生產(chǎn)分泌型多肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包括使用對于多肽為外源的信號肽的多肽生產(chǎn)方法、包含編碼信號肽和多肽的第一和第二核苷酸序列的核酸構(gòu)建體、以及包含該核酸構(gòu)建體的表達載體和宿主細胞。信號肽是LQ2肽，其為地衣芽孢桿菌α-淀粉酶信號肽序列與解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶信號肽序列的雜合體。
【專利說明】生產(chǎn)分泌型多肽的方法
[0001]對序列表的引用
[0002]本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用的方式合并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及包括使用對于多肽為外源的信號肽的多肽生產(chǎn)方法、包含對信號肽和多肽進行編碼的第一和第二核苷酸序列的核酸構(gòu)建體、以及包含該核酸構(gòu)建體的表達載體和宿主細胞。
【背景技術(shù)】
[0004]異源蛋白在細菌宿主細胞特別是革蘭氏陽性細菌細胞例如芽孢桿菌(Bacillus)中的重組生產(chǎn)，可以提供更希望得到的用于以商業(yè)相關(guān)量生產(chǎn)蛋白的載體。
[0005]異源蛋白的重組生產(chǎn)通常是通過構(gòu)建適合宿主細胞的表達盒而完成的，在該表達盒中，編碼蛋白的DNA安置在調(diào)控基因的啟動子的表達控制下。將一個或多個拷貝的表達盒導(dǎo)入到宿主細胞的基因組中。然后通過在使表達盒上所含的啟動子適當(dāng)起作用所必需的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的宿主細胞，從而實現(xiàn)異源蛋白的生產(chǎn)。
[0006]對于蛋白重組生產(chǎn)的改進通常需要獲得適合于對宿主細胞中蛋白表達進行控制的新的調(diào)控序列。本發(fā)明的目的是提供改進的方法，使用信號肽序列在革蘭氏陽性宿主細胞中生產(chǎn)多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]在第一個方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)分泌型多肽的方法，包括:
[0008](a)在有益于多肽生產(chǎn)的介質(zhì)中培養(yǎng)革蘭氏陽性宿主細胞，其中該宿主細胞包含核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列為外源，第一核苷酸序列的3’端緊接在第二核苷酸序列的上游，第一核苷酸序列選自:
[0009](i)編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性；
[0010](ii)與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO: 10的575?661位所示的序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的核苷酸序列；以及
[0011](iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、0.09M Tris_HCl(pH7.6)、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’s 溶液、ImM 焦憐酸納、ImM憐酸二氫!納(sodium monobasic phosphate)、0.ImM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次(15分鐘)，并用6 X SSC洗滌兩次(各15分鐘)；以及任選地
[0012](b)從培養(yǎng)介質(zhì)中分離所分泌的多肽。
[0013]在第二個方面，本發(fā)明提供一種核酸構(gòu)建體，其包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列為外源，第一核苷酸序列的3’端緊接在第二核苷酸序列的上游，第一核苷酸序列選自:
[0014](i)編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽的氨基酸序列與SEQ ID N0:1具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性；
[0015](ii)與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的核苷酸序列；以及
[0016](iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl (ρΗ7.6)、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’s 溶液、ImM焦磷酸鈉·、ImM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次(15分鐘)，并使用6 X SSC洗滌兩次(各15分鐘)。
[0017]在第三個方面，本發(fā)明提供一種重組表達載體，其包含第二個方面的核酸構(gòu)建體。
[0018]本發(fā)明的第四個方面涉及一種重組宿主細胞，其包含第二個方面的核酸構(gòu)建體或第三個方面的表達載體。
[0019]在第五個方面，本發(fā)明涉及信號肽用于在革蘭氏陽性宿主細胞中生產(chǎn)多肽的用途，其中信號肽由第一核苷酸序列編碼，多肽由對于第一核苷酸序列為外源的第二核苷酸序列編碼，且第一核苷酸序列的3’端緊接在第二核苷酸序列的上游，其中第一核苷酸序列選自:
[0020](i)編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性；
[0021](ii)與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的核苷酸序列；以及
[0022](iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl (ρΗ7.6)、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’s 溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次(15分鐘)，并使用6 X SSC洗滌兩次(各15分鐘)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1示出實施例1的質(zhì)粒pMDT230。
[0024]圖2示出實施例1的質(zhì)粒pMDT231。
[0025]圖3示出實施例1的質(zhì)粒pMDT221。
[0026]圖4示出實施例1的質(zhì)粒pMcLpOO I。
[0027]圖5示出實施例1的質(zhì)粒pMcLp002。
[0028]圖6示出實施例2的質(zhì)粒pAEB787。
[0029]圖7示出實施例2的質(zhì)粒pAEB802。
[0030]圖8示出實施例3的質(zhì)粒pAEB790。
[0031]圖9示出實施例3的質(zhì)粒pAEB885。
[0032]圖10示出實施例3的質(zhì)粒pAEB909。
[0033]圖11示出實施例4中具有插入片段的兩個菌株AEB847和AEB951的染色體amyL區(qū)域的圖譜。
【具體實施方式】[0034]定義
[0035]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”是指多核苷酸，其直接指定多肽的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框決定，以起始密碼子例如ATG、GTG或TTG開始，以終止密碼子例如TAA、TAG或TGA結(jié)束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組合。
[0036]控制序列:術(shù)語“控制序列”是指對編碼本發(fā)明成熟多肽的多核苷酸的表達所必需的核酸序列。各個控制序列對于編碼多肽的多核苷酸可以是內(nèi)源的(即，來自相同基因)或外源的(即，來自不同基因)，或者可以是彼此為內(nèi)源或外源。這些控制序列包括但不限于，前導(dǎo)序列(leader)、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎幼印⒁约稗D(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入特定限制性酶切位點的目的，控制序列可設(shè)置有接頭，以促進控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)域相連接。
[0037]表達:術(shù)語“表達”包括涉及到多肽生產(chǎn)中的任何步驟，包括但不限于:轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
[0038]表達載體:術(shù)語“表達載體”是指線性或環(huán)狀DNA分子，包含有對多肽進行編碼并且可操作地與用于其表達的控制序列相連接的多核苷酸。
[0039]片段:術(shù)語“片段”是指，一個或多個(例如，數(shù)個)氨基酸從成熟多肽的氨基和/或羧基端缺失的多肽，其中片段是甜味的。
[0040]PrsA蛋白:枯草芽抱桿菌(B.subtil is) PrsA蛋白的分泌機構(gòu)在Kontinen, V.P.and Sarvas, M.(1988, J.Gen.Microbiol., 134:2333-2344)和 Kontinen, V.P.等人(1991, Mol.Microbiol.5:12731283)以及 W094/019471 (Novozymes A/S)中有過公開。編碼PrsA蛋白的prsA基因最初是通過降低數(shù)種胞外蛋白分泌的非致死突變而界定的(Kontinen, V.P.and Sarvas, M., (1988) J.Gen.Microbiol.，134:2333-2344)?；谒寺〉膒rsA基因的DNA序列和關(guān)于該基因和蛋白的后續(xù)工作，判斷prsA編碼一種作為伴侶蛋白并且跨細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運的蛋白(PrsA)。已發(fā)現(xiàn)PrsA蛋白與乳酸乳球菌(Lactococcus
