一種嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的聯(lián)合檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病原菌的檢測技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的 聯(lián)合檢測方法，具體為嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的雙標(biāo)記時(shí)間分辨巧光免疫檢測方 法。
【背景技術(shù)】
[000引 嗜水氣單胞菌（Aeromonashy化ophila)是一種典型的人-獸-魚共患病病原菌， 可引起多種水產(chǎn)動物的敗血癥和人類腹瀉（沈錦玉.嗜水氣單胞菌的研究進(jìn)展，浙江海洋 學(xué)院學(xué)報(bào).2008, 27:78-86)。產(chǎn)酸克雷伯氏菌化lebsiellaox^oca)是一種條件致病菌， 可引起腹瀉及食物中毒（于蘭，等.一起產(chǎn)酸克雷伯氏菌引起食物中毒的調(diào)查，解放軍預(yù) 防醫(yī)學(xué)雜志，2003, 21:69)，此外會引起媛綱皮膚點(diǎn)狀出血。由于在病理檢驗(yàn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng) 域均可檢測到該兩種病原菌，因此開展嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的同時(shí)檢測對疾病 防治具有重要意義。
[0003] 傳統(tǒng)檢測病原菌的方法是酶聯(lián)免疫吸附法巧LISA)和巧光抗體法，該些方法具有 特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但靈敏度不高，同時(shí)測量光譜范圍寬，雙標(biāo)記免疫檢測會互相干擾，不適 于兩種菌的測量。時(shí)間分辨巧光免疫檢測（TRFIA)巧光發(fā)射光譜窄，雙標(biāo)記法測量兩種病 原菌光譜互不重疊，此外采用長壽命的稀±馨合物標(biāo)記，通過時(shí)間延遲消除背景干擾，靈敏 度大為提高。但TRFIA在病原菌檢測中應(yīng)用不多（盧潔，等.時(shí)間分辨巧光免疫法檢測日 本島曼綱產(chǎn)酸克雷伯氏菌，分析化學(xué)，2012, 40:1709-1714)，雙標(biāo)記同時(shí)測定兩種病原菌更 是未見報(bào)道。本方法采用TRFIA檢測嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌，兩種病原菌的檢測 靈敏度均得到了提高，由于是同時(shí)檢測，簡化了步驟，節(jié)省了時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的雙標(biāo)記時(shí)間分辨 巧光免疫檢測方法。
[0005] 本發(fā)明具體通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 一種嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的聯(lián)合檢測方法，具體通過W下步驟完成：
[0007] 1)用碳酸鹽包被液分別稀釋抗嗜水氣單胞菌抗體IgGl和抗產(chǎn)酸克雷伯氏菌抗體 IgG2,加入96孔微孔板，洗漆；
[000引 2)每孔加入200yL的1 %BSA，37°C封閉2h，洗漆；
[0009] 3)每孔加入用分析緩沖液稀釋的嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌混合菌懸液，陰 性對照孔W分析緩沖液代替，37°C振蕩解育比，洗漆；
[0010] 4)將工作濃度的Sm3+-IgGl和Eu3+-IgG2等體積混合，每孔加入100yL，25°C振蕩 解育90min，洗漆；
[0011] W每孔加入200yL增強(qiáng)液，室溫振蕩15min;
[0012] 6)多標(biāo)記分析儀上測量時(shí)間分辨巧光TRF，測量參數(shù)設(shè)置為延遲時(shí)間0. 4ms，測量 時(shí)間0. 4ms，嗜水氣單胞菌檢測固定激發(fā)波長340nm，發(fā)射波長642nm，產(chǎn)酸克雷伯氏菌檢測 固定激發(fā)波長340皿，發(fā)射波長615皿。
[001引 7)W樣品孔的TRF值（巧與對照孔的TRF值㈱之比大于2 (即P/N〉。時(shí)判斷為 陽性。
[0014] 步驟（1)具體為碳酸鹽包被液稀釋兩種抗體，等濃度等體積混合，每孔100y以 4°C包被 12h。
[0015] 本發(fā)明檢測方法中兩種包被抗體的濃度均為1 y g/mL。
[0016] 本發(fā)明所述的Sm3+-IgGl的稀釋度為1:600,化3+-IgG2的稀釋度為1:1280。
[0017] 本發(fā)明所述的碳酸鹽包被液通過W下組分制備；Na2C〇3l.49g，NaHOy. 93g， NaNgO. 2g，去離子&0定容至IL。
[0018] 本發(fā)明所述的分析緩沖液通過W下組分制備；Tris-base6. 057g，Tween-201血， BSA2g，DTPA0. 0196g，化Cl9g，NaN3〇. 5g，去離子&0定容至800血，濃鹽酸調(diào)抑值到7. 8， 去離子&0定容至1L。
