一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑及制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑及制備方法和應用，該芽胞桿菌制劑由三種菌株即解淀粉芽胞桿菌D66、解淀粉芽胞桿菌J3-1和短小芽胞桿菌D31組成，都從土壤環(huán)境分離獲得。本發(fā)明通過將上述3株菌的發(fā)酵液以體積比1:1:1混合，通過草炭吸附菌體，制成微生物制劑。目前發(fā)現(xiàn)在畜禽養(yǎng)殖土壤環(huán)境中存在大量的動物病原菌，以大腸桿菌為代表的動物病原菌在土壤中可以長期存在并導致畜禽出現(xiàn)腹瀉等癥狀，本發(fā)明的微生物制劑主要應用于防治畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中動物病原菌大腸桿菌，具有效果明顯、見效快的優(yōu)勢，既可以提高畜禽類的免疫能力，又可以抑制和拮抗環(huán)境中病原菌的生長繁殖，因此有著廣闊的應用前景。
【專利說明】一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑及制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于土壤環(huán)境治理領域，具體涉及一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑，同時還涉及一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑的制備方法，還涉及一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑的用途，它們對導致雞大腸桿菌病、仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病等疾病的致病性大腸桿菌具有明顯的拮抗作用。
【背景技術】
[0002]近幾年畜禽傳染病的爆發(fā)越來越頻繁，不僅危害畜禽類的健康，造成巨大的經濟損失，而且還威脅人類的健康。其中，致病性大腸桿菌引發(fā)的大腸桿菌病是畜禽養(yǎng)殖業(yè)最常見的傳染性疾病，主要表現(xiàn)為雞大腸桿菌病、仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病等，這些病不僅發(fā)病率和死亡率高，且流行范圍廣、常年可發(fā)生。雞大腸桿菌病具有易傳染、易與其他疾病(如雞慢性呼吸道病、新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病、葡萄球菌病或球蟲病等)并發(fā)的特點。仔豬黃痢易發(fā)病于7日齡內的仔豬，感染仔豬排黃色稀糞，且發(fā)病率和死亡率高。仔豬白痢易發(fā)病于10至30日齡的仔豬，感染仔豬排白色稀糞，該病發(fā)病率高、死亡率低，嚴重影響患畜的生長發(fā)育。豬水腫病常見于斷奶前后的仔豬，其典型特征是仔豬全身水腫和神經癥狀、胃黏膜和結腸系膜水腫，該病發(fā)病率低、死亡率高(陳希文等，2007)。大腸桿菌病長期困擾著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而近年大量使用的抗生素不僅污染了環(huán)境，而且造成了致病性大腸桿菌的多重耐藥性，使得大腸桿菌病的防治更加困難。
[0003]眾所皆知，畜禽傳染病會給人類帶來巨大的經濟損失，但人們往往忽視了它們造成的環(huán)境污染。受感染畜禽的排泄物等含有高濃度的病原菌和病毒，會加速疫情的蔓延。為了控制疫情人們一般大量使用化學消毒劑進行消毒，但消毒劑給土壤和水體又帶來污染，影響了土壤的植被和微生物群落，給水體中動植物的生存也造成威脅。另外，為了防治畜禽傳染病而大量使用的抗生素給人類帶來的危害更是不可預計，它使得大量的微生物產生耐藥性，現(xiàn)在畜禽傳染病爆發(fā)的頻率越來越高與抗生素的濫用關系莫大。由于微生物制劑對大腸桿菌病有較好的防治效果，既可以提高畜禽類的免疫能力，又可以分解環(huán)境中的污染物，抑制和拮抗環(huán)境中病原菌的生長繁殖，因此有著廣闊的發(fā)展應用前景。