Viability Kit (由 MolecularProbes Inc.制造)。
[0018]可以根據(jù)樣品 來適當(dāng)?shù)剡x擇在本發(fā)明中使用的核酸修飾劑的濃度和核酸修飾劑與樣品接觸的持續(xù)時(shí)間。例如,可以如下確定所述濃度和所述持續(xù)時(shí)間:將具有不同濃度的核酸修飾劑加入樣品中,保持接觸特定的時(shí)間段,并分析反應(yīng)后核酸的修飾。在使用EMA的情況下,可以在下述條件下修飾核酸:例如,EMA終濃度為1-100 μ Μ,且接觸時(shí)間為I分鐘至48小時(shí),優(yōu)選地EMA終濃度為5-70 μ Μ,且接觸時(shí)間為3分鐘至10小時(shí),更優(yōu)選地EMA終濃度為10-50 μ Μ,且接觸時(shí)間為5分鐘至5小時(shí)。使樣品與核酸修飾劑接觸的步驟可以在適合使用所述核酸修飾劑的條件下進(jìn)行。
[0019]當(dāng)在本發(fā)明的方法中使用可光活化的核酸修飾劑(諸如EMA、PMA或補(bǔ)骨脂素化合物)時(shí),在使核酸修飾劑與樣品接觸后進(jìn)行光輻照處理。在使用可光活化的核酸修飾劑的情況下,通常將核酸修飾劑加入樣品中,以使核酸修飾劑與核酸在蔽光條件下在低溫(例如,室溫至o°c)接觸,然后進(jìn)行光輻照,但是本發(fā)明不限于該情況。用于光輻照處理的光的波長沒有特別限制,只要它適合用于活化核酸修飾劑即可。例如,可以使用在350-700 nm波長的單波長光或包括350-700 nm波長的多波長光。根據(jù)要使用的核酸修飾劑、光源和樣品,可以適當(dāng)?shù)剡x擇光輻照處理的光強(qiáng)度和輻照時(shí)間。例如,可以如下確定光強(qiáng)度和輻照時(shí)間:使用不同的光強(qiáng)度和樣品與光源之間的距離處理以后,分析核酸的修飾。在使用EMA的情況下,在下述條件下進(jìn)行光輻照處理是可能的:例如,使用1-1000W的燈,1-50 cm的燈和樣品之間的距離,和1-20分鐘的輻照時(shí)間。此外,已經(jīng)開發(fā)了具有低電力消耗和強(qiáng)光強(qiáng)度的LED (發(fā)光二極管)燈,并且可以用于本發(fā)明中。另外,所述光輻照處理優(yōu)選地在低溫(例如,在冰上)進(jìn)行。
[0020]要在本發(fā)明的方法中使用的酸性多糖包括含有硫酸酯基團(tuán)的硫酸化多糖,其代表為:含有硫酸巖藻糖的多糖、硫酸葡聚糖、角叉菜膠、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素B (硫酸皮膚素)等;多糖醛酸諸如透明質(zhì)酸、海藻酸和果膠;和它們的鹽。上述酸性多糖的鹽的例子包括堿金屬鹽,諸如硫酸葡聚糖鈉、海藻酸鈉、肝素鈉、硫酸葡聚糖鉀和肝素鋰。上述酸性多糖可以是天然存在的物質(zhì)或化學(xué)地或酶促地合成的產(chǎn)物。另外,上述酸性多糖可以是未純化的或部分純化的或純化的含有酸性多糖的產(chǎn)物。上述酸性多糖可以單獨(dú)使用,或作為2種或更多種的混合物使用。
[0021]根據(jù)要使用的酸性多糖和樣品,可以適當(dāng)?shù)剡x擇和加入要在本發(fā)明的方法中使用的酸性多糖的濃度。例如,可以如下確定酸性多糖的濃度:在使用不同濃度的酸性多糖處理以后,分析核酸的修飾。例如,如果使用海藻酸鈉,那么它的濃度是I yg/mL至IOOmg/mL,優(yōu)選10 yg/mL至10 mg/mL,更優(yōu)選100 yg/mL至5 mg/mL。例如,如果使用硫酸軟骨素B,那么它的濃度是10 yg/mL至1000 mg/mL,優(yōu)選100 yg/mL至500 mg/mL,更優(yōu)選Img/mL 至 100 mg/mL。
[0022]如果在上述酸性多糖存在下使樣品遭受核酸修飾劑的作用,那么樣品中的游離核酸的修飾的比例增加,且與此同時(shí),在允許接觸核酸修飾劑的環(huán)境中的非游離核酸(尤其是DNA)(例如,與生物分子結(jié)合的核酸,和在具有增強(qiáng)的細(xì)胞膜滲透性的死細(xì)胞中含有的核酸)的修飾的比例也增加。因此,在核酸檢測方法中減少衍生自這些核酸或DNA的干擾成為可能。本文中使用的短語“在酸性多糖存在下使樣品遭受核酸修飾劑的作用”是指,“將酸性多糖人工地加入樣品中,然后.用核酸修飾劑處理所述樣品”。
