一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及養(yǎng)殖海參腐皮病綜合癥病原菌的檢測【技術領域】，具體的說，涉及一種快速檢測海參腐皮病綜合癥之主要病原菌燦爛弧菌的方法。本發(fā)明用于克服現(xiàn)有海參海參腐皮病綜合癥主要病原菌——燦爛弧菌檢測技術的不足，提供一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法。將細菌純培養(yǎng)物離心、清洗，凍融、煮沸，作為模板進行LAMP擴增；針對燦爛弧菌flgF基因設計LAMP引物；配置并優(yōu)化反應體系，65℃溫浴45min，肉眼或電泳判斷結果。本發(fā)明首次將LAMP技術應用于海參腐皮病綜合癥病原菌——燦爛弧菌的檢測當中，具有耗時短，成本低，簡便易用等優(yōu)點，適于在基層推廣。
【專利說明】一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于養(yǎng)殖海參腐皮病綜合癥病原菌的檢測【技術領域】，具體的說，涉及一種快速檢測海參腐皮病綜合癥之主要病原菌燦爛弧菌的方法。
【背景技術】:
[0002]據(jù)不完全統(tǒng)計，我國每年因水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題而造成的直接經(jīng)濟損失高達數(shù)百億元。研究開發(fā)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害診斷分析的技術，尤其是對于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的早期診斷分析試劑(盒)，為實現(xiàn)對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害病原的準確、靈敏檢測及疫病的早期快速診斷具有很高的實用價值。
[0003]海參腐皮病綜合征是一種養(yǎng)殖海參常見病，具有特點發(fā)病廣，涉及所用的刺參養(yǎng)殖區(qū)；發(fā)病快，一旦發(fā)病很快蔓延全池；危害重，可造成90%以上的死亡率等特點。給海參養(yǎng)殖戶造成了很大的損失。關于海參腐皮病綜合癥病原菌的研究與分析已有文獻報道，其中燦爛弧菌被認為是腐皮病綜合征的主要病原之一。在人工感染條件下可以導致健康海參呈現(xiàn)腐皮病的特征 。
[0004]關于燦爛弧菌的檢測及分析技術已有相關的報道。包括基于16s-23s核糖體RNA間隔序列的PCR檢測方法，基于抗原抗體反應的Dot-ELISA方法等。這些方法特異性較強，可以實現(xiàn)燦爛弧菌的快速鑒定。但存在需要昂貴的檢測儀器(基因擴增儀)、制備抗體等不足，對結果的判讀需要一定的生物學甚至分子生物學知識，這些限制了其在基層特別是養(yǎng)殖場的推廣應用。
[0005]環(huán)介導的核酸等溫擴增技術(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是2000年由日本學者Notomi T等提出。通過對靶基因的6個不同區(qū)域設計2對特異性引物，利用具有鏈置換功能的DNA聚合酶，在等溫條件下(65°C左右)實現(xiàn)核酸的擴增反應，由于擴增的片段很小，擴增效率很高，結果的判定可以通過是否產(chǎn)生焦磷酸鎂白色渾濁來判讀。
[0006]由于LAMP具有高靈敏(比傳統(tǒng)PCR高出2-5個數(shù)量級)、高效性(反應時間30-60min)、成本低廉(無需PCR儀)、結果判讀簡單(目視)等優(yōu)越特點，被認為是新型的PCR替代技術。從2003年開始，LAMP逐步應用到病原微生物的檢測和傳染性疾病的診斷中。在日本，LAMP技術已廣泛應用于病毒、細菌、寄生蟲等疾病的檢測，食品化妝品安全監(jiān)測及進出口快速檢疫中，并成功開發(fā)為診斷試劑推向國內(nèi)及國際市場。
[0007]LAMP技術應用于食品及水產(chǎn)動物病害的檢測分析的研究中，國內(nèi)業(yè)已有相關文章和專利報道。如針對貝類中副溶血弧菌的檢測中，研究者以特異性gyrB基因為靶基因設計引物，對純培養(yǎng)的副溶血弧菌的檢測限度可達1900CFU/mL ;利用霍亂弧菌種特異性的epsM基因和CtxA基因設計引物，可以快速檢測霍亂弧菌；利用石斑魚虹彩病毒(SGIV)的0RF-041L設計引物，利用LAMP實現(xiàn)SGIV感染石斑魚的檢測等等。