[0004]目前微生物制劑研究的方向主要是水產養(yǎng)殖業(yè)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)、種植業(yè)和腸道微生物平衡。其中畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，主要研究的是飼用微生物制劑，利用微生物制劑替代抗生素，預防和治療畜禽類腸道疾病、提高畜禽類的免疫力、促進生長。對于微生物制劑改善豬舍和雞舍環(huán)境污染和防治環(huán)境中病原菌的相關研究較少，畜禽舍病原微生物的污染及有害氣體對動物和人的健康構成了極大的威脅。不少微生態(tài)制劑(例如EM)還具有扶植正常微生物菌群、拮抗致病菌、減少糞便中氨和硫化氫等有害氣體的排出、改善畜舍內空氣質量的作用。同時還能減少蒼蠅蚊蟲的滋生，減少疾病的傳播從而也可對環(huán)境起到保護作用。另外，某些有益微生物(如芽胞桿菌)可以減少蛋白質向刺激性較強的氨和胺的轉化，減少血液和腸道中氨的濃度，減少向外界的排泄量，從而改善飼養(yǎng)環(huán)境(劉燕和王靜惠，2002)。所以研究這一類降低環(huán)境污染的微生物制劑具有重要意義。
[0005]微生態(tài)制劑采用的菌種主要有乳酸菌、芽胞桿菌、酵母菌等。例如常用的EM微生物制劑內含有光合細菌、酵母菌、乳酸菌、放線菌以及發(fā)酵型壁狀真菌等五科10屬80種微生物。美國FDA(1989)規(guī)定允許飼喂的微生物有43種，其中乳酸菌28種(包括乳酸桿菌12種、雙歧桿菌6種、鏈球菌6種、片球菌3種、明串珠菌I種)，芽胞桿菌5種，擬桿菌4種，曲霉菌2種，酵母菌2種等。我國農業(yè)部2008年12月第1126號公告《飼料添加劑品種目錄(2008)》中規(guī)定的可以直接飼喂動物的微生物共有16種:地衣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母、沼澤紅假單胞菌、保加利亞乳桿菌。
[0006]芽胞桿菌也是微生物制劑采用的主要菌種之一。目前廣泛使用的有三類產芽胞的細菌，一是需氧芽胞桿菌，如枯草芽胞桿菌、納豆芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、東洋芽胞桿菌、凝結芽胞桿菌等；二是芽胞乳桿菌，如菊糖芽胞乳桿菌；三是厭氧梭狀芽胞桿菌，如丁酸梭菌(張璐，2008)。芽胞桿菌制成微生物制劑具有多方面的優(yōu)點。首先，芽胞桿菌具有耐酸、耐堿、耐高溫的優(yōu)點，易于保存，制成微生物制劑穩(wěn)定性好。其次，芽胞桿菌可以產生有機酸物質，有利于乳酸菌等優(yōu)勢菌群的生長繁殖，維持微生態(tài)平衡。再次，芽胞桿菌產生大量的酶類，有助于畜禽類對營養(yǎng)物質的吸收(馮亞強和薛恒平，1995)。最后，芽胞桿菌可以產生抗菌物質，抑制病原菌的生長。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是在于提供了一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑，該制劑包含兩種解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和一種短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)，將三株菌的菌液等體積混合，制得一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑。由三株芽胞桿菌制成的微生物制劑具有便于存儲、運輸和穩(wěn)定性強的特點；另外，解淀粉芽胞桿菌和短小芽胞桿菌是常用的益生菌，可以調節(jié)土壤的微生物群落結構，促進有益微生物的生長；最后，本發(fā)明的芽胞 桿菌微生物制劑可以抑制土壤中致病性大腸桿菌的生長，防治土壤中致病性大腸桿菌的污染。
[0008]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種制備芽胞桿菌制劑的方法，本發(fā)明的微生物制劑的制備方法操作簡單，便于大規(guī)模的生產。