Iact i s )的Pr tM蛋白具有有限的序列同源性(約30% )，其中Pr tM蛋白被認為促進所輸出的絲氨酸蛋白酶的成熟(Haandrikman, A.J.,等人,(1989) J.Bacteriol., 171:2789-2794; VoS，P.，等人，(1989) J.Bacteriol., 171:27952802)。
[0041]宿主細胞:術(shù)語“宿主細胞”是指，對于含有本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等敏感的任何細胞類型。術(shù)語“宿主細胞”包括因復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任意后代。
[0042]很高的嚴(yán)格條件:術(shù)語“很高的嚴(yán)格條件”是指，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下，在5XSSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)Southern blotting (DNA印跡)過程進行12?24個小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在70°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0043]高度嚴(yán)格條件:術(shù)語“高度嚴(yán)格條件”是指，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下，在5 X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和50%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過程進行12?24個小時。載體材料最終使用2 X SSC、0.2%SDS在65 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0044]中到高度嚴(yán)格條件:術(shù)語“中到高度嚴(yán)格條件”是指，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下，在5XSSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過程進行12?24個小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在60V下洗滌三次，每次15分鐘。
[0045]中等嚴(yán)格條件:術(shù)語“中等嚴(yán)格條件”是指，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下，在5 X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和35%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過程進行12?24個小時。載體材料最終使用2 X SSC、0.2%SDS在55 °C下洗滌三次，每次 15分鐘。
[0046]低等嚴(yán)格條件:術(shù)語“低等嚴(yán)格條件”是指，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下，在5 X SSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過程進行12?24個小時。載體材料最終使用2 X SSC、0.2%SDS在50°C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0047]很低的嚴(yán)格條件:術(shù)語“很低的嚴(yán)格條件”是指，長度為至少100個核苷酸的探針，在42°C下，在5XSSPE、0.3%SDS、200毫克/ml剪切并變性的鮭魚精子DNA和25%甲酰胺中預(yù)雜交并雜交，按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡過程進行12?24個小時。載體材料最終使用2XSSC、0.2%SDS在45 °C下洗滌三次，每次15分鐘。
[0048]分離的或純化的:術(shù)語“分離的”是指，處于非天然發(fā)生的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實例包括:(I)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)；(2)包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白、肽或輔助因子的任何物質(zhì)，其至少部分地從與其天然相關(guān)聯(lián)的一種或多種或所有天然發(fā)生成分中移出；(3)相對于天然出現(xiàn)的物質(zhì)，經(jīng)人工修飾的任何物質(zhì)；或者
(4)通過增加物質(zhì)相對于與其天然相關(guān)的其他組分的含量而修飾的任意物質(zhì)(例如，多個拷貝的物質(zhì)編碼基因；相比于與編碼物質(zhì)的基因天然相關(guān)的啟動子，使用更強的啟動子)。分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣本中。
[0049]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”是指，在翻譯和任何翻譯后修飾(例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后處于其最終形式的多肽。領(lǐng)域內(nèi)公知，宿主細胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達的兩種或多種不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端的氨基酸)的混合物。
[0050]成熟多肽編碼序列:術(shù)語“成熟多肽編碼序列”是指編碼成熟多肽的多核苷酸。
[0051]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是指單鏈或雙鏈核酸分子，其從天然存在的基因中分離出、或以自然中不會出現(xiàn)的方式修飾成包含核酸片段、或者是合成的，其包含一個或多個控制序列。
[0052]可操作地連接:術(shù)語“可操作地連接”是指一種構(gòu)造，其中控制序列相對于多核苷酸的編碼序列而安置在合適位置，從而使控制序列介導(dǎo)編碼序列的表達。
[0053]序列同一性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)性通過參數(shù)“序列同一,I"生”來描述。
[0054]出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件包),Rice 等人,2000, TrendsGenet.16:276-277)(優(yōu)選 5.0.0 或更新版本)的 Needle 程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman and Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453),來確定兩個氛基酸序列之間的序列同一性。所使用的參數(shù)是，空位開放罰分為10，空位擴展罰分為0.5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標(biāo)記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項得到的)被用作百分比同一性并計算如下:
[0055](相同殘基X100) / (比對長度-比對中的空位總數(shù))。
[0056]出于本發(fā)明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學(xué)開放軟件包)，Rice等人，2000,同上)(優(yōu)選5.0.0或更新版本)的Ne edle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch, 1970，同上)，來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性。所使用的參數(shù)是，空位開放罰分為10，空位擴展罰分為0.5，以及EDNAFULUNCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標(biāo)記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項得到的)被用作百分比同一性并計算如下:
[0057](相同的脫氧核糖核苷酸X100) / (比對長度-比對中的空位總數(shù))。
[0058]子序列:術(shù)語“子序列”是指，成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(例如，數(shù)個)核苷酸的多核苷酸；其中子序列編碼片段。
[0059]變體:術(shù)語“變體”是指，在一個或多個位置上包含一個或多個(例如，數(shù)個)氨基酸殘基的改變(即替換、插入和/或缺失)的多肽。替換是指用不同的氨基酸替換占據(jù)一個位置的氨基酸；缺失是指去除占據(jù)一個位置的氨基酸；插入是指將氨基酸添加至與占據(jù)一個位置的氨基酸相鄰接。
[0060]在第一個方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)分泌型多肽的方法，包括:
[0061](a)在有益于多肽生產(chǎn)的介質(zhì)中培養(yǎng)革蘭氏陽性宿主細胞，其中宿主細胞包含核酸構(gòu)建體，核酸構(gòu)建體包含與編碼該多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列為外源，第一核苷酸序列的3’端緊接在第二核苷酸序列的上游，第一核苷酸序列選自:
[0062](i)編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽的氨基酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性；
[0063](ii)與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的核苷酸序列；且
