在發(fā)酵期間用于酶促生產(chǎn)醇酯的脂肪酶的原位表達(dá)的制作方法
【專利摘要】本文公開了在發(fā)酵期間通過提供醇生產(chǎn)微生物生產(chǎn)醇酯的方法，所述微生物還包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸。
【專利說明】在發(fā)酵期間用于酶促生產(chǎn)醇酯的脂肪酶的原位表達(dá)
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請涉及并要求提交于2011年3月23日的美國臨時專利申請61/466712和提交于2011年6月17日的美國臨時專利申請61/498，292的優(yōu)先權(quán)，它們?nèi)膬?nèi)容以引用方式并入本文。
_3] 以電子方式提交的序列表參考
[0004]與本申請一起提交的、以ASCII文本文件格式的電子方式提交的序列表內(nèi)容(文件名:20120322_CL5145USNA_SeqList_ST25.txt,文件大小:656，901 字節(jié)，并且創(chuàng)建日期為:2012年3月22日)，其全文以引用方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]本發(fā)明涉及包括乙醇和丁醇的醇的發(fā)酵生產(chǎn)、以及采用原位產(chǎn)物移除方法的用于改善醇發(fā)酵的方法。
【背景技術(shù)】
[0006]醇在工業(yè)和科學(xué)中具有多種用途。例如醇可用作飲料(即，乙醇)、燃料、試劑、溶劑和防腐敗劑。例如丁醇是一種醇，它是重要的工業(yè)化學(xué)品，具有多種用途，包括用作燃料添加劑，在塑料工業(yè)中用作化學(xué)原料，以及在食品和風(fēng)味劑工業(yè)中用作食品級的提取劑。因此，高度需求醇如丁醇以及不依賴不可再生資源的高效生產(chǎn)方法。
[0007]利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)醇是一種這樣的生產(chǎn)方法，其利用來自可再生原料的底物。在丁醇生產(chǎn)中，具體地講一些生產(chǎn)`高產(chǎn)量丁醇的微生物也具有低的丁醇毒性閥值，使得當(dāng)生產(chǎn)丁醇時需要從發(fā)酵罐中去除丁醇。因此，存在對開發(fā)用于以高產(chǎn)率生產(chǎn)丁醇(盡管生產(chǎn)丁醇的微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中有低的丁醇毒性閾值)的有效方法和體系的持續(xù)需求。原位產(chǎn)物移除(ISPR)(也被稱為提取發(fā)酵)可用于從生產(chǎn)其的發(fā)酵容器中移除丁醇(或其它發(fā)酵性醇)，從而使微生物高產(chǎn)率生產(chǎn)丁醇。本領(lǐng)域已經(jīng)描述過的一種用于移除發(fā)酵性醇的ISPR方法是液-液提取(美國專利申請公布20090305370)。一般來講，關(guān)于丁醇發(fā)酵例如所述包括微生物的發(fā)酵培養(yǎng)基與有機(jī)提取劑接觸。所述有機(jī)提取劑和所述發(fā)酵培養(yǎng)基形成兩相混合物。所述丁醇分配至有機(jī)提取劑相，降低了在包含微生物的水相中的濃度，從而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。液-液提取由以下步驟引起:接觸提取劑和發(fā)酵液體培養(yǎng)基以將產(chǎn)物醇傳遞到提取劑中；分離提取劑相與水相；以及優(yōu)選地，再循環(huán)利用提取劑，同時在長期運(yùn)行期間最小化提取劑分配系數(shù)的降低。
[0008]每一個循環(huán)，提取劑可隨著時間進(jìn)行而被污染，例如通過作為可水解的淀粉的原料被進(jìn)料至發(fā)酵容器中的生物質(zhì)中存在的脂質(zhì)的積累。例如，在葡萄糖轉(zhuǎn)化為丁醇的過程中加載至發(fā)酵容器的液化玉米醪可產(chǎn)生包含玉米油的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，其通過同時的糖化和發(fā)酵產(chǎn)生(所述液化的醪的糖化在發(fā)酵過程中通過用于產(chǎn)生葡萄糖的葡糖淀粉酶的添加而發(fā)生)。在ISPR過程中，玉米油脂質(zhì)溶解于提取劑中可導(dǎo)致脂質(zhì)濃度隨著每次提取劑的循環(huán)利用而積累，這使得產(chǎn)物醇在提取劑中的分配系數(shù)降低，因?yàn)樘崛┲械闹|(zhì)濃度隨著每次循環(huán)利用而升高。
[0009]將液化醪中存在的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化成可在ISPR中使用的提取劑是一種減少進(jìn)料于發(fā)酵容器中的脂質(zhì)量的方法，它通過向發(fā)酵加入作為酯化作用催化劑的脂肪酶，用脂肪酸酯化在發(fā)酵期間產(chǎn)生的產(chǎn)物醇。此類方法在例如美國申請公布20110312044和20110312043，以及PCT申請公布W02011/159998中有所描述。
[0010]一直需要可供選擇的提取發(fā)酵方法，其也能夠減少與向發(fā)酵加入脂肪酶相關(guān)聯(lián)的成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本文提供的方法包括:a)提供發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含來源于生物質(zhì)原料的可發(fā)酵碳底物、產(chǎn)自來源于生物質(zhì)原料的可發(fā)酵碳底物的醇和醇生產(chǎn)微生物，其中醇生產(chǎn)微生物包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸，并且該微生物表達(dá)并展示或分泌所述多肽，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中存在脂肪酶活性山)使發(fā)酵培養(yǎng)基與羧酸接觸；其中脂肪酶活性以在細(xì)胞外將微生物產(chǎn)生的醇的至少一部分轉(zhuǎn)化成醇酯的足夠量存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中。在實(shí)施例中，醇生產(chǎn)微生物是酵母。在實(shí)施例中，將編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸工程化。在實(shí)施例中，該方法還包括使發(fā)酵培養(yǎng)基與提取劑接觸以形成包括水相和有機(jī)相的兩相混合物。在實(shí)施例中，提取劑包括所述羧酸。在實(shí)施例中，產(chǎn)物醇是C2-C8烷基醇。在實(shí)施例中，產(chǎn)物醇是乙醇。在實(shí)施例中，醇酯包括脂肪酸乙酯。在實(shí)施例中，產(chǎn)物醇是丁醇。在實(shí)施例中，醇酯包括脂肪酸丁酯。在實(shí)施例中，醇酯還包括脂肪酸乙酯。