[0009]本發(fā)明的再一個目的是提供了一種芽胞桿菌制劑在防治土壤環(huán)境的病原菌污染中的應用。該微生物制劑應用時只需將微生物制劑直接施用到土壤中混合，操作過程簡單，另外該微生物制劑應用于處理致病性大腸桿菌污染土壤具有效果顯著、見效快的特點。
[0010]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術措施:
[0011]一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑:由三種菌的菌液等體積混合而成，這三種菌均為發(fā)明人從湖北地區(qū)病原菌污染土壤中分離得到，包括一種短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus) D31 (本發(fā)明中簡稱為D31 )，一種解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) J3_l (本發(fā)明中簡稱為J3_l)和一種解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) D66 (本發(fā)明中簡稱為D66),這三種菌的分離方法是相同的。其分離過程是:[0012]A.制備雙層平板:
[0013]I)接種致病性大腸桿菌(本發(fā)明中所用到的病原菌為大腸桿菌，該菌從豬場土壤中分離，利用小鼠進行了動物回歸試驗證實其為強致病性大腸桿菌。)至PA瓶中，370C，180rpm,振蕩培養(yǎng) 12h ；
[0014]2)將大腸桿菌稀釋至10_5，取500μ I大腸桿菌稀釋液于溫度冷卻至50_60°C的250ml的LB固體培養(yǎng)基中，混合均勻；
[0015]3)向無菌平皿中倒入一層薄的含病原菌的培養(yǎng)基，靜置凝固；
[0016]4)向上一步的平板中倒入一層薄的無菌LB培養(yǎng)基，靜置凝固，即制成雙層平板。
[0017]B.稀釋涂平板篩選拮抗菌:
[0018]I)稱取IOg的土壤樣品至裝有90ml無菌水并放有玻璃珠的250ml的三角瓶中，280C，180rpm,振蕩培養(yǎng) 30min ；
[0019]2)靜置5min，用Iml移液槍吸取Iml懸液于1.5ml的空離心管中，即成KT1稀釋液；
[0020]3)再用200 μ L的移液槍吸取100 μ LKT1稀釋液于裝有900 μ L無菌水的離心管中，吹吸幾次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；
[0021]4)重復上述步 驟3的操作，吸取100 μ L10_2稀釋液，加入裝有900 μ L無菌水的離心管中，吹吸幾次，讓菌液混合均勻，即制成10_3稀釋液，以此類推，制成10_4、IO-5等一系列稀釋菌液；
[0022]5)取100 μ L的稀釋液至相應雙層平板中，再用無菌刮鏟將菌液涂抹均勻；
[0023]6)將平板置于28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0024]7)每天觀察，挑取有拮抗能力的單菌落，劃線純化保存。
[0025]C.拮抗菌抑菌效果驗證:
[0026]將純化后的單菌落重新接種至雙層平板中，將平板置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后觀察，看是否產生抑菌效果。
[0027]D.菌種保存:
[0028]將驗證后有抑菌效果的拮抗菌分別接種至含5ml LB的PA瓶中，28°C，180rpm,振蕩培養(yǎng)至對數生長期，取500 μ L的菌液于含有500 μ L 50%滅菌甘油的凍存管中，混合均勻，置于-80°C冰箱中保存。
[0029]依據上述方法，分離獲得一種短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus) D31, 申請人:于2012年4月20日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號:CCTCCN0:M2012123，保藏地址:中國武漢武漢大學，分類命名:短小芽胞桿菌D31 Bacilluspumilus D31。