[0023]用于本發(fā)明的方法中的核苷酸或用于本發(fā)明中的核苷酸是指,構(gòu)成核酸的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸,或包含它的類似物作為組分的物質(zhì)??梢杂糜诒景l(fā)明中的核苷酸的例子包括、但不限于,DNA、RNA、寡核糖核苷酸、寡脫氧核糖核苷酸、單核糖核苷酸(例如,單核糖核苷三磷酸:NTP)和單脫氧核糖核苷酸(例如,單脫氧核糖核苷三磷酸:dNTP)。在本發(fā)明中還可以使用肌苷核苷酸、脫氧肌苷核苷酸、脫氧尿苷核苷酸和它們的三磷酸酯,它們是天然的核糖核苷酸類似物,和含有上述類似物的DNA、RNA、寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸。NTP包括單腺苷三磷酸(ATP)、單胸苷三磷酸(TTP)、單胞苷三磷酸(CTP)、單鳥苷三磷酸(GTP)和單尿苷三磷酸(UTP)。此外,dNTP包括單脫氧腺苷三磷酸(dATP)、單脫氧胸苷三磷酸(dTTP)、單脫氧胞苷三磷酸(dCTP)和單脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)。本文中使用的核苷酸包括上述物質(zhì)的鹽(例如,堿金屬鹽)。上述核苷酸可以是天然產(chǎn)物或化學(xué)地或酶促地合成的產(chǎn)物。此外,上述核苷酸可以是未純化的或部分純化的或純化的含有核苷酸的產(chǎn)物。上述核苷酸可以單獨(dú)使用,或作為2種或更多種的混合物使用。作為本發(fā)明的一個(gè)方面,可以使用選自DNA和dNTP的核苷酸。在本發(fā)明中使用的DNA的例子包括、但不限于,源自可容易得到的動(dòng)物的DNA (小牛胸腺DNA、鮭魚精DNA等)和源自微生物的DNA (細(xì)菌基因組DNA、噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA等)。小牛胸腺DNA、λ噬菌體DNA ( λ DNA)和dNTP可作為試劑商購得到,并且它們適合用于本發(fā)明。
[0024]根據(jù)要使用的核苷酸和樣品,可以適當(dāng)?shù)剡x擇和使用要在本發(fā)明的方法中使用的核苷酸的濃度。例如,可以如下確定核苷酸的濃度:使用不同濃度的核苷酸處理以后,分析核酸的修飾。例如,如果使用λ DNA,那么它的濃度是10 ng/mL至10 mg/mL,優(yōu)選100 ng/mL至I mg/mL,更優(yōu)選I yg/mL至100 μ g/mL。例如,如果使用脫氧NTP,那么它的濃度是10 μ M 至 500 mM,優(yōu)選 100 μ M 至 100 mM,更優(yōu)選 I mM 至 50 mM。
[0025]如果在上述核苷酸存在下使樣品遭受核酸修飾劑的作用,那么樣品中的游離核酸的修飾的比例增加,且與此同時(shí),在允許接觸核酸修飾劑的環(huán)境中的非游離核酸(尤其是DNA)(例如,與生物分子結(jié)合的核酸,和在具有增強(qiáng)的細(xì)胞膜滲透性的死細(xì)胞中含有的核酸)的修飾的比例也增加。因此,在核酸檢測方法中減少衍生自這些核酸或DNA的干擾成為可能。本文中使用的短語“在核苷酸存在下使樣品遭受核酸修飾劑的作用”是指,“將核苷酸人工地加入樣品中,然后用核酸修飾劑處理所述樣品”。
[0026]在本發(fā)明的方法、試劑盒和組合物中,可以聯(lián)合使用一種或多種上述酸性多糖和一種或多種上述核苷酸。
[0027]( 2 )根據(jù)本發(fā)明的源自活細(xì)胞的核酸的選擇性檢測方法
在能夠存活和生長的活細(xì)胞與不可逆損傷的死細(xì)胞的區(qū)分中,細(xì)胞膜完整性是重要的。根據(jù)本發(fā)明的核酸修飾方法,使用具有對細(xì)胞膜的選擇性的核酸修飾劑,甚至可以修飾在細(xì)胞內(nèi)的核酸,所述細(xì)胞具有增強(qiáng)的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的滲透性(所述核酸修飾劑可以侵入它)。另一方面,不會修飾在核酸修飾劑不可侵入的活細(xì)胞內(nèi)的核酸。因而,根據(jù)本發(fā)明,提供了選擇性地檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸的方法。
·[0028]本文中使用的術(shù)語“活細(xì)胞”表示維持生命活動(dòng)的細(xì)胞,S卩,維持代謝能力和增殖能力的細(xì)胞。此外,所述活細(xì)胞在結(jié)構(gòu)或形式方面沒有實(shí)質(zhì)性損傷。另一方面,死細(xì)胞具有細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜損傷,且具有減少的維持生命活動(dòng)的能力。即使在適合細(xì)胞生長的條件下,死細(xì)胞通常不會生長。這樣的死細(xì)胞處于細(xì)胞外物質(zhì)可以侵入所述死細(xì)胞中的狀態(tài)。