[0012]在實(shí)施例中，本文提供的具有脂肪酶活性的多肽展示在微生物表面上。在實(shí)施例中，分泌出具有脂肪酶活性的 多肽。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含的序列與SEQID NO:249、250、251、252、253或它們的片段中的任何一個具有至少約70%同一性，至少約80%同一性，至少約90%同一性，或至少約95%同一性。在實(shí)施例中，編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含的序列與具有SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271或273的多核苷酸具有至少約70%同一性。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含的序列與具有 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它們的活性片段的多肽具有至少約70%同一性，至少約80%同一性，至少約90%同一性，或至少約95%同一性。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽是沒有糖基化的。
[0013]在實(shí)施例中，羧酸包括游離脂肪酸，所述游離脂肪酸來源于玉米油、低芥酸菜子油、棕櫚油、亞麻籽油、麻風(fēng)樹油、或大豆油。在實(shí)施例中，羧酸來源于與可發(fā)酵碳底物相同的生物質(zhì)原料。在實(shí)施例中，羧酸包括具有C12-C22直鏈或支化的脂肪鏈的羧酸。在實(shí)施例中，與提取劑的接觸和與羧酸的接觸同時發(fā)生。在實(shí)施例中，由微生物產(chǎn)生的醇的至少約60%有效滴度被轉(zhuǎn)化成醇酯。在實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基還包含甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合并且脂肪酶活性甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合的至少一部分水解以形成游離脂肪酸。
[0014]在實(shí)施例中，在發(fā)酵期間產(chǎn)生的醇的有效滴度大于由不包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生產(chǎn)微生物在發(fā)酵期間產(chǎn)生的醇的有效滴度，并且該微生物表達(dá)并分泌或展示所述多肽,使得發(fā)酵培養(yǎng)基中存在該脂肪酶活性。在實(shí)施例中，在發(fā)酵期間產(chǎn)生的醇的有效速率大于由不包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生產(chǎn)微生物在發(fā)酵期間產(chǎn)生的醇的有效速率，并且該微生物表達(dá)并分泌或展示所述多肽，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中存在該脂肪酶活性。
[0015]本文也提供了重組宿主細(xì)胞，其包含工程化的醇生產(chǎn)途徑；以及工程化的多核苷酸，其編碼具有脂肪酶活性的多肽。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含的序列與SEQID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或 274 或它們的活性片段具有至少約70%同一性，至少約80%同一性，至少約90%同一性，或至少約95%同一性。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽包含的序列與SEQ ID NO:249,250,251,252、253或它們的片段中的任何一個具有至少約70%同一性，至少約80%同一性，至少約90%同一性，或至少約95%同一性。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽是沒有糖基化的。在實(shí)施例中，編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸包含的序列與SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271或273具有至少約70%同一性，至少約80%同一性，至少約90%同一性，或至少約95%同一I"生。
[0016]本文也提供了重組宿主細(xì)胞，其包含醇生產(chǎn)途徑；和編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，其中該具有脂肪酶活性的多肽包含的序列與SEQ ID NO:2、4、6、256、
47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或 274 或它們的活性片段具有至少約70%同一性,至少約80%同一性,至少約90%同一性,或至少約95%同一性。在實(shí)施例中，具有脂肪酶活性的多肽還包含的序列與SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它們的片段中的任何一個具有至少約70%同一性，至少約80%同一性，至少約90%同一性，或至少約95%同一性。在實(shí)施例中，醇生產(chǎn)途徑是丁醇生產(chǎn)途徑。在實(shí)施例中，丁醇生產(chǎn)途徑是異丁醇生產(chǎn)途徑。在實(shí)施例中，宿主細(xì)胞還包含降低的或消除的丙酮酸脫羧酶活性。
[0017]本文也提供了提高醇生產(chǎn)微生物對產(chǎn)生的醇的耐受性的方法，該方法包括:工程化微生物以表達(dá)并分泌或展示具有脂肪酶活性的多肽；在使得微生物產(chǎn)生醇的條件下使工程化微生物與甘油三酯、甘油二`酯、甘油單酯、磷脂、游離脂肪酸、或它們的混合物以及碳底物接觸。在實(shí)施例中，使工程化微生物與甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合接觸，并且其中分泌的或展示的脂肪酶將甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合的至少一部分轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸。在實(shí)施例中，脂肪酶催化醇酯的形成。在實(shí)施例中，微生物產(chǎn)生醇的有效滴度大于由尚未經(jīng)工程化以表達(dá)并分泌具有脂肪酸活性的多肽的微生物產(chǎn)生醇的有效滴度。在實(shí)施例中，微生物還包含工程化的醇生物合成途徑。在實(shí)施例中，工程化的醇生物合成途徑是1-丁醇、2-丁醇、或異丁醇生物合成途徑。在實(shí)施例中，異丁醇生物合成途徑包括下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:丙酮酸至乙酰乳酸；乙酰乳酸至2，3-二羥基異戊酸；2，3- 二羥基異戊酸至2-酮異戊酸；2_酮異戊酸至異丁醛；以及異丁醛至異丁醇。