[0030]同樣依據上述方法，分離獲得了一種解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) D66, 申請人:于2012年4月20日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號:CCTCC Ν0:Μ 2012124，保藏地址:中國武漢武漢大學，分類命名:解淀粉芽胞桿菌 D66 Bacillus amyloliquefaciens D66。
[0031]此外,還分離獲得了一種解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) J3-1, 申請人:于2012年4月20日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號=CCTCCN0:M2012125，保藏地址:中國武漢武漢大學，分類命名:解淀粉芽胞桿菌J3_l Bacillusamyloliquefaciens J3—1。
[0032]以下為分離獲得的三種菌株的形態(tài)學特征、培養(yǎng)條件和遺傳學特性:
[0033]I)菌落及細胞形態(tài):A.菌株D31的單菌落形狀為圓形，菌落微隆起，表面有皺褶，邊緣為嚙蝕狀，白色至淡黃色的不透明菌落。D31為革蘭氏陽性菌，細胞呈短桿狀，芽胞中生，芽胞呈橢圓狀。B.菌株D66的單菌落形狀為圓形，菌落微隆起，表面有環(huán)狀皺褶，邊緣為嚙蝕狀，白色至淡黃色的不透明菌落。D66為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，芽胞端生，芽胞呈橢圓狀。C.菌株J3-1的單菌落形狀為圓形，菌落微隆起，表面有環(huán)狀皺褶，邊緣為嚙蝕狀，白色至淡黃色的不透明菌落。J3-1為革蘭氏陽性菌，細胞呈桿狀，芽胞次端生至端生，芽胞呈柱狀。
[0034]2)培養(yǎng)條件:三株芽胞桿菌均為好氧菌，采用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母抽提物 5g，NaCl 10g, dH20 補至 IOOOmL ；pH 為 7.0-7.2)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 28°C -37°C，180rpm 振蕩培養(yǎng)。
[0035]3)遺傳學特性:經過16S rDNA基因的測序比對，鑒定D31為短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus)、 D66 和 J3-1 為解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。短小芽胞桿菌D31的16S rDNA基因的序列為SEQ ID N0.1、解淀粉芽胞桿菌D66的16S rDNA基因的序列為SEQ ID N0.2、解淀粉芽胞桿菌J3-1的16S rDNA基因的序列為SEQ ID N0.3。
[0036]一種防治土壤病原菌的芽胞桿菌制劑的制備方法，其步驟是:
[0037]本發(fā)明的微生物制劑包含D31、D66、J3-1三種芽胞桿菌。發(fā)明人將短小芽胞桿菌D31、解淀粉芽胞桿菌D66、解淀粉芽胞桿菌J3-1的菌液等體積混合，然后添加草炭充分混合，即得到用于畜禽養(yǎng)殖區(qū)致病性大腸桿菌等病原菌的污染防控的土壤微生物制劑。微生物制劑的制備方法具體如下:
[0038]A、分別挑取單菌落，將短小芽胞桿菌D31、解淀粉芽胞桿菌D66、解淀粉芽胞桿菌J3-1接種至含5ml LB液體培養(yǎng)基的PA瓶中，37°C，180rpm，振蕩培養(yǎng)12h。
[0039]B、以1%的接種量轉接至新的含250ml LB培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至90%以上形成芽胞；其中菌株解淀粉芽胞桿菌D66和解淀粉芽胞桿菌J3-1培養(yǎng)時間為72h，菌株短小芽胞桿菌D31培養(yǎng)時間為120h，此時菌種90%以上形成芽胞，耐受各種環(huán)境的能力較強。