[0029]當(dāng)將本發(fā)明的核酸修飾方法應(yīng)用于其中可能存在細(xì)胞的樣品時(shí),僅活細(xì)胞中的核酸不受核酸修飾劑的作用的影響,并且它們保持能夠通過核酸檢測方法(例如,核酸擴(kuò)增方法)檢測出的狀態(tài)。因此,本發(fā)明的方法的應(yīng)用,使得特異性地檢測活細(xì)胞(例如,微生物活細(xì)胞)的存在成為可能,而不論死細(xì)胞是否存在。
[0030]作為本發(fā)明方法的對象的細(xì)胞可以是真核細(xì)胞或原核細(xì)胞,且其例子包括:微生物諸如酵母、真菌和細(xì)菌、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。所述細(xì)菌包括革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。所述革蘭氏陽性細(xì)菌的例子包括芽孢桿菌屬細(xì)菌(蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)等)、葡萄球菌屬細(xì)菌(金黃色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.6口丨(161'111丨(1丨8)等)、李斯特氏菌屬細(xì)菌(單核增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)等)、梭菌屬細(xì)菌(肉毒梭菌(C.botulinum)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringens)等)、鏈球菌屬細(xì)菌(肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)等)、分枝桿菌屬細(xì)菌等。所述革蘭氏陰性細(xì)菌的例子包括埃希氏菌屬細(xì)菌(大腸桿菌(E.Co I i )等)、沙門氏菌屬細(xì)菌(腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)等)、弧菌屬細(xì)菌(副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等)、年輕泰坦桿菌屬細(xì)菌(以前的阪崎氏腸桿菌(E.sakazaki )等)、軍團(tuán)菌屬細(xì)菌(嗜肺軍團(tuán)菌(L.pneumophila)等)、假單胞菌屬細(xì)菌等。[0031]如上所述,本發(fā)明的方法可以使用不同的樣品作為對象進(jìn)行。但是,從維持選擇性的觀點(diǎn)看,必須避免導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷的樣品處理。
[0032]本發(fā)明的檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸的方法通過下述(a)和(b)步驟進(jìn)行:
(a)通過本發(fā)明的核酸修飾方法來修飾樣品中所含的核酸的步驟;和
(b)從步驟(a)以后的樣品選擇性地檢測未修飾的核酸的步驟。
[0033]本發(fā)明的方法中的步驟(a)是這樣的步驟:如上面(I)中所述,在酸性多糖和/或核苷酸存在下,使樣品與核酸修飾劑接觸,從而修飾樣品中的核酸。例如,可以如下修飾核酸:將核酸修飾劑和酸性多糖和/或核苷酸加入樣品中,并將所述樣品置于適當(dāng)?shù)臈l件下。在本發(fā)明的方法中,當(dāng)使用如上面(I)中所述的可光活化的核酸修飾劑時(shí),可以與步驟(a)同時(shí)地或在步驟(a)以后進(jìn)行光輻照處理。另外,所述步驟(a)和所述光輻照處理可以重復(fù)幾次,例如,2-5次。也就是說,可能重復(fù)地執(zhí)行核酸修飾劑的添加和光輻照處理。在重復(fù)所述步驟(a)和所述光輻照處理的情況下,可以在光輻照處理以后向樣品中加入適合樣品中所含的活細(xì)胞的生長的培養(yǎng)基,如在WO 2009/022558中所述,并由此可以組合培養(yǎng)活細(xì)胞的步驟。
[0034]此外,在步驟(a)以后,可以進(jìn)行除去核酸修飾劑的步驟。作為除去核酸修飾劑的方法,可以使用本領(lǐng)域已知的固液分離方法。這樣的方法的例子包括:將樣品離心以分離含有細(xì)胞的沉淀物和含有核酸修飾劑的上清液,然后除去上清液。在該情況下,在除去核酸修飾劑以后,也可以添加洗滌細(xì)胞的步驟。