[0018]本文提供了在發(fā)酵期間生產(chǎn)丁酯的方法，該方法包括提供發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含碳底物和甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、以及磷脂、或它們的混合物；并且使發(fā)酵培養(yǎng)基與包含丁醇生物合成途徑的醇生產(chǎn)微生物接觸，其中所述微生物還包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且它表達(dá)并分泌或展示該多肽，使得發(fā)酵培養(yǎng)基中存在脂肪酶活性。在實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基還包含一種或多種羧酸。在實(shí)施例中，碳底物來源于生物質(zhì)。在實(shí)施例中，生物質(zhì)是玉米或甘蔗。在實(shí)施例中，碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂來源于相同的生物質(zhì)。
[0019]本文提供了發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含醇生產(chǎn)微生物、丁酯和丁醇，該醇生產(chǎn)微生物包含丁醇生物合成途徑并且還包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，所述多肽被表達(dá)并分泌或展示。
[0020]還提供了包含本文所述的微生物的動物飼料產(chǎn)品。
[0021]附圖和序列簡沭
[0022]并入本文并成為說明書的一部分的附圖和序列表示出了本發(fā)明，并且與說明書一起進(jìn)一步用來解釋本發(fā)明的原理并使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠利用本發(fā)明。
[0023]圖1示意性地示出了本發(fā)明的示例性方法和體系，其中微生物與羧酸和/或天然的油一起被提供至發(fā)酵容器。
[0024]圖2描繪了從丙酮酸生物合成異丁醇的例子生物合成途徑。
[0025]圖3 是質(zhì)粒 pRS423::TEF1 (M4) -CdLIPl ( “ρΝΑΚΙΟ” ；SEQ ID NO:45 ;參見實(shí)例I)的圖譜，該質(zhì)粒攜帶畸形假絲酵母(Candida deformans)LIPl脂肪酶，它在組成型TEFl (M4)啟動子(Nevoigt E, Kohnke J, Fischer CR, Alper H, Stahl U 和 StephanopoulosG(2006), Engineering of promoter replacement cassettes for fine-tuning of geneexpression in Saccharomyces cerevisiae.Appl Environ Microbiol 72:5266-5273)和CYCl轉(zhuǎn)錄終止子的轉(zhuǎn)錄控制下，位于酵母-大腸桿菌穿梭載體中。
[0026]圖4 是質(zhì)粒 pRS423::TEF1 (M4) -THl ip ( “pTVAN2” ；SEQ ID NO:100 ;參見實(shí)例 2)的圖譜，該質(zhì)粒攜帶疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus) Tlan脂肪酶,它在組成型TEF1(M4)啟動子(Nevoigt E等人)和CYCl轉(zhuǎn)錄終止子的轉(zhuǎn)錄控制下,位于酵母-大腸桿菌穿梭載體中。
[0027]圖5 是質(zhì)粒 pRS423::TEFl (M4)-CalB( “pTVAN3”;SEQ ID NO:;參見實(shí)例 7)的圖譜，該質(zhì)粒攜帶南極假絲酵母(Candida antarctica) CalB脂肪酶,它在組成型TEFl (M4)啟動子(Nevoigt E等人)和CYCl轉(zhuǎn)錄終止子的轉(zhuǎn)錄控制下,位于酵母-大腸桿菌穿梭載體中。
[0028]圖6是質(zhì)粒pYZ090AalsS(SEQ ID NO:43 ;參見實(shí)例)的圖譜，該質(zhì)粒攜帶酮醇酸還原異構(gòu)酶(KARI)酶0RF，位于酵母-大腸桿菌穿梭載體中。
[0029]圖7質(zhì)粒pBP915 (SEQ ID NO:44 ;參見實(shí)例9和10)的圖譜，該質(zhì)粒攜帶編碼二羥基酸脫水酶和醇脫氫酶的0RF，位于酵母-大腸桿菌穿梭載體中。
[0030]SEQ ID NO:1和2是來自南極假絲酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B( “CalB”)的核酸和氨基酸序列。
[0031]SEQ ID NO:3和 4是來自畸形假絲酵母(Candida deformans)的脂肪酶 I (“LIP1”)的核酸和氨基酸序列。
[0032]SEQ ID NO:5 和 6 是來自疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces lanuginosus)的 Tlan脂肪酶(“Tlan”)的核酸和氨基酸序列。
[0033]SEQ ID NO:255 和 256 是來自塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的脂肪酶3( “l(fā)ip3”)的核酸和氨基酸序列。
[0034]SEQ ID NO:7、8、9和257是來自南極假絲酵母(Candida antarctica)、畸形假絲酵母(Candida deformans)、疏棉狀嗜熱絲抱菌(Thermomyces lanuginosus)和塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)的CalB、LIPU Tlan和lip3脂肪酶的編碼序列，它們經(jīng)密碼子優(yōu)化以在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)。
[0035]SEQ ID NO:46和47是具有修飾N99A的CalB變體的核酸和氨基酸序列。
[0036]SEQ ID NO:48和49是具有修飾N146A的LIPl變體的核酸和氨基酸序列。
[0037]SEQ ID NO:50和51是具有修飾N167A的LIPl變體的核酸和氨基酸序列。
[0038]SEQ ID NO:52和53是具有修飾N146A和N167A的LIPl變體的核酸和氨基酸序列。
[0039]SEQ ID NO:54和55是具有修飾N55A的Tlan變體的核酸和氨基酸序列。
[0040]SEQ ID NO:271和272是具有修飾N59A的lip3變體的核酸和氨基酸序列。
[0041]SEQ ID NO:273和274是具有修飾N269A的lip3變體的核酸和氨基酸序列。
[0042]SEQ ID NO:275和276是具有修飾N59A和N269A的lip3變體的核酸和氨基酸序列。
[0043]SEQ ID NO:241 和 248 是來自白曲霉(Aspergillus kawachii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、嗜熱踩節(jié)菌(Talaromycesthermophilus)的脂肪酶的氨基酸序列。
[0044]SEQ ID NO:249和254是啤酒糖酵母(S.cerevisiae)的細(xì)胞表面錨定域的氨基酸序列。
[0045]SEQ ID NO:258 和 259 是來自木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)和印度拜耶林克氏菌(Beijerinkia indica)的醇脫氫酶的氨基酸序列。