[0064](iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl (ρΗ7.6)、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’s 溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次(15分鐘)，并使用6 X SSC洗滌兩次(各15分鐘)；以及任選地
[0065](b)從培養(yǎng)介質(zhì)中分離分泌的多肽。
[0066]LQ2信號肽是地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis) α-淀粉酶的信號肽與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) α -淀粉酶的信號肽間的雜合體。LQ2信號肽的氨基酸I?11與地衣芽孢桿菌α -淀粉酶信號肽的氨基酸I?11相同，且LQ信號肽的氨基酸12?28與解淀粉芽孢桿菌α -淀粉酶信號肽的氨基酸20?36相同。LQ2信號肽的氨基酸序列為:
[0067]MKQQKRLYARLVLMCTLLFVSLPITKTS (SEQ ID NO:1)
[0068]在本發(fā)明方面的優(yōu)選實施方式中，第一核苷酸序列編碼包含SEQ ID Ν0:1氨基酸序列的信號肽；優(yōu)選地，第一核苷酸序列編碼由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成的信號肽、或編碼其保留有介導(dǎo)多肽進入細胞膜或跨細胞膜(例如，進入細胞分泌通路)的能力的肽片段。甚至更優(yōu)選地，第一核苷酸序列`由SEQ ID NO: 10的575?661位、或其子序列組成，其中子序列對保留有介導(dǎo)多肽進入細胞膜或跨細胞膜(例如，進入細胞分泌通路)的能力的信號肽進行編碼。
[0069]在另一個實施方式中，第一核苷酸序列對在一個或多個(例如，數(shù)個)位置包含替換、缺失和/或插入的變體信號肽進行編碼。在實施方式中，引入SEQ ID NO:1的信號肽中的氨基酸替換、缺失和/或插入的數(shù)量最高為10，例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9個。氨基酸變化可以是性質(zhì)輕微的，即不顯著影響蛋白折疊和/或活性的保守性氨基酸替換或插入；小的缺失，通常為I?5個氨基酸；小的氨基端或羧基端延伸。
[0070]保守性替換的實例是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。大體不改變特異活性的氨基酸替換為領(lǐng)域內(nèi)已知，并在例如H.Neurath and R.L.Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York 中記載。常見的替換為，Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。
[0071]或者，氨基酸變化的性質(zhì)為改變多肽的物化性質(zhì)。例如，氨基酸變化可以改進信號肽的熱穩(wěn)定性或改變pH最適條件。[0072]信號肽中的必要氨基酸可以根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)已知的步驟來鑒定，例如定點突變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham and Wells，1989，Science244:1081-1085)。在后述的技術(shù)中，在分子的每個殘基中引入單個丙氨酸突變，并針對所得的突變分子測試信號肽活性，以鑒定對于分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。參見，Hilton等人，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。必要氨基酸的鑒定也可以從與相關(guān)信號肽的比對中進行推斷。
[0073]可以使用已知的突變、重組和/或改組方法，接著通過相關(guān)篩選步驟，例如Reidhaar-Olson and Sauer, 1988，Science241:53—57;Bowie and Sauer, 1989,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:2152-2156 ；W095/17413 ;或 W095/22625 中所公開的那些，來做出單個或多個氨基酸的替換、缺失和/或插入并對其進行測試。其他可用的方法包括易錯PCR、嗷菌體展不(例如，Lowman 等人，1991，Biochemistry30:10832-10837 ;美國專利第5，223，409 號；W092/06204)以及定位誘變(Derbyshire 等人，1986, Gene46:145;Ner 等人，1988，DNA7:127)。
[0074]突變/改組方法可以與高通量、自動化篩選方法結(jié)合，來檢測由宿主細胞表達的所克隆突變多肽的活性(Ness等人，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)□編碼活性多肽的突變DNA分子可以使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法從宿主細胞中收集，并快速測序。這些方法使得可以快速確定多肽中單個氨基酸殘基的重要性。
[0075]信號肽可以是雜合體，其中一種信號肽的區(qū)域融合在另一信號肽區(qū)域的N端或C端。
[0076]信號肽來源
[0077]本發(fā)明的信號肽可以得自任何屬的微生物。出于本發(fā)明的目的，本文中與指定來源關(guān)聯(lián)使用的術(shù)語“得自”是指，由多核苷酸編碼的信號肽是由該來源或已插入該來源多核苷酸的菌株所產(chǎn)生。信號肽可以是細菌信號肽。例如，信號肽可以是革蘭氏陽性細菌信號肽，例如，芽孢 桿菌屬、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、海洋芽胞桿菌屬(OceanobaciIIus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)或鏈霉菌屬(Streptomyces)的信號肽。
[0078]在一個方面，信號肽是嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽胞桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacillus coagulans)、堅強芽抱桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽胞桿菌(Bacillus Iautus)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus Ientus)、地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophi lus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtil is)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的信號肽。
[0079]在另一方面，信號肽是馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcus uberis)或馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)的信號月太。
[0080]在另一方面，信號肽是不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)、天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)或變鉛青鏈霉菌(Streptomyces Iividans)的信號肽。[0081]在優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的第二核苷酸序列編碼對宿主細胞為內(nèi)源或異源的多肽。
[0082]優(yōu)選地，本發(fā)明的第二核苷酸序列對激素或激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、過敏原或報告子進行編碼；優(yōu)選地，酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶；最優(yōu)選地，酶是氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α -半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、木聚糖酶或β -木糖苷酶。
[0083]宿豐細朐
[0084]本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，包含與一個或多個介導(dǎo)本發(fā)明多肽生產(chǎn)的控制序列可操作地連接的本發(fā)明多核苷酸。將包含多核苷酸的構(gòu)建體或載體導(dǎo)入到宿主細胞中，從而使構(gòu)建體或載體保持為染色體整合子或作為前述的自我復(fù)制染色體外載體。術(shù)語“宿主細胞”包括因復(fù)制過程中發(fā)生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。對于宿主細胞的選擇將在很大程度上取決于編碼多肽的基因及其來源。
[0085]宿主細胞可以是任何可用于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)的細胞，例如，原核細胞或真核細胞。
[0086]原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、海洋芽胞桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬和鏈霉菌屬。
[0087]細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌細胞，包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽胞桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金 芽孢桿菌的細胞。