[0035]另外,在步驟(a)以后,可以進(jìn)行裂解活細(xì)胞的步驟和/或提取核酸的步驟。細(xì)胞裂解方法和核酸提取方法的例子包括多種方法,諸如蛋白水解酶K/苯酚提取方法、蛋白水解酶K/苯酚/氯仿提取方法、堿性裂`解方法、堿-SDS方法和裂解酶方法,以及通過熱處理實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞破壞(熱提取)。在這些方法中,根據(jù)在下面提及的、在步驟(b)中進(jìn)行的核酸檢測方法,可以選擇合適的細(xì)胞`裂解方法和/或合適的核酸提取方法。
[0036]在本發(fā)明的方法的步驟(b)中,通過從步驟(a)以后的樣品選擇性地檢測未修飾的核酸,可以特異性地檢測活細(xì)胞的核酸。也就是說,在基于核酸的活細(xì)胞檢測中減少由死細(xì)胞的核酸造成的噪聲成為可能,這使得以高靈敏度準(zhǔn)確地檢測活細(xì)胞在樣品中的存在成為可能。
[0037]在步驟(b)中,根據(jù)步驟(a)的核酸修飾方法,可以適當(dāng)?shù)剡x擇選擇性地檢測未修飾的核酸的方法。例如,如果作為死細(xì)胞DNA (以及游離DNA)的選擇性修飾的結(jié)果,使用DNA作為模板的核酸擴(kuò)增反應(yīng)受到抑制,那么可以選擇核酸擴(kuò)增方法(DNA擴(kuò)增方法)作為檢測核酸的方法。所述DNA擴(kuò)增方法包括PCR方法、ICAN方法、LAMP方法、SDA方法、LCR方法、RCA方法和SMAP方法??梢匀缦逻x擇性地檢測未修飾的核酸:對核酸擴(kuò)增反應(yīng)以后的反應(yīng)溶液實(shí)施常規(guī)分析方法諸如凝膠電泳,從而分析擴(kuò)增的核酸的量和堿基長度。此外,也可以使用實(shí)時(shí)檢測和定量核酸的方法,且其例子包括嵌入劑方法、TaqMan方法、Scorpion方法、循環(huán)探針方法和雜交探針方法。在許多綜述中描述了這些核酸擴(kuò)增方法和實(shí)時(shí)檢測方法,并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠從許多商購可得的試劑盒中做出選擇。
[0038]在核酸擴(kuò)增方法中或在實(shí)時(shí)檢測方法中,可以根據(jù)要檢測的細(xì)胞適當(dāng)?shù)剡x擇要檢測的核酸的靶區(qū)域。所述靶區(qū)域可以選自:細(xì)胞染色體的基因組序列,或附加體(諸如線粒體基因組、葉綠體基因組或質(zhì)粒)的序列。此外,當(dāng)在樣品中含有與要檢測的細(xì)胞不同類型的細(xì)胞時(shí),優(yōu)選的是,選擇要檢測的細(xì)胞特有的序列作為靶區(qū)域。也可以選擇2種或更多種細(xì)胞共有的序列作為靶區(qū)域。另外,所述靶區(qū)域可以是一個(gè)區(qū)域,或可以是多個(gè)區(qū)域。也可能設(shè)定要檢測的細(xì)胞特有的靶區(qū)域和廣泛范圍的細(xì)胞具有的靶區(qū)域。靶區(qū)域的長度是40-5000個(gè)堿基的長度,優(yōu)選60-1000個(gè)堿基的長度,特別優(yōu)選70-200個(gè)堿基的長度。
[0039]根據(jù)核酸擴(kuò)增方法或?qū)崟r(shí)檢測方法,可以基于如上所述的靶區(qū)域來設(shè)計(jì)要在核酸擴(kuò)增方法中或在實(shí)時(shí)檢測方法中使用的引物或探針。
[0040]通過在靶向微生物的同時(shí)執(zhí)行本發(fā)明的方法,檢測在樣品中存活的微生物是可能的。在核酸擴(kuò)增方法中,靶基因/核酸區(qū)域沒有特別限制,且可以考慮特異性和檢測靈敏度來適當(dāng)?shù)剡x擇。如果要檢測的微生物是致病性細(xì)菌,可能選擇來自致病性基因的靶區(qū)域,從而將屬于相同種或?qū)俚闹虏⌒约?xì)菌與非致病性微生物區(qū)分開。致病性基因的例子包括:源自大腸桿菌0-157的veiO細(xì)胞毒素I型或2型基因,源自產(chǎn)毒的大腸桿菌的耐熱腸毒素基因(STh)或不耐熱腸毒素基因(STp),源自沙門氏菌屬細(xì)菌的侵入因子(invasive factor)相關(guān)的基因(invA),源自副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐熱溶血素基因(tdh),源自臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)的嘔吐毒素(cereulide)基因(CRS),源自李斯特氏菌屬細(xì)菌的內(nèi)化蛋白A基因(intA),源自阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)的外膜蛋白A基因(ompA),源自彎曲桿菌屬的細(xì)胞致死腫脹毒素(cdt)基因等。另外,編碼被廣泛用于微生物檢測的核糖體RNA (16SrRNA, 23SrRNA)或它的間隔區(qū)的基因可以用作靶標(biāo)。