[0046]SEQ ID NO:260和261是來自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)的酮酸脫羧酶的氨基酸序列。
[0047]SEQ ID NO:262和263是來自變異鏈球菌(Streptococcus mutans)和乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的二羥基酸脫水酶的氨基酸序列。
[0048]SEQ ID NO:10-45、56-144、153-238、240、264_270、277 和 278 是實(shí)例中所述的合成構(gòu)建體和引物序列。
【具體實(shí)施方式】
[0049]除非另行定義，否則本文所用的所有科技術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的一樣。如發(fā)生矛盾，以本申請(包括其定義)為準(zhǔn)。此外，除非上下文另有所需，單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)并且復(fù)數(shù)術(shù)語將包括單數(shù)。為所有目的，所有的出版物、專利、以及本文提及的其它參考資料均全文以引用方式并入本文。
[0050]為了進(jìn)一步限定本發(fā)明，本文提供了以下術(shù)語和定義。
[0051]如本文所用，術(shù)語“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它們的任何其它變型將被理解為是指包括指定的整數(shù)或整數(shù)組但不排除任何其它整數(shù)或整數(shù)組。例如，包含一系列元素的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備不必僅限于那些元素，而可包括其它未明確列出的元素，或此類組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備固有的元素。此外，除非另外特別說明，否則“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，以下任何一個均表示滿足條件A或B:A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。
[0052]此外，涉及元素或組分實(shí)例(即出現(xiàn))的數(shù)目在本發(fā)明元素或組分前的不定冠詞“一個”或“一種”旨在為非限制性的。因此，應(yīng)將“一個”或“一種”理解為包括一個或至少一個，并且元素或組分的詞語單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。
[0053]如本文所用，術(shù)語“發(fā)明”或“本發(fā)明”為非限制性術(shù)語，并且不旨在意指本發(fā)明的任何單獨(dú)實(shí)施例，而是涵蓋如專利申請所述的所有可能的實(shí)施例。
[0054]如本文所用，修飾本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的量使用的術(shù)語“約”是指可以通過例如以下方式而發(fā)生的用數(shù)字表示的量的變化:在真實(shí)世界中用于產(chǎn)生濃縮物或溶液的一般測量和液體處理操作；通過這些操作中非故意的誤差；用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的制造、來源或純度中的差異；等。術(shù)語“約”還包括由于產(chǎn)生自特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術(shù)語“約”來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。在一個實(shí)施例中，術(shù)語“約”指在報告數(shù)值的10%范圍內(nèi)，或者在報告數(shù)值的5%范圍內(nèi)。
[0055]如本文所用，“生物質(zhì)”指包含可水解多糖的天然產(chǎn)物，所述多糖提供可發(fā)酵糖，包括來源于天然來源如玉米、甘蔗、小麥、纖維素或木質(zhì)纖維素材料以及包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、淀粉、低聚糖、二糖和/或單糖、以及它們的混合物的材料的任何糖和淀粉。生物質(zhì)也可包含附加組分如蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。生物質(zhì)可來源于單一來源，或者生物質(zhì)可包括來源于一種以上來源的混合物；例如，生物質(zhì)可包括玉米棒和玉米秸桿的混合物，或草和葉片的混合物。生物質(zhì)包括但不限于生物能作物、農(nóng)業(yè)殘余物、市政固體垃圾、工業(yè)固體垃圾、來自造紙的淤渣、庭院垃圾、木材和林業(yè)垃圾。生物質(zhì)的例子包括但不限于:玉米粒、玉米棒、作物殘余物如玉米殼、玉米秸桿、草、小麥、黑麥、小麥秸桿、大麥、大麥秸桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、高粱、大豆、從谷物的研磨獲得的組分、樹、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木和灌叢、蔬菜、水果、花、動物糞肥、以及它們的混合物。例如,可通過本領(lǐng)域已知的任何加工方法，利用發(fā)酵加工生物質(zhì)以從生物質(zhì)中形成麥芽漿或果汁或糖蜜或水解產(chǎn)物，所述方法例如研磨、處理和/或液化，并且它們包含可發(fā)酵糖并可包含一定量的水。例如，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何`方法來加工纖維素和/或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)以獲得包含可發(fā)酵糖的水解產(chǎn)物。在美國專利申請公布US20070031918A1中公開了低氨預(yù)處理，該專利申請以引用方式并入本文。纖維素和/或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的酶促糖化通常利用酶聚生體來降解纖維素和半纖維素以產(chǎn)生包含糖的水解產(chǎn)物，所述糖包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。(適于纖維素和/或木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的糖化酶綜述于Lynd，L.R.等人(Microbiol.Mol.Biol.Rev.,66:506-577,2002)。
[0056]麥芽漿或果汁或糖蜜或水解產(chǎn)物可包括如本文所述的原料12和原料漿液16。含水原料流可通過本領(lǐng)域已知的任何加工方法，利用發(fā)酵加工生物質(zhì)來源于生物質(zhì)或從生物質(zhì)中形成，所述方法例如研磨、處理和/或液化，并且它們包含可發(fā)酵碳源(例如糖)和水。含水原料流可包括如本文所述的原料12和原料漿液16。