[0088]細菌宿主細胞也可以是任何鏈球菌細胞，包括但不限于，馬鏈球菌、化膿性鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種的細胞。
[0089]細菌宿主細胞也可以是任何鏈霉菌細胞，包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、阿維鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌和變鉛青鏈霉菌的細胞。
[0090]將DNA導(dǎo)入芽孢桿菌細胞可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang andCohen, 1979, Mol.Gen.Genet.168:111-115)、感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化(參見，例如，Young andSpizizen, 1961, J.Bacteriol.81:823-829 或 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J.Mol.Biol.56:209-221 )、電穿孔(參見,例如,Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques6:742-751)或接合(參見，例如，Koehler and Thorne, 1987，J.Bacteriol.169:5271-5278)來實現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入鏈霉菌細胞可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔(參見，例如，Gong等人，2004，F(xiàn)olia Microbiol.(Praha)49:399-405)、接合(參見，例如，Mazodier 等人，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke 等人，2001, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:6289-6294)來實現(xiàn)。將DNA導(dǎo)入鏈球菌細胞可以通過自然感受態(tài)(參見，例如，Perry and Kuramitsu, 1981, Infect.Tmmun.32:1295-1297)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt and Jollick, 1991，Microbios68:189-207)、電穿孔(參見，例如，Buckley 等人,1999, Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見，例如，Clewell, 1981, Microbiol.Rev.45:409-436)來實現(xiàn)。然而，可以使用任何領(lǐng)域內(nèi)已知的將DNA導(dǎo)入到宿主細胞中的方法。
[0091]核酸構(gòu)律體
[0092]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
[0093]多核苷酸可以以多種方式操作，從而提供多肽的表達。根據(jù)表達載體的不同，在多核苷酸插入載體之前對其進行操作可能是預(yù)望的或必需的。利用重組DNA法來修飾多核苷酸的技術(shù)為領(lǐng)域內(nèi)熟知。
[0094]控制序列可以是啟動子，即一種多核苷酸，被宿主細胞識別以表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。啟動子包含介導(dǎo)多肽表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是任何在宿主細胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的多核苷酸，包括突變、截短和雜合的啟動子，并且可以從編碼對于宿主細胞為同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中得到。
[0095]用于介導(dǎo)本發(fā)明核酸構(gòu)建體在細菌宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是得自解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽胞桿菌a -淀粉酶基因(amyL)、地衣芽胞桿菌青霉素酶基因(penP)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因、蘇云金芽孢桿菌cryIIIA 基因(Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiologyl3:97-107)、大腸桿菌Iac操縱子、大腸桿菌trc啟動子(Egon等人，1988，Gene69:301-315)、天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)和原核￠-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:3727-3731)以及 tac 啟動子(DeBoer 等人，1983, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:21-25)的啟動子。其他啟動子在 Gilbert 等人，1980，ScientificAmerican242:74-94 的“Useful proteins from recombinant bacteria (重組細菌的有用蛋白)”以及 Sambrook 等人，1989，Molecular Cloning:ALaboratory Manual 中有過記載。串聯(lián)啟動子的實例在W099/43835中公開`。
[0096]控制序列也可以是轉(zhuǎn)錄終止子，其被宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。終止子與編碼多肽的多核苷酸的3’端可操作地連接。在宿主細胞中起作用的任何終止子均可用在本發(fā)明中。
[0097]用于細菌宿主細胞的優(yōu)選終止子得自克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)、地衣芽胞桿菌a -淀粉酶(amyL)和大腸桿菌核糖體RNA (rrnB)的基因。
[0098]控制序列也可以是提高基因表達的mRNA穩(wěn)定子區(qū)域，在啟動子下游以及基因的編碼序列的上游。
[0099]合適的mRNA穩(wěn)定子區(qū)域的實例得自蘇云金芽孢桿菌cryIIIA基因(W094/25612)和枯草芽抱桿菌 SP82 基因(Hue 等人,1995, Journal of Bacteriologyl77:3465-3471 )。
[0100]控制序列也可以是前導(dǎo)序列，其是對于宿主細胞的翻譯而言較為重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼多肽的多核苷酸的5’端可操作地連接。可以使用任何在宿主細胞中起作用的前導(dǎo)序列。
[0101]控制序列也可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽N端的前肽。所得的多肽被稱為酶原或多肽原(或者在一些情況下稱為酵素原)。多肽原通常是無活性的并且可以通過前肽的催化性或自催化性切割而從多肽原轉(zhuǎn)化成活性多肽。前肽編碼序列可以得自于枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(W095/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氛酸蛋白酶和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) α因子的基因。
[0102]當(dāng)信號肽和前肽序列都存在時，前肽序列的位置緊鄰多肽的N端，而信號肽序列的位置緊鄰前肽序列的N端。
[0103]也可以添加相對于宿主細胞的生長而調(diào)控多肽表達的調(diào)控序列。調(diào)控體系的實例是，響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)控化合物的存在)而引起基因表達的啟動或關(guān)閉的那些。原核體系中的調(diào)控體系包括lac、tac和trp操縱子體系。在酵母中，可以使用ADH2體系或GALl體系。調(diào)控序列的其他實例是使得基因擴增的那些。
[0104]本發(fā)明的第二個方面涉及一種核酸構(gòu)建體，其包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列對于第二核苷酸序列為外源，第一核苷酸序列的3’端緊接在第二核苷酸序列的上游，且第一核苷酸序列選自:
[0105](i)編碼信號肽的核苷酸序列，該信號肽的氨基酸序列與SEQ ID N0:1具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO:1具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%同一性；
[0106](ii)與SEQ ID· NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性；或優(yōu)選與SEQ ID NO: 10的575?661位所示序列具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的核苷酸序列；且
[0107](iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQ ID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl (ρΗ7.6)、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’s 溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次(15分鐘)，并使用6 X SSC洗滌兩次(各15分鐘)。