[0041]進(jìn)一步,下面舉例說明了分析方法,其中采用實(shí)時(shí)PCR方法作為步驟(b)中的檢測方法。在所述實(shí)時(shí)PCR方法中,監(jiān)測熒光信號的變化。當(dāng)提供PCR擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí),熒光信號強(qiáng)度增加,并且繪制擴(kuò)增曲線。一般而言,至多約1-10個(gè)PCR擴(kuò)增循環(huán)的熒光強(qiáng)度的變化是等于O的噪聲水平,且被視作樣品空白(基線)。當(dāng)與樣品空白對比時(shí),將其中觀察到熒光信號的顯著差異的熒光信號強(qiáng)度設(shè)定為閾值。將循環(huán)閾值(Ct值)定義為超過擴(kuò)增曲線的閾值的PCR循環(huán)的數(shù)目。因而,當(dāng)PCR反應(yīng)溶液中的DNA模板的初始量越大時(shí),Ct值越小,且當(dāng)模板DNA的初始量越小時(shí),Ct值越大。此外,隨著靶區(qū)域中的核酸修飾的發(fā)生比例增力口,Ct值是更大的值 ,即使核酸的總量是相同的。另外,可能通過解鏈曲線分析(Tm分析)來分析擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度,以證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物是否源自靶區(qū)域。
[0042]( 3 )本發(fā)明的試劑盒和組合物
本發(fā)明的試劑盒是用于通過如上面(I)中所述的本發(fā)明的方法修飾樣品中的核酸的試劑盒,所述試劑盒含有:
(a)核酸修飾劑;和
(b)酸性多糖和/或核苷酸,其將與(a)的核酸修飾劑一起使用。
另外,本發(fā)明的另一種試劑盒包括用于通過如上面(2)中所述的本發(fā)明的方法選擇性地檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸的試劑盒,所述試劑盒含有:
(a)核酸修飾劑;
(b)酸性多糖和/或核苷酸,其將與(a)的核酸修飾劑一起使用;和 (C)用于核酸檢測的試劑。
在本發(fā)明的試劑盒中含有的核酸修飾劑、酸性多糖和核苷酸如上面(I)中所述。在本發(fā)明的試劑盒中含有的用于核酸檢測的試劑是如上面(2)中所述的核酸檢測方法中使用的試劑。例如,當(dāng)采用PCR方法作為核酸檢測方法時(shí),所述用于核酸檢測的試劑包括反應(yīng)緩沖液、用于擴(kuò)增靶區(qū)域的引物對、DNA聚合酶、核苷、鎂鹽等。此外,取決于核酸檢測方法,所述用于核酸檢測的試劑包括檢測反應(yīng)所需的嵌入劑染料[SYBR (注冊商標(biāo))Green I等]、檢測探針和酶(例如,RNA酶H等)。
[0043]本發(fā)明的試劑盒可以另外含有:用于稀釋樣品或核酸修飾劑的試劑、核酸修飾反應(yīng)的緩沖液、描述本發(fā)明的方法的說明書、用于從樣品中除去和清潔污染物的試劑、陽性對照、陰性對照,等。
[0044]本發(fā)明的組合物被用于如上面(I)中所述的本發(fā)明的核酸修飾方法中或如上面
(2)中所述的本發(fā)明的選擇性地檢測源自活細(xì)胞的核酸的方法中,且含有(a)核酸修飾劑和(b)酸性多糖和/或核苷酸。在本發(fā)明的組合物中含有的核酸修飾劑、酸性多糖和核苷酸如上面(I)中所述。
[0045]如上面詳細(xì)解釋的,本發(fā)明提供了通過包含酸性多糖和/或核苷酸作為活性成分的增強(qiáng)劑來增強(qiáng)核酸修飾劑的作用的方法,以及提供了核酸修飾劑的增強(qiáng)劑,所述增強(qiáng)劑包含酸性多糖和/或核苷酸作為活性成分。所述方法和所述增強(qiáng)劑可用于修飾樣品中的目標(biāo)核酸,且可以應(yīng)用于不同的工業(yè)領(lǐng)域中。
實(shí)施例
[0046]然后,將通過實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明,但是本發(fā)明無意限于下述實(shí)施例。