[0057]如本文所用，“產(chǎn)物醇”指在發(fā)酵過程中能夠由微生物產(chǎn)生的任何醇，所述微生物利用生物質(zhì)作為可發(fā)酵碳底物的來源。產(chǎn)物醇包括但不限于C1-C8烷基醇。在實(shí)施例中，產(chǎn)物醇為C2-C8烷基醇。在另外的實(shí)施例中，產(chǎn)物醇為C2-C5烷基醇。應(yīng)當(dāng)理解，C1-C8烷基醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。同樣地，C2-C8烷基醇包括但不限于乙醇、丙醇、丁醇和戊醇。“醇”本文也用于指產(chǎn)物醇。[0058]如本文所用，“丁醇”特指以單獨(dú)或其混合物形式的丁醇異構(gòu)體1- 丁醇(1-BuOH)、2- 丁醇(2-BuOH)和/或異丁醇(iBuOH或1-BuOH或1-BU0H，也稱為2_甲基-1-丙醇)。
[0059]如本文所用，“丙醇”指丙醇異構(gòu)體異丙醇或1-丙醇。
[0060]如本文所用，“戊醇”指戊醇異構(gòu)體1-戊醇、3-甲基-1- 丁醇、2-甲基-1- 丁醇、2，2-二甲基-1-丙醇、3-戊醇、2-戊醇、3-甲基-2-丁醇、或2-甲基-2-丁醇。
[0061]如本文所用，“原位產(chǎn)物移除(ISPR) ”指從諸如發(fā)酵的生物過程中，當(dāng)產(chǎn)物生成時選擇性移出具體的發(fā)酵產(chǎn)物以控制生物過程中的產(chǎn)物濃度。
[0062]如本文所用，“可發(fā)酵碳源”或“可發(fā)酵碳底物”是指能夠由本文所公開的微生物代謝以產(chǎn)生發(fā)酵醇的碳源。適當(dāng)?shù)目砂l(fā)酵的碳源包括但不限于單糖，如葡萄糖或果糖；二糖如乳糖或蔗糖；低聚糖；多糖如淀粉或纖維素；包括甲烷的一碳底物；以及它們的混合物。
[0063]如本文所用，“原料”是指發(fā)酵過程中的原料，所述原料包含具有或不具有不溶解的固體的可發(fā)酵碳源，并且如果適用，所述原料在通過進(jìn)一步加工(例如通過液化、糖化、或其它方法)已經(jīng)從淀粉中釋放可發(fā)酵碳源或從復(fù)糖降解中獲取可發(fā)酵碳源之前或之后包含可發(fā)酵碳源。原料包括或來源于生物質(zhì)。適宜的原料包括但不限于黑麥、小麥、玉米、甘蔗、以及它們的混合物。
[0064]如本文所用，“不溶解的固體”，是指原料的不可發(fā)酵的部分，例如，胚芽、纖維和谷蛋白。
[0065]如本文所用，“發(fā)酵液體培養(yǎng)基”是指水、糖、溶解的固體、微生物產(chǎn)生的醇、產(chǎn)物醇及發(fā)酵容器內(nèi)具有的所有其它物質(zhì)組分的混合物，其中產(chǎn)物醇通過在微生物的存在下使糖反應(yīng)生成醇、水和二氧化碳(CO2)而制得。有時，如本文所用，術(shù)語“發(fā)酵培養(yǎng)基”和“發(fā)酵混合物”可與“發(fā)酵液體培養(yǎng)基”同義使用。
[0066]如本文所用，“發(fā)酵容器”是指其中進(jìn)行發(fā)酵反應(yīng)的容器，產(chǎn)物醇如丁醇通過發(fā)酵反應(yīng)由糖制備。
[0067]如本文所用，術(shù)語“有效滴度”是指每升發(fā)酵培養(yǎng)基通過發(fā)酵產(chǎn)生的特定醇(例如丁醇)或通過醇的酯化作用產(chǎn)生的醇酯的醇等同物的總量。例如，在單位體積發(fā)酵中的丁醇的有效滴度包括:(i)發(fā)酵培養(yǎng)基中的丁醇量；(ii)由有機(jī)提取劑回收的丁醇量；(iii)如果使用汽提，從氣相回收的丁醇量，和(iv)在有機(jī)相或水相中的丁酯的當(dāng)量醇。
[0068]如本文所用，“糖化”是指低聚糖降解成單糖。“同步糖化和發(fā)酵”是指發(fā)酵和糖化在相同容器中同時發(fā)生。
[0069]如本文所用，“糖化酶”指能夠水解多糖和/或低聚糖例如糖原、淀粉的α -1，4_糖苷鍵的一種或多種酶。糖化酶也可包括能夠水解纖維素或木質(zhì)纖維素材料的酶。
[0070]如本文所用，“脂肪酶活性”是指催化水不溶性的或低水溶性的脂質(zhì)底物中的酯化學(xué)鍵水解的酶活性。脂肪酶是酯酶的一個亞類，并且就其本身而言，“脂肪酶活性”也指催化酯水解成羧酸和醇的酶活性，并且如本文所用，“脂肪酶活性”也指將醇和羧酸酯化成羧酸醇酯的酶活性。
[0071]如本文所用，“糖基化”是將碳水化合物分子酶促加成到生物大分子如蛋白上，這可能發(fā)生在蛋白定向分泌到細(xì)胞外時。在O-糖基化蛋白中，碳水化合物連接到絲氨酸、蘇氨酸、或酪氨酸殘基的羥基上。在N-糖基化蛋白中，碳水化合物連接到共有序列NXS/T中的天冬酰胺(N)殘基的酰胺側(cè)鏈上，其中X是任何氨基酸并且S/T是絲氨酸或蘇氨酸。如本文所用，“糖基化的”是指具有共價連接的碳水化合物的蛋白分子。
[0072]如本文所用，“液化容器”指其中進(jìn)行液化的容器。液化是其中低聚糖從原料中釋放出來的過程。在其中原料是玉米的實(shí)施例中，低聚糖在液化期間從玉米淀粉內(nèi)容物中釋放出來。
[0073]如本文所用，術(shù)語“分離”與“回收”同義，并且是指從初始混合物中移除化合物以獲得純度或濃度比初始混合物中的化合物純度或濃度更高的化合物。
[0074]術(shù)語“與水不混溶的”或“不溶解的”是指化學(xué)組分如提取劑或溶劑不能夠以形成單一液相的形式與水溶液如發(fā)酵液體培養(yǎng)基混合。
[0075]如本文所用，“提取劑”或“ISPR提取劑”是指用于提取任何產(chǎn)物醇如丁醇，或用于提取通過催化劑從產(chǎn)物醇和羧酸或脂質(zhì)產(chǎn)生的任何產(chǎn)物醇酯的有機(jī)溶劑。有時，如本文所用，術(shù)語“溶劑”可與“提取劑”同義使用。對于本文所述的方法，提取劑是與水不混溶的。
[0076]如本文所用“天然油”指獲取自植物(例如生物質(zhì))或動物的脂質(zhì)。如本文所用，“植物來源的油”特別地指從植物獲得的脂質(zhì)?！爸|(zhì)”?？膳c“油”和“酰基甘油酯”同義使用。天然油包括但不限于牛脂油、玉米油、低芥酸菜子油、癸酸/辛酸甘油三酯、蓖麻油、椰子油、棉籽油、魚油、霍霍巴油、豬油、亞麻籽油、牛蹄油、奧蒂油、棕櫚油、花生油、油菜籽油、稻米油、紅花油、大豆油、向日葵油、桐油、麻風(fēng)樹油和植物油共混物。
[0077]如本文所用，術(shù)語“有機(jī)相”是指通過使發(fā)酵液體培養(yǎng)基接觸與水不混溶的有機(jī)提取劑而獲得的兩相混合物中 的非水相。
[0078]如本文所用，術(shù)語“脂肪酸”指具有C4-C28碳原子(最常見地為C12-C24碳原子)的羧酸(例如脂族一元羧酸)，其是飽和或不飽和的。脂肪酸也可為支化或非支化的。脂肪酸在動物或植物的脂肪、油或蠟中可來源于或包含于酯化的形式。脂肪酸可以甘油酯形式在脂肪和脂肪油中天然存在，或者可通過水解脂肪或通過合成獲得。術(shù)語脂肪酸可描述單獨(dú)的化學(xué)物質(zhì)或脂肪酸的混合物。脂肪酸可包括質(zhì)子化的和非質(zhì)子化的脂肪酸的混合物，其中非質(zhì)子化的脂肪酸是非質(zhì)子化的脂肪酸鹽(例如鈉、鉀、銨、或鈣離子鹽)。此外，術(shù)語脂肪酸可涵蓋游離脂肪酸。
[0079]如本文所用，術(shù)語“脂肪醇”是指具有C4-C22碳原子的脂肪鏈的醇，其中的脂肪鏈為飽和的或不飽和的。
[0080]如本文所用，術(shù)語“脂肪醛”是指具有C4-C22碳原子的脂族鏈的醛，所述脂族鏈為飽和的或不飽和的。