[0108]在根據(jù)第二個方面的核酸構(gòu)建體的優(yōu)選實施方式中，第一核苷酸序列編碼包含SEQ ID NO:1氨基酸序列的信號肽；優(yōu)選第一核苷酸序列編碼由SEQ ID NO:1氨基酸序列組成的信號肽，或其保留有介導(dǎo)多肽進入細胞膜或跨細胞膜(例如，進入細胞分泌通路)的能力的肽片段；更優(yōu)選地，第一核苷酸序列由SEQ ID NO: 10的575?661位或其子序列組成，其中子序列編碼保留有介導(dǎo)多肽進入細胞膜或跨細胞膜(例如，進入細胞分泌通路)的能力的信號肽。
[0109]表汰載體
[0110]本發(fā)明還涉及重組表達載體，包含與啟動子可操作地連接并編碼本發(fā)明信號肽的多核苷酸、編碼序列以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。多種核苷酸和控制序列可以接在一起，以產(chǎn)生重組表達載體，該重組表達載體可以包含一個或多個方便的限制性位點以便在這些位點插入或替換入編碼多肽的多核苷酸。或者，多核苷酸可以通過向合適的表達載體中插入多核苷酸或包含多核苷酸的核酸構(gòu)建體而進行表達。在創(chuàng)建表達載體時，編碼序列位于載體中，從而使編碼序列與合適的控制序列可操作地連接以進行表達。
[0111]重組表達載體可以是能夠方便地進行重組DNA程序并能夠?qū)崿F(xiàn)多核苷酸表達的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。對載體的選擇將通常取決于載體與載體將要導(dǎo)入的宿主細胞之間的相容性。載體可以是線性質(zhì)粒或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。
[0112]載體可以是自主復(fù)制型載體，即作為染色體外實體而存在且其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制的載體，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以包含確保自我復(fù)制的任何元件(means)?；蛘?，載體可以是，在導(dǎo)入宿主細胞時整合到基因組中并與其整合的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單個載體或質(zhì)粒，或使用共同包含將要引入宿主細胞基因組中的總DNA的兩個或更多個載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
[0113]載體優(yōu)選包含一個或多個允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細胞、轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞等細胞的選擇標(biāo)記物。選擇標(biāo)記物是基因，其產(chǎn)物提供對生物滅殺劑的抗性或病毒抗性、重金屬抗性、原養(yǎng)型相對于營養(yǎng)缺陷型等。
[0114]細菌選擇標(biāo)記物的實例是地衣芽胞桿菌或枯草芽孢桿菌dal基因、或者賦予抗生素抗性例如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、壯觀霉素或四環(huán)素抗性的標(biāo)記物。
[0115]優(yōu)選載體包含有使載體整合到宿主細胞的基因組中或使載體在細胞中獨立于基因組而自主復(fù)制的元件。
[0116]對于整合入宿主細胞基因組，載體可以依賴于編碼多肽的多核苷酸序列或經(jīng)同源重組或非同源重組使載體整合入基因組的任何其他元件。或者，載體可以含有用于經(jīng)由同源重組而介導(dǎo)在染色體的精確位置整合入宿主細胞基因組的其他多核苷酸。為增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)當(dāng)包含足量的核酸，例如100-10，000個堿基對、400-10，000個堿基對、以及800-10，000個堿基對，其與相應(yīng)的靶序列具有高度的序列同一性，以增強同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，載體可以通過非同源重組而整合到宿主細胞的基因組中。
[0117]對于自主復(fù)制，載體還可以包含使載體能在被考慮的宿主細胞中自主復(fù)制的復(fù)制原點。復(fù)制原點可以是在細胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制原點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”是指使質(zhì)粒或載體能在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。
[0118]細菌復(fù)制原點的實例是使得在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制原點以及使得在芽孢桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和PAM - I的復(fù)制原點。
[0119]多于一個拷貝的本發(fā)明多核苷酸可以插入宿主細胞中，以增加多肽的生產(chǎn)。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可以通過將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組中而得到；或者通過包含可擴增選擇標(biāo)記物基因與多核苷酸而獲得，這樣，可以通過在合適選擇劑的存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有擴增拷貝的選擇標(biāo)記物基因的細胞，由此選擇含有額外拷貝的多核苷酸的細胞。·
[0120]用來連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的步驟為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見，例如，Sambrook等人，1989,同上)。
[0121]生產(chǎn)方法
[0122]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)多肽的方法，包括(a)在有益于生產(chǎn)多肽的條件下培養(yǎng)生產(chǎn)多肽的細胞；和6)回收多肽。
[0123]使用領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，在適合于生產(chǎn)多肽的營養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)宿主細胞。例如，細胞可以通過在合適介質(zhì)中在使得多肽表達和/或分離的條件下進行搖瓶培養(yǎng)、或者在實驗發(fā)酵罐或工業(yè)發(fā)酵罐中進行小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、分批發(fā)酵、分批補料發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)而進行培養(yǎng)。使用領(lǐng)域內(nèi)已知的步驟，在包含碳源、氮源以及無機鹽的合適營養(yǎng)介質(zhì)中進行培養(yǎng)。合適的介質(zhì)可以從商業(yè)供應(yīng)方處得到或者可以根據(jù)已公開組成(例如，在美國模式培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)進行制備。如果多肽分泌到營養(yǎng)介質(zhì)中，可以直接從介質(zhì)中回收多肽。如果多肽未被分泌，可以從細胞裂解液中進行回收。
[0124]可以使用領(lǐng)域內(nèi)已知的特定用于多肽的方法來檢測多肽。這些檢測方法包括但不限于，特定抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶檢定來確定多肽的活性。
[0125]多肽可以通過領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來回收。例如，可以通過常規(guī)程序從營養(yǎng)介質(zhì)中回收多肽，常規(guī)程序包括但不限于收集、離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。
[0126]多肽可以通過本領(lǐng)域已知的多種程序來純化，以獲得基本上純的多肽，這些程序包括但不限于色譜(例如，離子交換、親和、疏水、色譜聚焦和尺寸排阻)、電泳法(例如制備式等電聚焦)、差別溶解(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或萃取(參見，例如ProteinPurification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York,1989)。
[0127]實施例
[0128]實施例1.帶LQ2信號肽的麥芽糖淀粉酶
[0129]培養(yǎng)基
[0130]LB培養(yǎng)基由每升IOg胰蛋白胨、每升5g酵母提取物和每升5gNaCl組成。LB平板由LB培養(yǎng)基和每升15g的細菌瓊脂組成。LB牛奶平板由LB培養(yǎng)基、每升IOg的脫脂奶粉和每升15g的細菌瓊脂組成。 LB牛奶平板由LB培養(yǎng)基、每升5g的藍淀粉(starch azure,Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)和每升15g的細菌瓊脂組成。LB瓊脂和每升5g的藍淀粉。
[0131]2XYT培養(yǎng)基由每升16g胰蛋白胨、每升IOg酵母提取物和每升5g NaCl組成。
2X YT氨芐青霉素培養(yǎng)基由2 X YT培養(yǎng)基和每毫升100 μ g氨芐青霉素組成。2 X YT氨芐青霉素平板由2XYT氨芐青霉素培養(yǎng)基和每升15g細菌瓊脂組成。
[0132]TBAB 培養(yǎng)基由 Difco 膜蛋白血瓊脂基礎(chǔ)(BD Diagnostics, FranklinLakes, NJ, USA)組成。TBAB紅霉素/林可霉素平板由TBAB培養(yǎng)基和每毫升I μ g紅霉素及每升25 μ g林可霉素組成。
[0133]SMl培養(yǎng)基由每升6g (NH4)2HPCV每升26g J6普達美(Protamyl)水解物、每升1.2gMgSO4.7H20、每升 36g KH2PO4'每升 4.3gNa2HP04、每升 1.8g K2SO4'每升 0.1g CaCl2.2H20、每升28.5g蔗糖、每升18ml MicroPM低微量金屬溶液和每升0.5g SB2121消泡劑組成，調(diào)至 ρΗ7.0。
