逆向β氧化途徑的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及使用已賦予形成逆向β氧化途徑的新用途的基因進(jìn)行工程化以產(chǎn)生各種化學(xué)品的重組微生物。一般而言，通過(guò)修飾所需許多循環(huán)的各種調(diào)節(jié)點(diǎn)逆向表達(dá)和驅(qū)動(dòng)β氧化循環(huán)，然后通過(guò)終止酶的作用來(lái)將CoA硫酯中間體轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】逆向β氧化途徑
[0001]在先相關(guān)申請(qǐng)
[0002]本申請(qǐng)要求2011年2月7日提交的61/440，192的優(yōu)先權(quán)，其通過(guò)引用方式全部并入本文中。
[0003]聯(lián)邦政府贊助研究聲明
[0004]本發(fā)明是在國(guó)家科學(xué)基金會(huì)(National Science Foundation)授予的CBET-1134541和CBET-1067565的政府贊助下進(jìn)行。政府對(duì)本發(fā)明具有某些權(quán)力。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及使用已賦予形成逆向β氧化途徑的新用途的基因進(jìn)行工程化以產(chǎn)生醇類(lèi)、羧酸類(lèi)、烷烴類(lèi)或烯烴類(lèi)的重組微生物。
[0006]一般而言，逆向驅(qū)動(dòng)所需許多循環(huán)的β氧化循環(huán)，然后通過(guò)不同類(lèi)型的終止酶的作用能夠?qū)oA硫酯中間體轉(zhuǎn)化成有用產(chǎn)物:i)硫酯酶、或?；?CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或磷酸轉(zhuǎn)酰基酶和羧酸酯激酶(其形成羧酸類(lèi))或者ii)形成醇的輔酶-A硫酯還原酶(其制備醇類(lèi))或者iii)形成醛的CoA硫酯還原酶和醇脫氫酶(其一起形成醇類(lèi))或者iv)形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶(其一起形成烷烴類(lèi)或端烯烴類(lèi))或者V)形成鏈烯烴的酶(例如OleA、OleB、OleC、OleD,其一起形成內(nèi)烯烴類(lèi)或端烯烴類(lèi)或三烯類(lèi)或者烯醇類(lèi))。
[0007]羧酸類(lèi)包括不同鏈長(zhǎng)的單羧酸類(lèi)、β -酮酸類(lèi)、β -羥基酸類(lèi)和反式- Λ2-脂肪酸。醇類(lèi)包括不同鏈長(zhǎng)的正醇類(lèi)、β -酮醇類(lèi)、1，3- 二醇類(lèi)和反式-Λ2-醇類(lèi)。烷烴類(lèi)包括不同鏈長(zhǎng)的脂肪族烷烴類(lèi)。脂肪族烯烴類(lèi)(也稱(chēng)為鏈烯烴類(lèi))包括端鏈烯烴類(lèi)、內(nèi)鏈烯烴類(lèi)、三烯類(lèi)和烯醇類(lèi)。
【背景技術(shù)】
[0008]近年來(lái)，對(duì)諸如乙醇的可再 生燃料的生物制備進(jìn)行了許多嘗試。然而，乙醇并不是理想的燃料，有許多問(wèn)題，例如高吸濕性、高蒸汽壓和低能量密度。這些質(zhì)量問(wèn)題使得乙醇不能與液體運(yùn)輸燃料的儲(chǔ)存、分配和使用中所使用的現(xiàn)有設(shè)施相容。
[0009]較長(zhǎng)鏈(C ^ 4)醇類(lèi)(例如正丁醇)、脂肪酸甲酯(FAME)和烴類(lèi)(烷烴類(lèi)和烯烴類(lèi))提供較乙醇多種優(yōu)勢(shì)，包括吸濕性降低、揮發(fā)性降低和更高的能量密度。這些質(zhì)量?jī)?yōu)勢(shì)使得正丁醇和其它高級(jí)醇類(lèi)與目前儲(chǔ)存、分配和使用的基礎(chǔ)設(shè)施更加相容。
[0010]上述長(zhǎng)鏈染料和化學(xué)品由短鏈代謝中間體通過(guò)需要延長(zhǎng)碳鏈的途徑來(lái)生成。然而，迄今為止生物上的成就并不令人滿(mǎn)意，特別是引入非天然基因來(lái)驅(qū)動(dòng)較長(zhǎng)鏈分子的合成。