[0081]如本文所用，術(shù)語“羧酸”指具有一般化學(xué)式COOH的任何有機(jī)化合物，其中碳原子通過雙鍵與氧原子結(jié)合形成羰基(C = O)，并且通過單鍵與羥基(OH)結(jié)合。羧酸可為質(zhì)子化羧酸的形式、或羧酸鹽形式(例如銨、鈉、或鉀鹽)、或質(zhì)子化羧酸與羧酸鹽混合物的形式。術(shù)語羧酸可描述單獨(dú)的化學(xué)物質(zhì)(例如油酸)或羧酸的混合物，其可通過例如水解生物質(zhì)來源的脂肪酸酯或甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂產(chǎn)生。
[0082]如本文所用，術(shù)語“丁醇生物合成途徑”或“丁醇生產(chǎn)途徑”是指產(chǎn)生1- 丁醇、2- 丁醇或異丁醇的酶途徑。
[0083]如本文所用，術(shù)語“ 1- 丁醇生物合成途徑”或“ 1- 丁醇生產(chǎn)途徑”是指從乙酰-輔酶A (乙酰-CoA)產(chǎn)生1- 丁醇的酶途徑。
[0084]如本文所用，術(shù)語“2- 丁醇生物合成途徑”或“2- 丁醇生產(chǎn)途徑”是指從丙酮酸產(chǎn)生2-丁醇的酶途徑。
[0085]如本文所用，術(shù)語“異丁醇生物合成途徑”或“異丁醇生產(chǎn)途徑”是指從丙酮酸產(chǎn)生異丁醇的酶途徑。
[0086]如本文所用，術(shù)語“醇生物合成途徑”或“醇生產(chǎn)途徑”是指將碳底物轉(zhuǎn)化成醇的酶途徑。包含“工程化的醇生產(chǎn)途徑”的重組宿主細(xì)胞是指包含修飾途徑的宿主細(xì)胞，該途徑以與宿主細(xì)胞中通常存在的途徑不同的方式生產(chǎn)醇。此類差異包括生產(chǎn)通常宿主細(xì)胞不生產(chǎn)的醇，或者提高產(chǎn)量或更有效地生產(chǎn)。
[0087]術(shù)語“基因”指能夠被表達(dá)為特定蛋白質(zhì)的核酸片段，其任選包括編碼序列前的調(diào)節(jié)序列(5'非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)節(jié)序列(3'非編碼序列)?！疤烊换颉敝缸匀粻顟B(tài)下與其自身的調(diào)控序列一起的基因?！扒逗匣颉笔侵赴烊坏夭灰黄鸫嬖诘恼{(diào)控和編碼序列的非天然的任何基因(即，它是從其天然狀態(tài)被修飾的或是來自另外的來源的)。因此，嵌合基因可包含源自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者源自相同來源、但排列方式與天然存在的排列方式不同的調(diào)控序列和編碼序列?！皟?nèi)源性基因”指在生物體基因組中處于其天然位置的天然基因?！巴鈦砘颉被颉爱愒葱曰颉敝杆拗魃镏型ǔ２蛔鳛樘烊换虼嬖诘牡峭ㄟ^轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入到宿主生物中的基因。外來基因可以包含插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因或嵌合基因。
[0088]如本文所用，術(shù)語“編碼區(qū)”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！昂线m的調(diào)控序列”指位于編碼序列的上游(5,非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，其可影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
[0089]術(shù)語“多核苷酸”旨在包括單數(shù)的核酸以及復(fù)數(shù)的核酸，并且是指核酸分子或構(gòu)建體，例如，信使RNA (mRNA)或質(zhì)粒DNA (pDNA)。如本文所用，“基因”是多核苷酸。多核苷酸可包含全長基因或cDNA序列的核苷`酸序列，或其片段，包括非翻譯的5'和3'序列以及編碼序列。所述多核苷酸可由任何多核糖核酸或多脫氧核糖核酸組成，其可以是非修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA (例如，異源性DNA)。例如，多核苷酸能夠由單鏈和雙鏈DNA構(gòu)成，其為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物；單鏈和雙鏈RNA，其為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物；包含DNA和RNA的雜合分子，其可為單鏈，或更典型地雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物?！岸嗪塑账帷卑嘶瘜W(xué)地、酶學(xué)地、或代謝地改性的形式。
[0090]如本文所用，“工程化的多核苷酸”是指已經(jīng)從天然存在的形式發(fā)生改變的多核苷酸，或者通過轉(zhuǎn)基因如轉(zhuǎn)化將多核苷酸引入宿主生物。此類修飾包括例如連接兩個天然不相連的序列，例如操作地連接天然不操作地連接的編碼序列與啟動子，或者將兩個編碼序列連接到一起以形成嵌合編碼序列。此類修飾也包括改變天然存在的多核苷酸的一個或多個核苷酸，包括堿基替換、插入、或缺失。
[0091]多核苷酸序列可意為“分離的”，其中它從天然的環(huán)境中移除出來。例如，包含在載體中的編碼具有二羥酸脫水酶活性多肽或多肽片段的異源性多核苷酸，出于本發(fā)明的目的可被認(rèn)為是分離的。分離的多核苷酸的另一個例子包括異源宿主細(xì)胞擁有的重組多核苷酸或溶液中的純化的(部分地或基本上)多核苷酸。根據(jù)本發(fā)明分離的多核苷酸或核酸還包括此類人工合成生產(chǎn)的分子。DNA聚合物形式的分離的多核苷酸片段可由一個或更多個cDNA、基因組DNA或合成DNA片段構(gòu)成。
[0092]如本文所用，術(shù)語“多肽”旨在涵蓋單數(shù)的“多肽”以及復(fù)數(shù)的“多肽”，并指由單體(氨基酸)通過酰胺鍵(也被稱為肽鍵)線性連接組成的分子。術(shù)語“多肽”是指任何兩個或更多個氨基酸的鏈，并且不涉及產(chǎn)物的特定長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”、或其它任何用于指由兩個或更多個氨基酸組成的一條鏈或多條鏈的術(shù)語，都包括在“多肽”的定義內(nèi)，并且術(shù)語“多肽”可用于取代或與這些術(shù)語中任一項(xiàng)互換使用。多肽可來源于天然生物源或由重組技術(shù)產(chǎn)生，但不一定是由指定的核酸序列翻譯的。它可由任何方式生成，包括通過化學(xué)合成。
[0093]以“分離的”多肽或片段形式的變體和其衍生物擬為不在其自然環(huán)境下的多肽。不需要特別的純化水平。例如，分離的多肽能夠從它原生的或天然的環(huán)境中去除。在宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生的多種多肽和蛋白質(zhì)考慮以所述發(fā)明目的進(jìn)行分離，即為原生的或重組的多肽，其已通過任何適宜的技術(shù)分離、分餾、或部分或大幅純化。
[0094]如本文所用，“ 重組微生物”是指通過重組DNA技術(shù)的使用(例如，通過工程化宿主細(xì)胞以包含生物合成途徑如丁醇的生物合成途徑)被改造的微生物如細(xì)菌和酵母。