[0040]C、將短小芽胞桿菌(Bacillus pumilus) D31、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) D66、解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) J3-1 的發(fā)酵液以體積比1:1:1混合。
[0041]D、再將混合菌液通過8000rpm離心5min，去部分上清，將體積濃縮至原有體積的
三分之一。
[0042]E、以4:1 (體積:質量)比例加入滅菌草炭，混合均勻，28°C放置48h，即制成微生物制劑。
[0043]所述的草炭又名泥炭，亦叫作泥煤，是沼澤發(fā)育過程中的產物，形成于第四紀，由沼澤植物的殘體，在多水的嫌氣條件下，不能完全分解堆積而成。含有大量水分和未被徹底分解的植物殘體、腐殖質以及一部分礦物質。有機質含量在30%以上(國外認為應超過50%)，質地松軟易于散碎，比重0.7-1.05，多呈棕色或黑色，具有可燃性和吸氣性，pH值一般為5.5-6.5，呈微酸性反應，呈層狀分布，稱為泥炭層。是沼澤發(fā)展速度和發(fā)育程度的重要標志。是一種寶貴的自然資源。草炭是煤化程度最低的煤(為煤最原始的狀態(tài))，乃有機物質。
[0044]一種防治土壤病原菌的芽胞桿菌制劑在防治土壤環(huán)境的病原菌污染中的應用，其應用過程是:
[0045]A、實驗組:將上述120mL混合菌液制得的微生物制劑與500g的病原菌污染土壤混
合，置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0046]B、對照組:用相同體積的無菌水替代上述混合菌液，并用相同的方法制成水和草炭的混合物(陰性對照)，與500g的病原菌污染土壤混合，置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0047]C、實驗組和對照組處理過程相同，分別于處理O、1、2、3、5、7、10天后取樣，用麥康凱選擇性平板計數土壤中存活的大腸桿菌數量。
[0048]D、實驗結果如圖2所示，本實驗生防菌劑投放到實驗室模擬的大腸桿菌污染土壤后，第I天殺菌率可達50%，7天后可達85%以上，這表明本發(fā)明所研制的微生物菌劑具有殺菌速度快、殺菌效果顯著的特點，能夠快速有效地治理病原菌污染土壤。
[0049]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果:
[0050](I)目前畜禽養(yǎng)殖業(yè)用的微生物制劑主要是飼用微生物制劑，而用于防治、改善土壤環(huán)境病原菌污染的微生物制劑很少，而本發(fā)明的微生物制劑就是針對土壤環(huán)境病原菌污染的治理而發(fā)明的微生物制劑；
[0051 ] ( 2 )本發(fā)明的微生物制劑相比化學消毒劑和抗生素來說，具有無污染、不產生微生物耐藥性的優(yōu)勢；
[0052](3)芽胞桿菌作為微生物制劑具有便于存儲、運輸和穩(wěn)定性強的特點。解淀粉芽胞桿菌和短小芽胞桿菌是常用的益生菌，對動物無毒無害，且可以調節(jié)土壤的微生物群落結構，促進有益微生物的生長；
[0053](4)本發(fā)明的芽胞桿菌微生物制劑可以防治土壤中致病性大腸桿菌的污染，具有效果顯著、見效快的特點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1為一種微生物制劑的液體拮抗實驗結果示意圖。
[0055]圖中顯示在液體實驗條件下，實驗組相對于對照組的大腸桿菌存活率。
[0056]圖2為一種微生物制劑在實驗室條件下應用于治理致病性大腸桿菌污染土壤的效果示意圖。圖中顯示為實驗組相對于對照組的大腸桿菌存活率。
【具體實施方式】
[0057]本發(fā)明具體實例中所用到的病原菌為大腸桿菌，該菌從豬場土壤中分離得到，利用小鼠進行了動物回歸試驗證實其為強致病性大腸桿菌。發(fā)明人通過實驗室條件下的平板拮抗實驗、液體拮抗實驗證實本發(fā)明的微生物制劑具有明顯抑制和拮抗致病性大腸桿菌的能力；而微生物制劑應用于致病性大腸桿菌污染土壤的實驗則表明:本發(fā)明的微生物制劑具有效果顯著、見效快的特點。
[0058]實施例1:
[0059]一種防治土壤環(huán)境病原菌的芽胞桿菌制劑:由三種菌的菌液等體積混合而成，這三種菌均為發(fā)明人從湖北地區(qū)病原菌污染土壤中分離得到。三種菌分別為一種短小芽胞桿菌D31 (本發(fā)明中簡稱為D31)，一種解淀粉芽胞桿菌J3-1 (本發(fā)明中簡稱為J3-1)和一種解淀粉芽胞桿菌D66 (本發(fā)明中簡稱為D66)，它們的分離方法是相同的。其分離過程是:
[0060]A.制備雙層平板:
[0061]I)接種大腸桿菌(本發(fā)明中所用到的病原菌為大腸桿菌，該菌從豬場土壤中分離，利用小鼠進行了動物回歸試驗證實其為強致病性大腸桿菌。)至PA瓶中，37°C，180rpm,振蕩培養(yǎng)12h ；
[0062]2)將大腸桿菌稀釋至10_5，取500 μ I大腸桿菌稀釋液于溫度冷卻至50_60°C的250ml的LB固體培養(yǎng)基中，混合均勻；
[0063]3)向無菌平皿中倒入一層薄的含病原菌的培養(yǎng)基，靜置凝固
[0064]4)向上述步驟3的平板中倒入一層薄的無菌LB培養(yǎng)基，靜置凝固，即制成雙層平板。
[0065]B.稀釋涂平板篩選拮抗菌:
[0066]I)稱取IOg的土壤樣品至裝有90ml無菌水并放有玻璃珠的250ml的三角瓶中，280C，180rpm,振蕩培養(yǎng) 30min ；
[0067]2)靜置5min，用Iml移液槍吸取Iml懸液于1.5ml的空離心管中，即成KT1稀釋液；
[0068]3)再用200 μ L 的移液槍吸取100 μ LKT1稀釋液于裝有900 μ L無菌水的離心管中，吹吸幾次，讓菌液混合均勻，即成10_2稀釋液；
[0069]4)吸取100 μ LlO-2稀釋液重復上述步驟3，以此類推，制成10_4、10_5等一系列稀釋菌液；
[0070]5)取100 μ L的稀釋液至相應雙層平板中，再用無菌刮鏟將菌液涂抹均勻；
[0071]6)將平板置于28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0072]7)每天觀察，挑取有拮抗能力的單菌落，劃線純化保存。
[0073]C.拮抗菌抑菌效果驗證:
[0074]將純化后的單菌落重新接種至雙層平板中，將平板置于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后觀察，看是否產生抑菌效果。
[0075]D.菌種保存:
[0076]將驗證后有抑菌效果的拮抗菌分別接種至含5ml LB的PA瓶中，28°C，180rpm,振蕩培養(yǎng)至對數生長期，取500 μ L的菌液于含有500 μ L 50%滅菌甘油的凍存管中，混合均勻，置于-80°C冰箱中保存。
[0077]由此分離獲得了一種短小芽胞桿菌D31 Bacillus pumilus D31, 申請人:于2012年4月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為:CCTCC N0:M2012123。
[0078]由此還分離獲得了一種解淀粉芽胞桿菌D66 Bacillus amyloliquefaciens D66, 申請人:于2012年4月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為:CCTCC NO:M 2012124。
[0079]依據同樣方法還分離獲得了一種解淀粉芽胞桿菌J3-1 Bacillusamyloliquefaciens J3_l, 申請人:于2012年4月20日送交湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號為:CCTCC N0:M2012125o
[0080]實施例2:
[0081]一種防治土壤病原菌的芽胞桿菌制劑的制備方法，其步驟是:
[0082]本發(fā)明的微生物制劑包含D31、D66、J3_1三種芽胞桿菌。發(fā)明人將D31、D66、J3-1的菌液等體積混合，然后添加草炭充分混合，即得到用于畜禽養(yǎng)殖區(qū)致病性大腸桿菌等病原菌的污染防控的土壤微生物制劑。微生物制劑的制備方法具體如下:
[0083]A、分別挑取單菌落，將D66、D31和J3-1接種至含5ml LB液體培養(yǎng)基的PA瓶中，37°C，180rpm，振蕩培養(yǎng) 12h ；