[0134]MicroPM 低微量金屬溶液由每升 0.49g MnSO4.H20、每升 1.97gFeS04.7H20、每升0.1g CuSO4.5H20、每升0.3g ZnCl2和每升19.6g檸檬酸組成。
[0135]J6普達美水解物制備如下:向在151夾套玻璃反應(yīng)器中的81溫水加入750g艾維美(Avebe)普達美。經(jīng)收獲管(harvest tube)對溶液噴射11/min的空氣5min,并以500rpm攪拌，并用循環(huán)水浴加熱直至溫度達到55°C。在約11的水中稀釋73g Alcalase2.4濃縮物，并將混合物添加至夾套玻璃反應(yīng)器中。溫度維持在55°C，并使用4N NaOH將pH維持在7.0。在添加Alcalase后4h停止pH控制和攪拌，并用水將體積調(diào)至101。
[0136]菌株
[0137]在枯草芽孢桿菌168A4中構(gòu)建芽孢桿菌質(zhì)粒?？莶菅挎邨U菌168A4源自枯草芽孢桿菌模式菌株 168 (BGSC1A1, Bacillus Genetic Stock Center, Columbus, 0H),并在spoIIAC、aprE、nprE和amyE基因具有缺失。這四個基因的缺失基本上如對于枯草芽孢桿菌A164 A 5所述的那樣(具體記載在美國專利第5，891，701中)進行。
[0138]使用接合供體宿主菌株枯草芽孢桿菌AEB711，進行質(zhì)粒從枯草芽孢桿菌向地衣芽胞桿菌受體菌株的接合轉(zhuǎn)移(在W02008/067423中公開)。該菌株在編碼D-丙氨酸消旋酶的air (dal)基因中有缺失且含有質(zhì)粒pBC16 (賦予四環(huán)素抗性)和pLS20，其賦予使含oriT的質(zhì)粒移動的能力。該菌株還具有插入在染色體amyE基因座中的編碼地衣芽孢桿菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 M.Blil904II 的基因(W02008/067423)。
[0139]LQ2信號肽
[0140]LQ2信號肽是地衣芽胞桿菌a _淀粉酶的信號肽與解淀粉芽孢桿菌a _淀粉酶的信號肽之間的雜合體。LQ2信號肽的氨基酸I?11與Termamyl信號肽的氨基酸I?11相同，且LQ信號肽的氨基酸12?28與解淀粉芽孢桿菌a -淀粉酶信號肽的氨基酸20?36相同。LQ2信號肽的氨基酸序列為:
[0141]MKQQKRLYARLVLMCTLLFVSLPITKTS (SEQ ID NO:1)
[0142]對編碼帶內(nèi)源信號肽的AmyM的基因的克隆
[0143]通過PCR克隆包含amyL核糖體結(jié)合位點、之后為編碼內(nèi)源信號肽和麥芽糖a-淀粉酶AmyM(NOVAMYL? )成熟肽的DNA序列的`DNA序列。根據(jù)Pitcher等人，1989，Lett.Appl.Microbiol.8:151-156的步驟，從芽孢桿菌TS25分離基因組DNA。使用以下的引物067827和067828，通過PCR從TS25基因組DNA中擴增amyM編碼區(qū)。根據(jù)制造商的說明書，在 PTC_200Peltier 熱循環(huán)儀(MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA)中，使用Phusion⑧熱啟動 DNA 聚合酶(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA)進行 PCR,使用以下的溫度方案:
[0144]? 96°C，2min, I 個循環(huán);
[0145]? 94°C，30s ；60°C 45s，每循環(huán)降 1°C ;及 72。。，Imin ；11 個循
[0146]環(huán)；
[0147]? 94。。，30s ；50°C,45s ；72°C lmin，每循環(huán)增 20s ;20 個循環(huán)；
[0148]? 72°C，5min ; I 個循環(huán)。
[0149]引物067827 (SEQ ID NO: 2):5 1 -gagctccacattgaaaggggaggagaatcatgaaaaagaaaacgctt
[0150]引物067828 (SEQ ID NO:3):5f -acgcgtctagttttgccacgtaac
[0151]根據(jù)制造商的說明書，使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒(QIAGENInc.，Valencia, CA, USA)來純化PCR產(chǎn)物。然后，根據(jù)制造商的說明書，使用Zero Blunt? TQPO? 克隆試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)將純化的 PCR 產(chǎn)物克隆到載體pCR4Blunt中以進行測序，并轉(zhuǎn)化到One Shot? T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細胞中(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),于37°C在2xYT氨節(jié)青霉素平板上進行氨節(jié)青霉素抗性選擇。使用 QIAGEN Plasmid Midi 試劑盒(QIAGEN Inc.，Valencia, CA, USA)從一個轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA，并通過DNA測序來驗證正確的序列。該質(zhì)粒被指定為PMDT230。
[0152]LQ2_AmyM基因融合的構(gòu)建
[0153]通過PCR利用重疊延伸拼接法(SOE)來構(gòu)建編碼LQ2信號肽與成熟AmyM多肽的融合體的DNA序列?？莶菅挎邨U菌BW229是枯草芽孢桿菌A164的衍生菌，其中amyL核糖體結(jié)合位點以及LQ2信號肽編碼序列整合在染色體amyE基因座(在W02011/084695中公開)。根據(jù)Pitcher等人(1989，同上)的步驟，從BW229分離基因組DNA。使用以下的引物998291和067830，通過PCR從BW229基因組DNA中擴增amyL核糖體結(jié)合位點和LQ2信號肽編碼序列。根據(jù)制造商的說明書，在RoboCycler Gradient40熱循環(huán)儀(StratageneCorporation, La Jolla, CA, USA)中，使用 Phusion?:熱啟動 DNA 聚合酶(New EnglandBiolabs, Inc., Beverly, MA, USA)進行 PCR,使用以下溫度方案:
[0154].98°C，30s，I 個循環(huán);
[0155].98°C, 30s ；55°C,30s ；72°C,30s ；30 個循環(huán)。
[0156]引物998291 (SEQ ID NO:4):5' -gagctccacattgaaaggggaggagaa
[0157]引物O6783O (SEQ ID NO:5):5' -ggaactgctggctgatgtttttgtaatc
[0158]使用以下引物067829和067828，通過PCR從芽孢桿菌TS25基因組DNA中擴增成熟AmyM的編碼區(qū)。根據(jù)制造商的說明書，在PTC_200Peltier熱循環(huán)儀(MJResearch, Inc., Waltham, MA, USA)中，使用 Phusion? 熱啟動 DNA 聚合酶(New EnglandBiolabs, Inc., Beverly, MA, USA)進行PCR,使用以下的溫度方案:
[0159].96°C，2min, I 個循環(huán);
[0160].94°C，30s ;60°C，45s，每循環(huán)降 1°C ;72°C，Imin ;11 個循環(huán)；
[0161].94。。，30s ；50°C,45s ;72°C，lmin，每循環(huán)增 20s ；20 個循環(huán)；
[0162].72°C, 5min, I 個循環(huán)。
[0163]引物O67829 (SEQ ID NO:6):5' -acatcagccagcagttccgcaagcgtca
[0164]引物O67828 (SEQ ID NO:7):5' -acgcgtctagttttgccacgtaac
[0165]根據(jù)制造商的說明書，使用QIAQUICK?;凝膠提取試劑盒，純化PCR產(chǎn)
物。然后使用引物998291和067828，通過SOE PCR將純化的PCR產(chǎn)物融合到單一PCR產(chǎn)物中。根據(jù)制造商的說明書，在RoboCycler Gradient40熱循環(huán)儀(StratageneCorporation, La Jolla, CA, USA)中，使用 Phusion? 熱啟動 DNA 聚合酶(New EnglandBiolabs, Inc., Beverly, MA, USA)進行PCR,使用以下的溫度方案:
[0166].98°C，30s，I 個循環(huán)；
[0167].98°C, 30s ；55°C,30s ；72°C,30s ；30 個循環(huán)。
[0168]所得的PCR產(chǎn)物包含amyL核糖體結(jié)合位點，接著是編碼LQ2信號肽與成熟AmyM的融合體的DNA序列。根據(jù)制造商的說明書，使?Π QIAQUICK?凝膠提取試劑盒純化PCR產(chǎn)物。然后根據(jù)制造商的說明書，使用Zero Blunt? ΤΟΡΟ?克隆試劑盒將純化的PCR產(chǎn)物克隆到載體pCR4Blunt中以進行測序，并轉(zhuǎn)化到One Shot? T0P10化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細胞中，于37°C在2XYT氨芐青霉素平板上 進行氨芐青霉素抗性選擇。使用QIAGEN PlasmidMidi試劑盒(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA)從一個轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA,并通過DNA測序來驗證序列。該質(zhì)粒被指定為PMDT231。
[0169]構(gòu)建用于在地衣芽胞桿菌amyL基因座插入amyM表達盒的質(zhì)粒