[0095]如本文所用，術(shù)語“密碼子簡并性”是指在遺傳密碼中核苷酸序列允許變化的性質(zhì)，這種變化不影響編碼多肽中的氨基酸序列。技術(shù)人員非常了解具體宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子以確定給定氨基酸時所表現(xiàn)出的“密碼子偏好性”。因此，當(dāng)合成基因用以改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)時，期望對基因進(jìn)行設(shè)計，使得其密碼子使用頻率接近該宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子使用頻率。
[0096]如它是指用于轉(zhuǎn)化各種宿主的基因或編碼區(qū)的核酸分子，術(shù)語“密碼子優(yōu)化的”是指在基因或編碼區(qū)的核酸分子中的密碼子改變，反映了在沒有改變DNA編碼的多肽情況下宿主生物典型的密碼子使用情況。此類優(yōu)化包括將至少一個、或多于一個、或顯著的數(shù)目的密碼子替換為在那種生物體中使用頻率更高的一個或多個密碼子。
[0097]包含編碼任何多肽鏈的氨基酸的密碼子的核苷酸序列中的偏差，允許編碼該基因的序列中的變型。由于每一密碼子由三個核苷酸組成，而組成DNA的核苷酸限于四種特異性堿基，存在64種可能的核苷酸組合，其中的61種編碼氨基酸(其余三種密碼子編碼結(jié)束翻譯的信號)。本文將顯示哪些密碼子編碼哪些氨基酸的“遺傳密碼”重制為表I。因此，許多氨基酸被分配了多于一種的密碼子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四種三聯(lián)體編碼，絲氨酸和精氨酸由六種，而色氨酸和甲硫氨酸僅由一種三聯(lián)體編碼。這種簡并性允許DNA堿基組成在寬范圍內(nèi)變化而不會改變由該DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0098]表1:標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼
[0099]
【權(quán)利要求】
1.方法，包括: a)提供發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含來源于生物質(zhì)原料的可發(fā)酵碳底物、產(chǎn)自來源于生物質(zhì)原料的可發(fā)酵碳底物的醇和醇生產(chǎn)酵母微生物，其中所述醇生產(chǎn)微生物包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表達(dá)并展示或分泌所述多肽，使得所述發(fā)酵培養(yǎng)基中存在所述脂肪酶活性； b)使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與羧酸接觸； 其中所述脂肪酶活性以在細(xì)胞外將由所述微生物產(chǎn)生的醇的至少一部分轉(zhuǎn)化成醇酯的足夠量存在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與提取劑接觸以形成包括水相和有機(jī)相的兩相混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述提取劑包括所述羧酸。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述產(chǎn)物醇是C2-C8烷基醇。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述產(chǎn)物醇是乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸乙酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述產(chǎn)物醇是丁醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述醇酯包括脂肪酸丁酯 。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述醇酯還包括脂肪酸乙酯。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽在所述酵母微生物的表面上展示。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含與SEQID NO:249、250、251、252、253或它們的片段中的任何一個具有至少約70%同一性的序列。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸包含與具有 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273 的多核苷酸具有至少約70%同一性的序列。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含與具有 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它們的活性片段的多肽具有至少約70%同一性的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是沒有糖基化的。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述羧酸包括游離脂肪酸，所述游離脂肪酸來源于玉米油、低芥酸菜子油、棕櫚油、亞麻籽油、麻風(fēng)樹油、或大豆油。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述羧酸來源于與所述可發(fā)酵碳底物相同的生物質(zhì)原料。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述羧酸包括具有C12-C22直鏈或支化的脂肪鏈的羧酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求2-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述與提取劑的接觸和所述與羧酸的接觸同時發(fā)生。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中由所述微生物產(chǎn)生的醇的至少約60 %有效滴度被轉(zhuǎn)化成醇酯。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合，并且其中所述脂肪酶活性使所述甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合的至少一部分水解以形成游離脂肪酸。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述在發(fā)酵期間產(chǎn)生的醇的有效滴度大于由不包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生產(chǎn)微生物在發(fā)酵期間產(chǎn)生的醇的有效滴度，并且所述微生物表達(dá)并分泌或展示所述多肽，使得所述發(fā)酵培養(yǎng)基中存在所述脂肪酶活性。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述在發(fā)酵期間產(chǎn)生的醇的有效速率大于由不包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的多核苷酸的醇生產(chǎn)微生物在發(fā)酵期間醇產(chǎn)生的速率，并且所述微生物表達(dá)并分泌或展示所述多肽，使得所述發(fā)酵培養(yǎng)基中存在所述脂肪酶活性。