[0084]B、以1%的接種量轉接至新的含250ml LB培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)至90%以上形成芽胞；其中菌株D66和J3-1培養(yǎng)時間為72h，菌株D31培養(yǎng)時間為120h，此時菌種90% 以上形成芽胞，耐受各種環(huán)境的能力較強。
[0085]C、將上述的培養(yǎng)產物以體積比1:1:1混合。
[0086]D、再將混合菌液通過8000rpm離心5min，去部分上清，將體積濃縮至原有體積的
三分之一。
[0087]E、以濃縮混合菌液:滅菌草炭為4:1 (v/m)的比例加入滅菌草炭，混合均勻，28°C放置48h，即制成微生物制劑。
[0088]實施例3:
[0089]平板抑菌圈實驗
[0090]I實驗方法
[0091]I)挑取單菌落，將拮抗菌D31、D66、J3-1分別接種至含5ml LB的PA瓶中，28 0C，180rpm,振蕩培養(yǎng) 48h ；
[0092]2)向平板中加入5ml的LB固體培養(yǎng)基，待凝固后放置牛津杯；
[0093]3)再向平板中加入5ml的LB固體培養(yǎng)基以固定牛津杯；
[0094]4)待凝固后，向牛津杯中加入200 μ I的拮抗菌菌液，28°C靜置培養(yǎng)48h ；
[0095]5)將大腸桿菌接種至含5ml LB液體培養(yǎng)基的PA瓶中，37°C，180rpm，振蕩培養(yǎng)12h ；
[0096]6)取50 μ I大腸桿菌培養(yǎng)物于溫度冷卻至50_60°C的250ml的LB軟瓊脂固體培養(yǎng)基(瓊脂含量為0.5% (瓊脂質量占培養(yǎng)基體積的百分比)中，混合均勻；
[0097]7)向步驟4的平板加入混有大腸桿菌的LB軟瓊脂固體培養(yǎng)基4ml，28°C靜止培養(yǎng)3d，測定抑菌圈。
[0098]8)計算抑菌率，抑菌率為D/d，D為抑菌圈直徑，d為拮抗菌菌落直徑(即牛津杯直徑)。
[0099]2實驗結果
[0100]本發(fā)明實例中微生物制劑所含拮抗菌在固體平板上對致病性大腸桿菌抑菌圈實驗的結果如表I所示。表I顯示為拮抗菌的抑菌率及其標準差，抑菌率為D/d，D為抑菌圈直徑，d為拮抗菌菌落直徑(即牛津杯直徑)。D66、D31和J3-1的抑菌率平均值分別為2.07、
3.72 和 3.28。
[0101]表I拮抗菌抑菌率
【權利要求】
1.一種短小芽胞桿菌，其特征在于:短小芽胞桿菌(ifeci77i/5.pumilus ) D31, CCTCCNO: M2012123。
2.一種解淀粉芽胞桿菌，其特征在于:解淀粉芽胞桿mBacillusamyloliquefaciens )D66, CCTCC NO: M2012124。
3.一種解淀粉芽胞桿菌，其特征在于:解淀粉芽胞桿菌(MciIlusamyloliquefaciens) J3-1, CCTCC NO: M2012125。
4.權利要求1至3所述的一種芽胞桿菌制劑的制備方法，其步驟是: 分別挑取單菌落，將短小芽胞桿菌D31、解淀粉芽胞桿菌D66、解淀粉芽胞桿菌J3-1接種至含5 ml LB液體培養(yǎng)基的PA瓶中，37°C，180 rpm，振蕩培養(yǎng)12 h ； 以1%的接種量轉接至新的含250 ml LB培養(yǎng)液的500 ml三角瓶中，37°C，180 rpm振蕩培養(yǎng)形成芽胞，其中菌株解淀粉芽胞桿菌D66和解淀粉芽胞桿菌J3-1培養(yǎng)時間為72 h，菌株短小芽胞桿菌D31培養(yǎng)時間為120 h，此時菌種90%形成芽胞； 將短小芽胞桿菌D31、解淀粉芽胞桿菌D66、解淀粉芽胞桿菌J3-1的發(fā)酵液以體積比1:1:1混合； 再將混合菌液通過8000rpm離心5min，去上清，將體積濃縮至原有體積的三分之一； 以4:1體積:質量比例加入 滅菌草炭，混合均勻，28°C放置48 h，制成微生物制劑。
5.權利要求4所述的一種芽胞桿菌制劑在防治土壤環(huán)境病原菌污染中的應用。
【文檔編號】C12N11/14GK103451117SQ201210180761
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權日:2012年6月4日
【發(fā)明者】黃巧云, 陳雯莉, 姚佳瑜 申請人:華中農業(yè)大學