[0011]因此，本領(lǐng)域需要更好的制備較長(zhǎng)鏈(C34)燃料(例如醇類(lèi)、脂肪酸甲酯、FAME和烴類(lèi))的生物方法，它比目前可獲得的方法更加有效和實(shí)惠。理想的方法也可生產(chǎn)能夠用作其它工業(yè)的原料的化學(xué)品，例如羧酸類(lèi)和醇類(lèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0012]我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)出以產(chǎn)生諸如醇類(lèi)、羧酸類(lèi)、烷烴類(lèi)和烯烴類(lèi)的化學(xué)品的工程化微生物的替代途徑，其將β -氧化循環(huán)的功能性逆轉(zhuǎn)用作合成具有各種鏈長(zhǎng)度和官能度的醇類(lèi)和羧酸類(lèi)的代謝平臺(tái)(圖1Α)。
[0013]該途徑使用輔酶-A(CoA)硫酯中間體操作以及直接使用?；溠娱L(zhǎng)的乙酰基-CoA (而不是首先需要對(duì)丙二?；?CoA進(jìn)行ATP-依賴(lài)性激活)，其特征在于能夠在最大碳和能量效率下合成產(chǎn)物。在大腸桿菌中工程化β_氧化循環(huán)的逆轉(zhuǎn)以及聯(lián)合內(nèi)源性脫氫酶和硫酯酶使用以合成正醇類(lèi)、脂肪酸和3-羥基-、3-酮基-和反式-Λ 2-羧酸類(lèi)。
[0014]通過(guò)在比之前所報(bào)道的更高效率下產(chǎn)生更長(zhǎng)鏈的直鏈正醇類(lèi)(C ^ 4)和細(xì)胞外長(zhǎng)鏈脂肪酸(OlO)來(lái)證實(shí)工程化途徑的更優(yōu)的性質(zhì)。β-氧化、醛/醇脫氫酶、硫酯酶、脫羧酶的普遍存在的性質(zhì)具有使這些產(chǎn)物能夠在其它工業(yè)有機(jī)體中有效合成的潛能，例如釀酒酵母、運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌、枯草桿菌等。
[0015]盡管本文中我們已經(jīng)例證正丁醇、4-C3-羥基_、3-酮基-和反式-Λ 2-羧酸類(lèi)、較長(zhǎng)鏈(CM)正醇類(lèi)和長(zhǎng)鏈(OlO)脂肪酸，我們也已經(jīng)證實(shí)通過(guò)明智使用起始材料和酶，取決于在工程化微生物中表達(dá)何種終止酶，我們也能夠制備其它羧酸類(lèi)、醇類(lèi)、烷烴類(lèi)和烯烴類(lèi)。
[0016]我們已經(jīng)工程化在大腸桿菌中制備正丁醇的氧化循環(huán)的一次逆轉(zhuǎn)，據(jù)認(rèn)為在沒(méi)有外源性基因下該生物體不能夠制備該醇。該途徑，本文稱(chēng)為“內(nèi)源性”或“天然”基因途徑，并不是基于來(lái)自天然生成正丁醇的生物體的轉(zhuǎn)移途徑，而是通過(guò)途徑操作賦予天然基因和蛋白產(chǎn)生丁醇的新用途。
[0017]通常，驅(qū)動(dòng)逆轉(zhuǎn)的β_氧化循環(huán)的包括以下三步驟:1)在缺乏它的天然誘導(dǎo)底物(即缺乏脂肪酸)和存在非脂肪酸碳源(例如存在葡萄糖)下功能性表達(dá)β氧化循環(huán)；2)在逆向/生物合成方向(如與它的天然分解`代謝/降解方向相反)中驅(qū)動(dòng)β氧化循環(huán)；以及3)表達(dá)在β氧化循環(huán)中用作合適中間體的終止酶以制備所需產(chǎn)物。
[0018]更詳細(xì)而言，重組工程化為:
[0019]I)在缺乏天然誘導(dǎo)底物(即缺乏脂肪酸)和存在非脂肪酸碳源(例如存在葡萄糖)下表達(dá)氧化循環(huán):為了表達(dá)氧化循環(huán)，首先i)突變fadR和atoC(c)使能夠在缺乏脂肪酸下表達(dá)編碼β氧化酶的基因；ii)arcA敲除(AarcA)使能夠在厭氧/微好氧條件下表達(dá)編碼β氧化循環(huán)酶/蛋白的基因(在制備燃料和化學(xué)品中使用微好氧/厭氧條件，但導(dǎo)致通過(guò)ArcA表達(dá)β氧化基因);以及iii)使用cAMP-依賴(lài)性突變體(crp*)來(lái)替代天然環(huán)狀A(yù)MP受體蛋白(crp)在存在抑制降解產(chǎn)物的碳源，例如葡萄糖下使能夠表達(dá)編碼β氧化循環(huán)酶/蛋白的基因(葡萄糖是在發(fā)酵過(guò)程中最廣泛使用的碳源并且抑制β氧化基因)。