【發(fā)明內(nèi)容】
:[0008]本發(fā)明首次將LAMP技術應用于海參腐皮病綜合癥病原菌——燦爛弧菌的檢測當中，用于克服現(xiàn)有海參海參腐皮病綜合癥主要病原菌——燦爛弧菌檢測技術的不足，提供一種利用LAMP技術快速檢測燦爛弧菌的方法。
[0009]為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案，采用環(huán)介導等溫核酸擴增檢測方法(LAMP)。[0010]具體的制備步驟為，
[0011]1、LAMP模板的制備
[0012]將細菌純培養(yǎng)物依次進行離心、清洗、凍融和煮沸，得到LAMP模板。
[0013]2、基因序列分析及引物設計
[0014]比照已報道(網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫資料:http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)的弧菌屬細菌毒力相關因子，選擇弧菌屬細菌中普遍存在的鞭毛相關基因flgF，通過GenBank數(shù)據(jù)庫查找已知弧菌flgF的全基因及蛋白質序列。利用DNAMAN軟件對獲得的9株弧菌flgF完整DNA及蛋白質序列進行比對分析。篩選燦爛弧菌DNA序列中的有別于其他弧菌的特殊區(qū)域。
[0015]通過上述分析，選擇燦爛弧菌中保守區(qū)域作為引物區(qū)域。引物設計采用Primerpremier5.0引物設計軟件。設計的LAMP引物序列為:
[0016]正向外引物F3:5'-GGATCGCGCACTGTTTCT-3'
[0017]反向外引物B3:5'-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3'
[0018]正向內(nèi)引物FIP:
[0019]5'-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3'
[0020]反向內(nèi)引物BIP:
[0021 ] 5'-AGCACAAGCACGTTCAATGCAACCGTCATGCTGAAAACACGA-3'。
[0022]3、擴增反應
[0023]將制得的LAMP模板和LAMP引物混合進行擴增反應，25 μ L的反應液中含LAMP模板0.2-0.4 μ L，濃度為IOuM的正向外引物F30.5-1 μ L，濃度為IOuM的反向外引物Β30.5-1 μ L，濃度為20uM的正向內(nèi)引物FIP 1.5-2.5 μ L，濃度為20uM的反向內(nèi)引物BIP 1.5-2.5 μ L，濃度為IOOmM的MgSO4L 5-4 μ L，濃度為IOmM的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 1.5-3 μ L，濃度為5Μ的甜菜堿4_5 μ L，濃度為IOX的Bst DNA聚合酶緩沖液
2.5 μ L，濃度為8000U/mL的Bst DNA聚合酶(大片段)0.5-1 μ L，余量為雙蒸水(ddH20)，反應液在60-65°C下反應30-60min ;然后置于80_85°C下終止反應8_10min。
[0024]優(yōu)化反應體系,65 °C溫浴反應45min.[0025]4、通過濁度觀察、離心觀察和電泳觀察對結果進行分析。
[0026](I)濁度觀察:若反應后的產(chǎn)物與陰性對照管明顯顯示白色絮狀渾濁，證明所測菌株為燦爛弧菌，反之亦然。
[0027](2)離心觀察:將反應后的產(chǎn)物常溫下5000-6000rpm離心10_30s，若反應管底部見白色沉淀，則待測菌株為燦爛弧菌，反之亦然。
[0028](3)電泳觀察:將反應產(chǎn)物與DNA電泳上樣緩沖液混合后，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，80-100V電泳20-30min，EB染色，紫外下觀察若見梯形條帶，則待測菌株為燦爛弧菌，反之亦然。[0029]本發(fā)明的有益效果:
[0030]本發(fā)明具有靈敏度高、特異性強，檢測方法簡單易操作，耗時短，無需昂貴儀器，檢測成本低廉等特點。適合快速檢測海參腐皮病綜合征之一的燦爛弧菌病原，尤其適用于基層檢驗檢疫機構或養(yǎng)殖場進行相關病原菌的檢測和分析，為提高食品衛(wèi)生安全水平和進行疾病的早期檢測和防控具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0031]圖1為flgF序列分析及引物設計區(qū)域示意圖。
[0032]圖2為LAMP引物設計示意圖，其中黑色框架包圍的區(qū)域為引物設計區(qū)域。
[0033]圖3為實施例1的LAMP濁度檢測結果示意圖:其中，I為無添加DNA模板；2為添加燦爛弧菌DNA的模板。A為LAMP結束后肉眼觀察的反應體系濁度變化情況，C為A的管底部放大圖；B，LAMP反應結束后離心后觀察到的沉淀情況，D為B的管底部放大圖。
[0034]圖4為不同反應時間的反應產(chǎn)物的電泳檢測圖:其中1，DNAmarker, 2-6為的反應時間依次為 Omin, 15min, 30min, 45min, 60min。
[0035]圖5為填加不同濃度的dNTP后的反應產(chǎn)物的電泳檢測圖:其中1，DNA marker, 2-7的 dNTP 濃度依次為 3.0mM, 2.5mM, 2.0mM, 1.5mM, 1.0mM, 0.5mM。
[0036]圖6為填加不同濃度的Betaine后的反應產(chǎn)物的電泳檢測圖:其中1，DNA marker,2-13 的 Betaine 濃度依次為 OmM，IOmM, 20mM, 30mM, 40mM, 50mM, IOOmM, 400mM, 700mM, 1M,1.3M。
[0037]圖7為填加不同濃度的Mg2+后的反應產(chǎn)物的電泳檢測圖:其中1，DNA marker, 2-14的 Mg2+ 濃度依次為 2.0mM, 2.5mM, 3.0mM, 3.5mM, 4.0mM, 4.5mM, 5.0mM, 5.5mM, 6.0mM, 6.5mM,7.0mM, 7.5mM，8.0mM0
[0038]圖8為不同的外引物的特異性檢測圖:1，DNA marker，2_8，所釆用的LAMP模板依次為 0.2 μ L V.splendidus 1A04096，2 μ L V.splendidus 1A04096，V.splendidus1A04069，V.splendidus 1B00671，V.ν μ Lnificus 1758，V.parahaemolyticus 2164，V.fluvialis 1610。(上述細菌的編號及保存機構如表2所示。細菌經(jīng)實驗室常規(guī)培養(yǎng)，利用LAMP模板制備方法處理。其中2，3的區(qū)別在于LAMP模板的加樣量不同。)
【具體實施方式】:
[0039]實施例1
[0040]1、LAMP模板的制備
[0041]將實驗室常規(guī)培養(yǎng)的弧菌(包括3株燦爛弧菌)，待0D600達到0.6時，取1.0ml置于1.5ml EP管中，13, OOOrpm離心3min，沉淀用1.0ml無菌PBS緩沖液懸浮，13, OOOrpm再次離心，沉淀懸浮于1.5ml無菌PBS中。將制備好的菌懸液置于_20°C冰箱lOmin，使其完全凍結，隨后置于沸水浴lOmin，立即轉移至冰浴3min。室溫平衡，作為LAMP模板。
[0042]2、基因序列分析及引物設計
[0043]選擇弧菌屬細菌中普遍存在的鞭毛相關基因FlgF，通過GeneBank數(shù)據(jù)庫查找已知弧菌FlgF的基因及蛋白質序列。
[0044]利用DNAMAN軟件對獲得的9株弧菌FlgF完整DNA及蛋白質序列進行比對分析。篩選燦爛弧菌DNA序列有別于其他弧菌的區(qū)域，如圖1所示。
[0045]引物設計利用Primer premier 5.0引物設計軟件,結合LAMP引物在線設計軟件進行優(yōu)化(https://primerexplorer.jp/v4_manual/index, html)。引物設計如圖 2 所不。
[0046]其中 flgF 分另Ij % V.cholorae 0395 (ABQ19696.1),V.choloraeN16961(AE003852.1)，V.ficheri ES114(CP000020.2), V.parahaemolyticusRIMD 2210633 (BA000031.2)，V.vulnificus CMCP6(AEO16795.3)，V.vulnificusYJO 16 (BA000037.2)，V.splendidus 12B01 (ZP00990988.1)，V.splendidusATCC33789(E⑶42723.1)，V.splendidus LGP32 (FM954972.2)。