[0047]實(shí)施例1 酸性多糖的作用 使用已經(jīng)向其中添加了酸性多糖(海藻酸鈉或硫酸軟骨素B)的大腸桿菌基因組DNA樣品,進(jìn)行EMA處理I次,并通過實(shí)時(shí)PCR方法對比LacZ基因作為靶區(qū)域時(shí)的檢測靈敏度。
[0048](I)樣品的制備
在TE緩沖液[10 mM Tris-HCl (pH 8.0)/0.1 mM EDTA]中將從大腸桿菌K-12制備的基因組DNA調(diào)節(jié)至I X IO8個(gè)拷貝/30 μ L,得到樣本溶液。另外,向所述樣本溶液中加入100 μ g 或 10 μ g 海藻酸鈉(海藻酸鈉 80-120 cp,由 Wako Pure Chemical Industries制造,目錄號:194-13321,在下文中也被稱作“AlgNa”)或480 μ g硫酸軟骨素B (硫酸皮膚素,由Sigma制造,目錄號:C3788)作為酸性多糖。制備其中沒有添加酸性多糖的樣本溶液作為對照。然后,用無菌水將所有樣本溶液調(diào)節(jié)至50 UL0在本文中,拷貝數(shù)表示從核酸重量計(jì)算出的拷貝數(shù)。
[0049]( 2 ) EMA 處理
將EMA(單疊氮溴化乙錠,由Sigma-Aldrich Corporation制造:目錄號:E2028)在DMSO中完全溶解至5 mM,并在_20°C保存。當(dāng)使用時(shí),將該EMA溶液融化,并用無菌水稀釋至300 μ Mo將EMA水溶液(各5 μ L)加入各50 μ L的基因組DNA的樣本溶液中。將所述樣本溶液在蔽光條件下在4°C靜置15分鐘。然后,將每個(gè)樣本溶液放在冰上,并用放在離樣本溶液 20 cm距離處的 500 W 照相照明燈(PRS 500 W: 100 V, 500 W,由 Iwasaki ElectricC0., Ltd.制造)輻照5分鐘(從加入EMA溶液至光輻照的過程有時(shí)被稱作“EMA處理”)。
[0050]此外,制備如在(I)中所述制備的樣本溶液,但是不進(jìn)行EMA處理。用無菌水將經(jīng)過EMA處理的樣本溶液和未經(jīng)過EMA處理的樣本溶液稀釋至100 μ L。[0051]( 3 )靶向LacZ基因區(qū)域的PCR (擴(kuò)增鏈長度:70 bp)
制備具有下述組成的PCR反應(yīng)溶液(總體積20 μ L)。
?SYBR Premix Ex Taq (由 Takara Bio Inc.制造,目錄號:RR041A): 10 μ L
?4 pmol/ μ L, LazZ-F DNA (序列 ID NO I):1 μ L
?4 pmol/ μ L, LacZ-R DNA (序列 ID NO 2):1 μ L
?無菌水:7 μ L
*模板DNA (稀釋的樣本溶液):I UL0
[0052]將在實(shí)施例1-(2)中制備的每個(gè)樣本溶液(I UL)用作模板DNA。換而言之,20μ L反應(yīng)溶液含有IO6個(gè)大腸桿菌基因組拷貝作為模板DNA。作為對照,制備了包含I μ L滅菌水(替代稀釋的樣本溶液)的反應(yīng)溶液。為了擴(kuò)增靶區(qū)域的LacZ基因,在下述條件下對反應(yīng)溶液進(jìn)行PCR:在95°C保持30秒,然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的反應(yīng),其中每個(gè)循環(huán)由在95°C保持5秒和在60°C保持30秒組成。在所述反應(yīng)中,使用實(shí)時(shí)PCR儀器Thermal Cycler DiceReal Time System (由 Takara Bio Inc.制造,型號:TP800)或Thermal Cycler Dice RealTime System II (由Takara Bio Inc.制造,型號:TP900),并且測量超過PCR擴(kuò)增曲線上的閾值的循環(huán)的數(shù)目(在下文中被稱作“Ct值”)。另外,在PCR以后,在使溫度從60°C升高至95°C的條件下,進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈曲線分析(Tm分析)。
[0053]( 4 )試驗(yàn)結(jié)果
通過實(shí)施例1-⑶中的PCR得到的Ct值和Tm分析值顯示在表I中。
[0054][表I]
【權(quán)利要求】