[0170]使用質(zhì)粒pMDT221作為在地衣芽胞桿菌的amyL基因座插入amyM基因的載體。質(zhì)粒 PMDT221 基于溫度敏感型質(zhì)粒 pE194 (Horinouchi and ffeisblum, 1982, J.Bacteriol.150:804-814),且包含紅霉素抗性標(biāo)記物ermC、復(fù)制因子repF和pE194的復(fù)制原點。其還包含質(zhì)粒 pUBllO 的 oriT 區(qū)域(McKenzie 等人，1986，Plasmid, 15:93-103)，使其經(jīng)接合而可移動。其還包含來自蘇云金芽孢桿菌擬步甲亞種(Bacillusthuringiensis subsp.tenebrionis)的 cry3A 基因的 5 '非翻譯區(qū)區(qū)域(Agaisse andLereclus, 1996, Mol.Microbiol.20:633-643),之后為蛋白酶基因aprH變體的編碼區(qū)和轉(zhuǎn)錄終止子(W02003/006602)以及地衣芽胞桿菌amyL基因的3'端片段。這樣，pMDT221與質(zhì)粒pTH013 (W02005/098016)相似，pTH013具有基本相同的結(jié)構(gòu)，除存在編碼甘露聚糖酶的基因來代替aprH變體外。
[0171]通過用pMDT230的amyM基因替換pMDT221中的aprH變體而構(gòu)建質(zhì)粒pMcLpOOl。質(zhì)粒pMDT221用限制性內(nèi)切酶SacI和MluI進行消化并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖
電泳進行分析，使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒純化出約5471bp的載體片段。質(zhì)粒PMDT230用SacI和MluI進行消化并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進行分析，使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒純化出約2193bp的包含amyL RBS和amyM編碼序列的片段。根據(jù)制造商的說明書，用 T4DNA連接酶(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA)將pNBT24載體片段與amyM片段連接在一起，并根據(jù)Anagnostopoulos andSpizizen, 1961, J.Bacteriol.81:741-746的步驟,用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168 A 4,于34°C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上進行紅霉素抗性選擇。使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒純化一個轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA,并通過DNA測序進行驗證。該質(zhì)粒被指定為pMcLpOO I,其為攜帶amyL RBS和amyM編 碼序列且兩側(cè)為上游的cry3A mRNA穩(wěn)定子區(qū)域和下游的amyL基因3'端的溫度敏感型質(zhì)粒。
[0172]通過用pMDT231的amyM基因替換pMDT221中的aprH變體來構(gòu)建質(zhì)粒pMcLp002。質(zhì)粒pMDT221用SacI和MluI進行消化并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進行分析，使用QIAQUICK'?凝膠提取試劑盒純化出約5471bp的載體片段。質(zhì)粒pMDT231用SacI和MluI進行消化并通過TBE緩沖液中的0.8%瓊脂糖電泳進行分析，使用QIAQUICK?凝膠提取試劑盒純化出約2181bp的包含amyL RBS和LQ2_AmyM編碼序列的片段。根據(jù)制造商的說明書，用 T4DNA 連接酶(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA)將 pNBT24 載體片段與amyM片段連接在一起，并根據(jù)Anagnostopoulos and Spizizen (1961,同上)的步驟，用連接物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168 A 4，于34°C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上進行紅霉素抗性選擇。使用QIAGEN Plasmid Midi試劑盒純化出一個轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒DNA，并通過DNA測序進行驗證。該質(zhì)粒被指定為pMcLp002，其為攜帶amyL RBS和LQ2_AmyM編碼序列且兩側(cè)為上游的cry3A mRNA穩(wěn)定子區(qū)域和下游的amyL基因3'端的溫度敏感型質(zhì)粒。
[0173]地衣芽胞桿菌amyM整合子的構(gòu)建
[0174]將質(zhì)粒pMcLpOOl和pMcLp002導(dǎo)入接合供體菌株枯草芽孢桿菌AEB711中，以通過接合轉(zhuǎn)移至地衣芽胞桿菌。根據(jù)Anagnostopoulos and Spizizen (1961,同上)的步驟，單獨用pMcLpOOl轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌AEB711，于34°C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上進行紅霉素抗性選擇，得到的轉(zhuǎn)化子被指定為枯草芽孢桿菌AEB711/pMcLp001。根據(jù)Anagnostopoulos and Spizizen (1961,同上)的步驟，單獨用pMcLp002轉(zhuǎn)化枯草芽抱桿菌AEB711，于34°C在TBAB紅霉素/林可霉素平板上進行紅霉素抗性選擇，得到的轉(zhuǎn)化子被指定為枯草芽孢桿菌AEB711/pMcLp002。
[0175]使用枯草芽孢桿菌供體菌株AEB711/pMcLp001和AEB711/pMcLp002，通過接合使質(zhì)粒pMcLpOOl和pMcLp002轉(zhuǎn)移至地衣芽胞桿菌受體菌株TH3 (W02005/123915)。地衣芽胞桿菌TH3于34°C在LB平板上生長過夜?？莶菅挎邨U菌AEB711/pMcLp001和AEB711/pMcLp002于34°C在補充有100 μ g D-丙氨酸和10 μ g四環(huán)素的TBAB紅霉素/林可霉素平板上生長過夜。然后從平板上刮下各菌株的細胞，并在補充有IOOyg D-丙氨酸的TBAB平板上將各供體菌株與受體菌株混合，形成直徑?2cm的圓。
[0176]將平板在34°C孵育約5小時。在這樣的條件下，供體菌株和受體菌株均能生長，且質(zhì)?？梢酝ㄟ^接合從供體轉(zhuǎn)移到受體。然后從平板上刮下細胞，懸浮于Iml的LB培養(yǎng)基中，將等分物鋪在TBAB紅霉素/林可霉素平板上，平板在34°C孵育過夜。在這樣的條件下，只有地衣芽胞桿菌轉(zhuǎn)化接合子(已通過接合轉(zhuǎn)移而接受質(zhì)粒的受體細胞)能夠生長。D-丙氨酸的缺乏阻止air-陰性供體的生長，且紅霉素的存在阻止原始受體的生長。
[0177]質(zhì)粒pBC16和pLS20也可以通過接合從供體菌株轉(zhuǎn)移，因而，通過不能在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而篩選沒有PBC16的轉(zhuǎn)化接合子，并通過PCR篩選沒有pLS20的轉(zhuǎn)化接合子。pMcLpOOl接合中既沒有pBC16也沒有pLS20的的一個紅霉素抗性轉(zhuǎn)化接合子被指定為地衣芽胞桿菌TH3/pMcLp001，且pMcLp002接合中既沒有pBC16也沒有pLS20的的一個紅霉素抗性轉(zhuǎn)化接合子被指定為地衣芽胞桿菌TH3/pMcLp002。
[0178]地衣芽胞桿菌TH3具有含Ρ—/ 3Α穩(wěn)定子三重串聯(lián)啟動子(Ρ17 )(W02005/123915)后接插在染色體amyL基因座中的編碼蛋白酶JP170的基因的表達盒。JP170亞麻酶在諾維信的W088/01293中記載為蛋白酶A。隨后諾維信生物技術(shù)公司的專利申請W098/56927公開了 JP170的氨基酸(多肽)序列和編碼JP170的DNA序列。通過雙同源重組在地衣芽胞桿菌TH3的amyL基因座插入質(zhì)粒pMcLpOOl和pMcLp002的amyM基因，代替JP170蛋白酶基因。在50°C下，在TBAB紅霉素/林可霉素平板上將地衣芽胞桿菌菌株TH3/pMcLp001和TH3/pMcLp002劃線得到單一群落，以選擇已經(jīng)通過同源重組在amyL基因座(經(jīng)cry3A mRNA穩(wěn)定子區(qū)域或3' amyL區(qū)域)插入質(zhì)粒的整合子。整合子隨后在LB平板上于34°C生長，以使所整合的質(zhì)粒從染色體切除。接著篩選不能在TBAB紅霉素/林可霉素平板上于37°C生長的群落，表明質(zhì)粒的丟失。對這些群落進一步篩選不能在LB牛奶平板上形成清潔圈(zone of clearing)的群落,表明JP170蛋白酶基因的丟失,并篩選能在LB藍淀粉平板上形成清潔圈的群落，表明amyM基因的導(dǎo)入。
[0179]從地衣芽胞桿菌TH3/pMcLp001得到的一個這樣的整合子被指定為地衣芽胞桿菌MCLP15，其在amyL基因座插入有包含三重串聯(lián)啟動子(P17)、amyL RBS、編碼AmyM蛋白及其內(nèi)源信號肽的編碼區(qū)以及amyL轉(zhuǎn)錄終止子的表達盒。
[0180]從地衣芽胞桿菌TH3/pMcLp002得到的另一個整合子被指定為地衣芽胞桿菌MCLP16，其在amyL基因座插入有包含三重串聯(lián)啟動子(P17)、amyL RBS、編碼AmyM蛋白及LQ2信號肽的編碼區(qū)以及amyL轉(zhuǎn)錄終止子的表達盒。
[0181]地衣芽胞桿菌MCLP15和MCLP16菌株的AmyM表達
[0182]比較地衣芽胞桿菌MCLP15和MCLP16的搖瓶培養(yǎng)的AmyM產(chǎn)出。地衣芽胞桿菌MCLP15和MCLP16在37°C下于Falcon2059試管的3ml LB培養(yǎng)液中在250rpm振蕩下生長5小時。對于各個菌株，對三個含25ml SMl培養(yǎng)基的125ml帶擋板搖瓶各自接種0.5ml起子培養(yǎng)物，并于37°C以250rpm振蕩孵育。在孵育的第三和第四天取樣，并檢定麥芽糖a-淀粉酶活性。如表I和圖1所示，在三天后，MCLP16培養(yǎng)物中的AmyM活性比MCLP15培養(yǎng)物中的AmyM活性超出約3.5倍的系數(shù)，在四天后超出約4.3倍。