[0047]設計的LAMP弓丨物序列為:
[0048]正向外引物F3:5' -GGATCGCGCACTGTTTCT-3'
[0049]反向外引物B3:5' -TGTGCGAAATTATGACCCGG-3'
[0050]正向內(nèi)引物FIP:
[0051 ] 5'-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3'
[0052]反向內(nèi)引物BIP:
[0053]5'-AGCACAAGCACGTTCAATGCAACCGTCATGCTGAAAACACGA-3'。
[0054]3、擴增反應
[0055]反應體系的組成如 表I所示。
[0056]表I
【權利要求】
1.一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法，其特征在于，采用環(huán)介導等溫核酸擴增檢測法。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法，其特征在于， 具體的檢測步驟為， (1)LAMP模板的制備 將細菌純培養(yǎng)物依次進行離心、清洗、凍融、煮沸、冰浴和室溫平衡，得到LAMP模板； (2)基因序列分析及引物設計 針對燦爛弧菌鞭毛相關蛋白fIgF設計LAMP引物，設計的引物序列為:
正向外引物 F3:5' -GGATCGCGCACTGTTTCT-3'
反向外引物 B3:5'-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3' 正向內(nèi)引物FIP:
5'-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3'
反向內(nèi)引物BIP:
5'-AGCACAAGCACGTTCAATGCAACCGTCATGCTGAAAACACGA-3' ； (3)擴增反應 將制得的LAMP模板和LAMP引物混合進行擴增反應，25 μ L的反應液中含LAMP模板0.2-0.4 μ L，濃度為IOuM的正向外引物F30.5-1 μ L，濃度為IOuM的反向外引物Β30.5-1 μ L，濃度為20uM的正向內(nèi)引物FIP 1.5-2.5 μ L，濃度為20uM的反向內(nèi)引物BIP 1.5-2.5 μ L，濃度為IOOmM的MgSO4L 5-4 μ L，濃度為IOmM的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 1.5-3 μ L，濃度為5Μ的甜菜堿4_5 μ L，濃度為IOX的Bst DNA聚合酶緩沖液2.5 μ L，濃度為8000U/mL的Bst DNA聚合酶(大片段)0.5-1 μ L，余量為雙蒸水(ddH20)，反應液在60-65°C下反應30-60min ;然后置于80_85°C下終止反應8_10min。 (4)通過濁度觀察、離心觀察和電泳觀察對結果進行分析。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的凍融溫度為_20°C-_80°C，凍融時間為5-10min。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法，其特征在于，步驟(I)中所述的煮沸時間為8-10min。
5.根據(jù)權利要求2所述的一種快速檢測海參腐皮病主要病原菌燦爛弧菌的方法，其特征在于，步驟(3)中，反應液在65°C下反應45min。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451275SQ201210180802
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月29日 優(yōu)先權日:2012年5月29日
【發(fā)明者】焦緒棟, 秦松, 孫秀娟, 蔣婷, 李莉莉, 王義鵬 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所