[0020]2)在逆向/生物合成方向(如與它的天然分解代謝/降解方向相反)中驅(qū)動(dòng)β氧化循環(huán)。除了功能性表達(dá)β_氧化循環(huán)之外，我們提議以下改變方式來(lái)達(dá)到該途徑逆向操作:iv)微好氧/厭氧條件的使用通過(guò)三羧酸類(lèi)(TCA)循環(huán)抑制/最小化乙?；?CoA的代謝以及制備在逆向/生物合成方向中驅(qū)動(dòng)β氧化循環(huán)可獲得的乙?；?CoA ;v)pta(或ackA或兩者)、poxB、adhE、yqhD和eutE敲除阻斷/降低乙酸鹽(Δ pta或AackA和poxB)和乙醇(Λ adhE、AyqhD和AeutE)由乙酰基-CoA合成，因而制備可用于在逆向/生物合成方向中驅(qū)動(dòng)β氧化循環(huán)的乙酰基-CoA ；vi)硫解酶的過(guò)表達(dá)，在β氧化循環(huán)的逆轉(zhuǎn)中第一步使能夠引導(dǎo)乙?；?CoA至該途徑內(nèi)，因此在逆向方向中進(jìn)行它的操作；vii) IdhA、mgsA和frdA敲除分別阻斷/減少乳酸鹽(Δ IdhA和AmgsA)和琥拍酸鹽(AfrdA)由丙酮酸鹽和磷酸烯醇丙酮酸合成，制備用于合成乙?；?CoA的更多的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸鹽，因而制備可用于在逆向/生物合成方向中驅(qū)動(dòng)β氧化循環(huán)的乙?；?CoA;viii)丙酮酸鹽:黃素氧還蛋白氧化還原酶(ydbK)和?；?CoA脫氫酶(ydiO和ydiQRST)的過(guò)表達(dá)使能夠偶聯(lián)丙酮酸鹽氧化(丙酮酸鹽一乙?；?COA+C02+Fd,ed)和反式-Λ2-烯?；?CoA還原(反式_Δ2-烯酸基-CoA+FdMd—酸基-CoA),因此在逆向方向中驅(qū)動(dòng)β氧化。
[0021]3)將CoA硫酯中間體轉(zhuǎn)化成所需終產(chǎn)物。一般而言，存在若干種從逆向氧化循環(huán)中分離反應(yīng)中間體以及生成所需終產(chǎn)物的終止酶(圖1Α):
[0022]i) CoA硫酯水解酶/硫酯酶、或?；?CoA:乙?；?Cok轉(zhuǎn)移酶、或磷酸轉(zhuǎn)?；负陀糜隰人犷?lèi)的羧酸酯激酶(即短、中和長(zhǎng)鏈單羧酸類(lèi)、β_酮酸類(lèi)、β_羥基酸類(lèi)、反式-Δ 2-脂肪酸)；
[0023]ii)用于醇類(lèi)的形成醇的CoA硫酯還原酶(即短、中和長(zhǎng)鏈正醇類(lèi)、酮醇類(lèi)、1，3-二醇類(lèi)、反式-Λ2-醇類(lèi))；
[0024]iii)形成醛的CoA硫酯還原酶和醇脫氫酶，其一起形成醇類(lèi)(即短、中和長(zhǎng)鏈正醇類(lèi)、β -酮醇類(lèi)、1，3- 二醇類(lèi)、反式-Λ2-醇類(lèi))。根據(jù)需要，取決于所需終產(chǎn)物，能夠過(guò)表達(dá)一種或多種這些終止酶。
[0025]iv)形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶(其一起形成不同鏈長(zhǎng)的烷烴類(lèi)或端烯烴類(lèi))；以及
[0026]V)形成鏈烯烴的酶(其一起形成脂肪族內(nèi)烯烴類(lèi)或端烯烴類(lèi)或三烯類(lèi)或者烯醇類(lèi))。
[0027]根據(jù)需要，對(duì)于特定產(chǎn)物，終止酶能夠?yàn)樘烊换蚍翘烊唬珒?yōu)選逆向β氧化循環(huán)使用天然基因。
[0028]4.調(diào)節(jié)產(chǎn)物鏈長(zhǎng)。硫酯中間體的鏈長(zhǎng)決定終產(chǎn)物的長(zhǎng)度，以及使用具有所需鏈長(zhǎng)特異性的合適終止酶能夠控制。此外，通過(guò)降低或增加具有所需鏈長(zhǎng)特異性的硫解酶的活性能夠抑制或促進(jìn)鏈延長(zhǎng)。這兩種方法能夠一起或單獨(dú)使用。例如:
[0029]i)fadA、fadI和paaj的敲除以避免鏈延長(zhǎng)超出循環(huán)的1_至_2圈(取決于作為引物/起始分子的乙?；?CoA或丙?；?CoA的使用，生成4-和6-碳中間體和產(chǎn)物，或者5-和7-碳中間體和產(chǎn)物)和短鏈硫解酶yqeF或atoB或者諸如fucO或yqhD的短鏈醇脫氫酶的過(guò)表達(dá)；