[0019] 本發(fā)明所述的洗漆采用的洗漆緩沖液通過W下組分制備；Tris-base6.057g， Tween-202血，化Cl9g，NaNgO. 5g，去離子&0定容至800血，濃鹽酸調(diào)抑值到7. 8,去離子 &0定容至1L。
[0020] 本發(fā)明所述的增強(qiáng)液通過W下組分制備；TritonX-lOOlmL，0-NTA3. 99mg，T0P0 19. 33mg，鄰苯二甲酸氨鐘1.3g，冰醋酸6血，去離子&0定容至IL。
[0021] 本發(fā)明的有益效果為：
[0022] 1)采用雙標(biāo)記TRFIA法同時(shí)檢測嗜水氣單胞菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌國內(nèi)外均未見 報(bào)道。
[002引。與分別檢測兩種病原菌相比，該方法大大縮短了分析檢測時(shí)間，降低了檢測成 本。
[0024] 3)檢測嗜水氣單胞菌的靈敏度為6.0 X104c化/mU產(chǎn)酸克雷伯氏菌的靈敏度為 1. 0X 104cfu/mL，高于ELISA法與巧光抗體法。
[0025] 4)通過時(shí)間分辨巧光TRF與菌濃度的工作曲線，可W看出該法線性范圍寬，不僅 能夠進(jìn)行定性檢測，還可進(jìn)行定量檢測。
【附圖說明】
[0026]圖1是Snf-IgGl的濃度對檢測信號的影響；橫坐標(biāo)是嗜水氣單胞菌濃度的對數(shù)， 縱坐標(biāo)是時(shí)間分辨巧光TRF的對數(shù)；
[0027]圖2是化3+-IgG2的濃度對檢測信號的影響；橫坐標(biāo)是產(chǎn)酸克雷伯氏菌濃度的對 數(shù)，縱坐標(biāo)是時(shí)間分辨巧光TRF的對數(shù)；
[002引圖3是雙標(biāo)記TRFIA法測定兩種菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線；橫坐標(biāo)是菌濃度的對數(shù)，縱坐標(biāo)是 時(shí)間分辨巧光TRF的對數(shù)；
[0029] 圖4是雙標(biāo)記TRFIA法檢測嗜水氣單胞菌；縱坐標(biāo)是P/N，橫坐標(biāo)代表6條媛綱的 5種組織；
[0030] 圖5是化ISA法檢測嗜水氣單胞菌；縱坐標(biāo)是P/N，橫坐標(biāo)代表6條媛綱的5種組 織；
[0031] 圖6是雙標(biāo)記TRFIA法檢測產(chǎn)酸克雷伯氏菌；縱坐標(biāo)是P/N，橫坐標(biāo)代表6條媛綱 的5種組織；
[0032] 圖7是化ISA法檢測產(chǎn)酸克雷伯氏菌；縱坐標(biāo)是P/N，橫坐標(biāo)代表6條媛綱的5種 組織。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，W下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加W變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對W下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0034] 實(shí)驗(yàn)材料；
[0035] 96孔白色微孔板購自廈口怡佳美公司；SPA親和層析柱、S巧hadexG-50購自GE Healthcare公司；牛血清白蛋白炬SA)、|3-NTA、TOPO,購自Sigma公司；Eu3+標(biāo)記試劑盒 (1244-302)、Sm3+標(biāo)記試劑盒（1244-303)購自Perkins-Elmer公司；其它相關(guān)試劑均為國 產(chǎn)分析純。
[0036] 產(chǎn)酸克雷伯氏菌菌株分離于皮膚點(diǎn)狀出血的日本媛綱，并經(jīng)Biolog自動生化鑒 定系統(tǒng)佑enelll)鑒定，已于2011年7月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中屯、，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所， 分類命名是1^166316113〇義八〇〇3，保藏中屯、登記入冊編號為〔6版^齡.5060;嗜水氣單胞菌 菌株可于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院得到；媛綱購自集美大學(xué)水產(chǎn)試驗(yàn)場。交叉實(shí)驗(yàn)所 用菌株均來自西班牙普通微生保藏中屯、（CECT)。
[0037] 實(shí)驗(yàn)試劑：
[003引碳酸鹽包被液通過W下組分制備；NasCOsl.49g，NaHC032. 93g，NaN30. 2g，去離子&0 定容至IL。
[0039] 分析緩沖液通過W下組分制備；Tris-base6. 057g，Tween-201mLBSA2g，DTPA 0. 0196g，化Cl9g，NaNjO. 5g，去離子&0定容至800血，濃鹽酸調(diào)抑值到7. 8,去離子&0定 容至1L。
[0040] 洗漆緩沖液通過W下組分制備；Tris-base6. 057g，Tween-202mL化〔1 9g， NaNsO. 5g，去離子&0定容至800血，濃鹽酸調(diào)抑值到7. 8,去離子&0定容至IL。
[00川 增強(qiáng)液通過W下組分制備；TritonX-lOOlmL，0-NTA3. 99mg，T0P0 19