24.重組宿主細(xì)胞，包含: (a)工程化的醇生產(chǎn)途徑；和 (b)工程化的多核苷酸，其編碼具有脂肪酶活性的多肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含與SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或 274或它們的活性片段具有至少約70%同一性的序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含與SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它們的片段中的任何一個具有至少約70%同一性的序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽不包含糖基化基序。
28.根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽是沒有糖基化的。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸包含與 SEQ ID NO:1、3、5、7、8、9、46、48、50、52、54、255、271 或 273 具有至少約70%同一性的序列。
30.重組宿主細(xì)胞，包含: (a)醇生產(chǎn)途徑；和 (b)工程化的多核苷酸，其編碼具有脂肪酶活性的多肽`，其中所述具有脂肪酶活性的多肽包含與 SEQ ID NO:2、4、6、256、47、49、51、53、55、241、242、243、244、245、246、247、248、272、或274或它們的活性片段具有至少約70%同一性的序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述具有脂肪酶活性的多肽還包含與SEQ ID NO:249、250、251、252、253或它們的片段中的任何一個具有至少約70%同一性的序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求24-31中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述醇生產(chǎn)途徑是丁醇生產(chǎn)途徑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述丁醇生產(chǎn)途徑是異丁醇生產(chǎn)途徑。
34.根據(jù)權(quán)利要求24-33中任一項(xiàng)所述的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞還包含減少的或消除的丙酮酸脫羧酶活性。
35.提高醇生產(chǎn)微生物對所產(chǎn)生醇的耐受性的方法，所述方法包括: (a)工程化微生物以表達(dá)并分泌或展示具有脂肪酶活性的多肽； (b)在其中所述微生物產(chǎn)生醇的條件下，使所述工程化的微生物與下列接觸: 1.甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷脂、游離脂肪酸、或它們的混合物；以及 ?.碳底物。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中使所述工程化的微生物與甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合接觸，并且其中所述分泌的或展示的脂肪酶將所述甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的組合的至少一部分轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述脂肪酶催化醇酯的形成。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述微生物產(chǎn)生的醇的有效滴度大于由尚未經(jīng)工程化以表達(dá)并分泌具有脂肪酶活性的多肽的微生物產(chǎn)生的醇的有效滴度。`
39.根據(jù)權(quán)利要求35-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述醇生物合成途徑是工程化的醇生物合成途徑。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述工程化的醇生物合成途徑是異丁醇生物合成途徑。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述異丁醇生物合成途徑包括下列底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化: (a)丙酮酸至乙酰乳酸； (b)乙酰乳酸至2，3-二羥基異戊酸； (c)2，3- 二羥基異戊酸至2-酮異戊酸； (d)2-酮異戊酸至異丁醛；以及 (e)異丁醛至異丁醇。
42.在發(fā)酵期間生產(chǎn)丁酯的方法，包括: (a)提供發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含碳底物以及甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂、或它們的混合物；以及 (b)使所述發(fā)酵培養(yǎng)基與包含丁醇生物合成途徑的醇生產(chǎn)微生物接觸，其中所述微生物還包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，并且所述微生物表達(dá)并分泌或展示所述多肽，使得所述發(fā)酵培養(yǎng)基中存在所述脂肪酶活性。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基還包含一種或多種羧酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述碳底物來源于生物質(zhì)。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述生物質(zhì)是玉米或甘蔗。
46.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述碳底物以及所述甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯和磷脂均來源于所述相同的生物質(zhì)。
47.發(fā)酵培養(yǎng)基，包含醇生產(chǎn)微生物、丁酯和丁醇，所述醇生產(chǎn)微生物包含丁醇生物合成途徑并且還包含編碼具有脂肪酶活性的多肽的工程化多核苷酸，所述多肽被表達(dá)并分泌或展示。
48.動物飼料產(chǎn)品，包含權(quán)利要求 24-34中任一項(xiàng)的微生物。
【文檔編號】C12P7/16GK103459587SQ201280014656
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月23日
【發(fā)明者】R.迪科斯莫, A.L.克魯科伯格, T.E.范阿肯 申請人:布特馬斯先進(jìn)生物燃料有限責(zé)任公司