[0030]ii)fadB、fadl和paaj的過(guò)表達(dá)以促進(jìn)長(zhǎng)鏈硫解酶tesA、tesB、fadM、ybgC或yciA或長(zhǎng)鏈醇脫氫酶(例如ucpA、ybbO、yiaY、betA、ybdH或eutG)的鏈延長(zhǎng)和過(guò)表達(dá)；本文所使用的術(shù)語(yǔ)“合適的”是指對(duì)特定鏈長(zhǎng)的給定中間體(即?；?CoA、烯酰基-CoA、羥基酰基-CoA和酮基?；?CoA)具有所需特異性的酶。請(qǐng)注意，通過(guò)操作硫解酶(如上所述)能夠控制硫酯中間體的鏈長(zhǎng)，因此終止酶僅得到所需鏈長(zhǎng)的硫酯。
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種工程化微生物，其包括產(chǎn)生醇類(lèi)、羧酸類(lèi)和烴類(lèi)的逆向β氧化循環(huán)，所述微生物包括:i)在缺乏脂肪酸和存在非脂肪酸碳源下所述β-氧化循環(huán)的表達(dá)；ii)在逆向/生物合成方向中所述β-氧化循環(huán)的功能運(yùn)行；iii)將逆向β氧化循環(huán)中間體轉(zhuǎn)化成所需醇、羧酸、或烴的一種或多種終止酶的過(guò)表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物,其中所述微生物產(chǎn)生醇類(lèi)并且已過(guò)表達(dá)i)形成醇的輔酶-A硫酯還原酶或者ii)形成醛的CoA硫酯還原酶和醇脫氫酶，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成醇類(lèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生羧酸類(lèi)并且已過(guò)表達(dá)硫酯酶、或?；?CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或磷酸轉(zhuǎn)酰基酶和羧酸酯激酶，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成羧酸類(lèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生烷烴類(lèi)或端烯烴類(lèi)并且已過(guò)表達(dá)形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成烷烴類(lèi)或端烯烴類(lèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其中所述微生物產(chǎn)生烯烴類(lèi)并且已過(guò)表達(dá)一種或多種形成鏈烯烴的酶，以將所述逆向β氧化循環(huán)的中間體轉(zhuǎn)化成烯烴類(lèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA、Δ crp、crp*、Δ adhE、Apta、AfrdAAldhAAmgsA0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其進(jìn)一步包括ydbK和ydiO-ydiQRST的過(guò)表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其進(jìn)一步包括ydbK、cysj以及NAD(P)H-依賴(lài)性酰基-CoA脫氫酶和NAD(P)H-依賴(lài)性反式烯?；?CoA還原酶中至少一者或兩者的過(guò)表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物，其進(jìn)一步包括aceEF-lpdA或厭氧活性丙酮酸脫氫酶或NAD-依賴(lài)性甲酸脫氫酶或丙酮酸-NADP氧化還原酶以及NAD (P) H-依賴(lài)性?；?Cok脫氫酶和NAD(P)H-依賴(lài)性反式烯酰基-CoA還原酶中至少一者或兩者的過(guò)表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA> Acrp、crp*、Δ adhE> Δ pta Δ yqhD> Δ eutE、yqeF+、fucO+。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其包括fadR、atoC(c)、ΔarcA> Acrp、crp*、Δ adhE> Δ pta Δ yqhD> Δ eutE、atoB+、fucO+。