1.一種修飾樣品中所含的核酸的方法,該方法包括下述步驟:在酸性多糖和/或核苷酸存在下,使該樣品與核酸修飾劑接觸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其中該核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠(ethidiummonoazide)和單疊氮丙淀(propidium monoazide)的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或該核苷酸選自DNA和dNTP。
5.一種選擇性地檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸的方法,該方法包括下述步驟: (a)通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,修飾該樣品中所含的核酸的步驟;和 (b)從步 驟(a)以后的樣品選擇性地檢測未修飾的核酸的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其中該核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其中該核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其中該酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或該核苷酸選自DNA和dNTP。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其中該步驟(b)通過核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中該步驟(b)通過實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行。
11.一種試劑盒,其用于通過根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法來修飾樣品中的核酸,該試劑盒含有: (a)核酸修飾劑;和 (b)酸性多糖和/或核苷酸,其將與(a)的核酸修飾劑一起使用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒,其中該核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒,其中該核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒,其中該酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或該核苷酸選自DNA和dNTP。
15.一種試劑盒,其用于通過根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法來選擇性地檢測源自樣品中所含的活細(xì)胞的核酸,該試劑盒含有: (a)核酸修飾劑; (b)酸性多糖和/或核苷酸,其將與(a)的核酸修飾劑一起使用;和 (C)用于核酸檢測的試劑。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒,其中該核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒,其中該核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒,其中該酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或該核苷酸選自DNA和dNTP。
19.一種組合物,其包含: (a)核酸修飾劑;和 (b)酸性多糖和/或核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物,其中該核酸修飾劑是能夠通過光活化而修飾核酸的化合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物,其中該核酸修飾劑是選自單疊氮乙錠和單疊氮丙錠的化合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物,其中該酸性多糖選自海藻酸鈉和硫酸軟骨素B,或該核苷酸選自DNA 和dNTP。
【文檔編號】C12N15/09GK103443294SQ201280014786
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年1月24日
【發(fā)明者】山本純子, 久?;葑? 上森隆司, 向井博之, 淺田起代藏 申請人:寶生物工程株式會社
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