[0183]麥芽糖a -淀粉酶活性測定如下:該方法聯(lián)合Beckman Coulter Biomek3000和Biomek NXCBeckman Coulter, Inc, Fullerton CA, USA)使用。在 0.1M 乙酸鈉、0.01%TritonX-100緩沖液pH5.0 (樣品緩沖液)中按照連續(xù)稀釋(從稀釋樣本的0倍至1/3倍，再至1/9倍)適當(dāng)稀釋培養(yǎng)液。使用二倍稀釋步驟將AmyL標(biāo)準(zhǔn)物稀釋在樣本緩沖液中，以10MANU/ml的濃度開始，并以1.25MANU/ml濃度結(jié)束。將共計20 的包含標(biāo)準(zhǔn)物的各稀釋液轉(zhuǎn)移到96孔平底板中。向各個孔中加入一百微升的麥芽三糖底物溶液(20mg/ml麥芽三糖，0.1M乙酸鈉，PH5.0)，然后在環(huán)境溫度下孵育45min。在孵育結(jié)束后，用IOOyl的0.06N NaOH猝滅反應(yīng)。將共20 Ul的包含標(biāo)準(zhǔn)物的各猝滅樣品轉(zhuǎn)移到新的96孔平底板中。將兩百微升的液體葡萄糖氧化酶試劑(Pointe Scientific, Inc,試劑盒23666-286)分配到20 y I樣品中。在環(huán)境溫度下，使用490nm的光密度測量反應(yīng)速率，計8min。根據(jù)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過推算來確定樣品濃度。
【權(quán)利要求】
1.一種生產(chǎn)分泌型多肽的方法，包括: (a)在有益于生產(chǎn)所述多肽的介質(zhì)中培養(yǎng)革蘭氏陽性宿主細胞，其中所述宿主細胞包含核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含與編碼所述多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列對于所述第二核苷酸序列為外源，所述第一核苷酸序列的3’端緊接在所述第二核苷酸序列的上游，所述第一核苷酸序列選自: (i)對氨基酸序列與SEQID NO:1具有至少80%同一性的信號肽進行編碼的核苷酸序列； (ii)與SEQID NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；以及 (iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中所述嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、ρΗ7.6 的 0.09Μ Tris-HCl、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’ s 溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次，計15分鐘，并使用6 X SSC洗滌兩次，每次15分鐘；以及任選地 (b)從培養(yǎng)介質(zhì)中分離所分泌的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列編碼包含SEQID NO:1的氨基酸序列的信號肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述第一核苷酸序列編碼由SEQID NO:1的氨基酸序列組成的信號肽或其肽片段，所述肽片段保留有介導(dǎo)所述多肽進入細胞膜或跨細胞膜例如進入細胞分泌通路的能力。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第一核苷酸序列由SEQID NO: 10的575?661位或其子序列組成，所述子序列編碼保留有介導(dǎo)所述多肽進入細胞膜或跨細胞膜例如進入細胞分泌通路的能力的信號肽。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼對于所述宿主細胞為內(nèi)源的多肽。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼對于所述宿主細胞為異源的多肽。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞包含一個或多個所述第二核苷酸序列的拷貝。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二核苷酸序列編碼激素或激素變體、酶、受體或其部分、抗體或其部分、過敏原或報告子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述酶是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶或連接酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述酶是氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、纖維二糖水解酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、木聚糖酶或·3 -木糖苷酶。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述革蘭氏陽性細菌宿主細胞是芽孢桿菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、地芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌、海洋芽胞桿菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬或鏈霉菌屬的細胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述革蘭氏陽性宿主細胞是芽孢桿菌細胞；優(yōu)選為嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽胞桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌的細胞。
13.一種核酸構(gòu)建體，包含與編碼多肽的第二核苷酸序列可操作地連接的編碼信號肽的第一核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列對于所述第二核苷酸序列為外源，所述第一核苷酸序列的3’端緊接在所述第二核苷酸序列的上游，所述第一核苷酸序列選自: (i)對氨基酸序列與SEQID NO:1具有至少80%同一性的信號肽進行編碼的核苷酸序列； (ii)與SEQID NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；以及 (iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸序列，其中所述嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、pH7.6 的 0.09M Tris-HCl、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’ s 溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次，計15分鐘，并使用6 X SSC洗滌兩次，每次15分鐘。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列編碼包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的信號肽。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列編碼由SEQIDNO:1的氨基酸序列組成的信號肽或其肽片段，所述肽片段保留有介導(dǎo)所述多肽進入細胞膜或跨細胞膜例如進入細胞分泌通路的能力。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的核酸構(gòu)建體，其中所述第一核苷酸序列由SEQID NO: 10的575?661位或其子序列組成，所述子序列編碼保留有介導(dǎo)所述多肽進入細胞或跨細胞膜例如進入細胞分泌通路的能力的信號肽。
17.—種重組表達載體,包含權(quán)利要求13?16中任一項所述的核酸構(gòu)建體。
18.—種重組宿主細胞,包含權(quán)利要求13?16中任一項所述的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求·17所述的表達載體。
19.信號肽 用于在革蘭氏陽性宿主細胞中生產(chǎn)多肽的用途，其中所述信號肽由第一核苷酸序列編碼，且所述多肽由對于所述第一核苷酸序列為外源的第二核苷酸序列編碼，所述第一核苷酸序列的3’端緊接在所述第二核苷酸序列的上游，其中所述第一核苷酸序列選自: (i)對氨基酸序列與SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的信號肽進行編碼的核苷酸序列；(ii)與SEQID NO: 10的575?661位所示序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；以及 (iii)在嚴(yán)格條件下與具有SEQID NO: 10的575?661位所示核苷酸序列的多核苷酸或其互補鏈雜交的核苷酸 序列，其中所述嚴(yán)格條件定義為，在低于所計算Tm5°C?10°C下，在 0.9M NaCl、ρΗ7.6 的 0.09Μ Tris-HCl、6mM EDTA、0.5%NP_40、I XDenhardt’s 溶液、ImM焦磷酸鈉、ImM磷酸二氫鈉、0.1mM ATP和每ml0.2mg酵母RNA中進行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，并在低于所計算Tm5°C?10°C下，在6XSCC+0.1%SDS中洗滌一次，計15分鐘，并使用.6 X SSC洗滌兩次，每次15分鐘。
【文檔編號】C12P1/04GK103443278SQ201280014578
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月23日
【發(fā)明者】S·T·約根森, A·布魯納 申請人:諾維信公司