12.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物,其進(jìn)一步包括以下之一:i) Δ fadD、fadBA+ ；ii)fadBA+、yiaY+ ；iii) Δ fadD、fadBA+、yiaY+ ；iv) fadBA+、eutG+ ；v) Δ fadD、fadBA+、eutG+ ；vi) fadBA+> betA+ ；vii) Δ fadD> fadBA+、betA+ ；viii) Δ fadD> fadBA+、fadM 或者 ix)ΔfadD、fadBA+、yciA+。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物,其進(jìn)一步包括fadA、fadI和paaj的敲除以及短鏈CoA硫酯水解酶或硫酯酶、或短鏈磷酸轉(zhuǎn)酰基酶和短鏈羧酸酯激酶、或短鏈?；?CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或形成醇的短鏈CoA硫酯還原酶、或形成醛的短鏈CoA硫酯還原酶和長(zhǎng)鏈醇脫氫酶、或形成醛的CoA硫酯還原酶和醛脫羰基酶、或形成醛的短鏈CoA硫酯還原酶和短鏈醛脫羰基酶、或形成鏈烯烴的酶中一者或多者的過(guò)表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物,其進(jìn)一步包括fadB、fadI和paaj的過(guò)表達(dá)以及長(zhǎng)鏈CoA硫酯水解酶或硫酯酶、或長(zhǎng)鏈磷酸轉(zhuǎn)酰基酶和長(zhǎng)鏈羧酸酯激酶、或長(zhǎng)鏈?；?CoA:乙?；?CoA轉(zhuǎn)移酶、或形成醇的長(zhǎng)鏈CoA硫酯還原酶、或形成醛的長(zhǎng)鏈CoA硫酯還原酶和長(zhǎng)鏈醇脫氫酶、或形成醛的長(zhǎng)鏈CoA硫酯還原酶和長(zhǎng)鏈醛脫羰基酶、或形成鏈烯烴的酶中一者或多者的過(guò)表達(dá)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物，其選自:
16.—種制備醇類(lèi)或羧酸類(lèi)的方法,所述方法包括使權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的微生物在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的肉湯中生長(zhǎng)足以允許產(chǎn)生醇或羧酸或者烷烴或烯烴的時(shí)間，以及分離所述醇或羧酸或者烷烴或烯烴。
17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中使所述微生物在30-40°C的溫度下在包含0-100 μ M FeSO4和0-5mM泛酸鈣的肉湯中在微好氧(<10%02)或厭氧條件下生長(zhǎng)。
18.一種制備產(chǎn)物的方法，所述方法包括使微生物在30-40°C的溫度下在使用0-100 μ MFeSO4和0_5mM泛酸鈣補(bǔ)充的葡萄糖基本培養(yǎng)基中在微好氧(<10%02)或厭氧條件下生長(zhǎng)足以允許產(chǎn)生產(chǎn)物的時(shí)間，以及分離所述產(chǎn)物，其中所述微生物和產(chǎn)物選自:
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其進(jìn)一步包括使用丙酸鹽補(bǔ)所述充培養(yǎng)基以產(chǎn)生奇數(shù)鏈長(zhǎng)產(chǎn)物。
20.一種細(xì)菌，其包括 fadR、atoC(c)、AarcA、Acrp、crp*、AadhE、Apta、Δ frdAΔIdhAΔmgsA。
21.一種埃希氏菌屬，其包括 fadR、atoC(c)、AarcA、Acrp、crp*、AadhE、Apta、Δ frdAΔIdhAΔmgsA。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103492560SQ201280014706
【公開(kāi)日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年2月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月7日
【發(fā)明者】R·岡薩雷斯, J·M·克羅姆伯格, C·德勒莫納科, E·N·米勒 申請(qǐng)人:威廉馬什萊斯大學(xué)