專利名稱：一株組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)的表達(dá)領(lǐng)域，尤其涉及組成型表達(dá)酶的工程菌株的構(gòu)建，同時(shí)本發(fā)明也屬于生物技術(shù)生產(chǎn)氨基酸的技術(shù)領(lǐng)域，涉及通過組成型表達(dá)的酶來制備L-鳥氨酸及D-精氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-鳥氨酸學(xué)名為a, S-二氨基戊酸，不參與人體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，但具備極其重要的生理功能。L-鳥氨酸存在于生物體多種組織和細(xì)胞中，在生物體代謝中起到重要作用，是尿素生成的中間產(chǎn)物，參與產(chǎn)尿素的鳥氨酸循環(huán)，也是精氨酸、瓜氨酸等多種氨基酸代謝的前體物質(zhì)，具有解毒作用，對人體肝臟細(xì)胞具有重大意義。
D-精氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，天然原料人工合成，研究表明D-精氨酸具有抗高血壓的功效；D-精氨酸的重要生理功能還表現(xiàn)在可抑制癌癥擴(kuò)散，以及治療生長激素過多釋放造成的紊亂等方面。L-鳥氨酸的制備方法包括化學(xué)合成法、直接發(fā)酵法和水解精氨酸法等幾種方法。水解精氨酸法包括堿水解法和酶水解法，其中，酶水解法具有很強(qiáng)的專一性，其反應(yīng)過程簡單，副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和，并且避免使用氰化氫等有毒化學(xué)品，底物轉(zhuǎn)化率高，生成的L-鳥氨酸純度高，利于后續(xù)分離，因此利用精氨酸作為底物，在精氨酸酶的催化下生成L-鳥氨酸的酶水解方法受到廣泛的重視，是目前國內(nèi)廠家生產(chǎn)L-鳥氨酸的常用方法。Makryaleas等人研究了精氨酸酶水解精氨酸制備L-鳥氨酸的方法，在pH 8. 0
10.0時(shí)轉(zhuǎn)化率可高達(dá)99%。2005年，焦慶才等對L-精氨酸酶固定化生產(chǎn)L-鳥氨酸進(jìn)行了研究，L-精氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%，并且采用該種固定化酶法相對于傳統(tǒng)酶法水解，在產(chǎn)物與催化劑的分離和工業(yè)化生產(chǎn)的連續(xù)控制等方面具有明顯的優(yōu)勢。張鵬等利用糞腸球菌產(chǎn)生的精氨酸酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-鳥氨酸，產(chǎn)量可高達(dá)112g/L，轉(zhuǎn)化率高達(dá)99. 5%。目前，D-精氨酸的制備方法主要為酶法制備，即以L-精氨酸為原料，經(jīng)消旋反應(yīng)得到DL-精氨酸。李加友和曹瑜等利用糞鏈球菌的精氨酸脫亞胺酶對L-精氨酸的專一脫亞胺作用來生產(chǎn)D-精氨酸，D-精氨酸的產(chǎn)率為87%，附加產(chǎn)物L(fēng)-瓜氨酸的產(chǎn)率為88%?，F(xiàn)有的生物酶法轉(zhuǎn)化盡管可達(dá)到一定高的轉(zhuǎn)化率，但精氨酸酶在制備的過程中大多是需要加入誘導(dǎo)劑，成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一株組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌株，使得在精氨酸酶發(fā)酵生產(chǎn)中無需加入誘導(dǎo)劑，以縮短發(fā)酵周期，降低誘導(dǎo)物、能耗等成本；同時(shí)，組成型表達(dá)相對于誘導(dǎo)表達(dá)更穩(wěn)定，克服了誘導(dǎo)表達(dá)過程中菌株易退化、質(zhì)粒易丟失的缺陷，為酶法拆分DL-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸及D-精氨酸和轉(zhuǎn)化L-精氨酸生產(chǎn)L-鳥氨酸提供了綠色環(huán)保高效的生產(chǎn)方法。本發(fā)明提供的組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌株，是在本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的能夠誘導(dǎo)表達(dá)精氨酸酶的重組表達(dá)載體pET21a(+) -ARG基礎(chǔ)上，通過自殺質(zhì)粒pRE112，構(gòu)建重組載體PRE112-ARG，將其轉(zhuǎn)化至不能表達(dá)Ji蛋白的宿主細(xì)胞E. coli DH5 a，并通過氯霉素(Cm)抗性篩選，獲得的組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌株E. coli DH5a-ARG。隨后對組成型表達(dá)的精氨酸酶的酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了初步研究，為酶法制備L-鳥氨酸和D-精氨酸的生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)。 所述的自殺質(zhì)粒pREl 12與宿主細(xì)胞染色體發(fā)生重組，使精氨酸酶I基因可組成型表達(dá)。所述的自殺質(zhì)粒PRE112的復(fù)制及轉(zhuǎn)化載體的制備和篩選在E. coli S17XpirA宿主細(xì)胞進(jìn)行。本發(fā)明提供的構(gòu)建組成型表達(dá)精氨酸酶工程菌的方法，具體包括(I)將精氨酸酶I基因插入到自殺質(zhì)粒PRE112的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒PRE112-ARG;
(2)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌E. coli S17ApirA，篩選陽性克隆并鑒定；(3)將篩選的陽性菌株培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 a，于Cm/LB平板培養(yǎng)，篩選陽性克?。?4)菌落PCR鑒定后進(jìn)行酶活測定，篩選高精氨酸酶活性的菌株，即E.coliDH5 a -ARG。該菌株與實(shí)驗(yàn)室保存的誘導(dǎo)型表達(dá)的菌株相比，酶活力沒有顯著性差異。本發(fā)明同時(shí)涉及組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌E.coli DH5 a-ARG在L-鳥氨酸和D-精氨酸制備中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用是以組成型表達(dá)精氨酸酶的E.coli DH5 a-ARG菌體作為酶源，以L-精氨酸為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，經(jīng)基因工程菌組成型表達(dá)的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制備L-鳥氨酸；或者以底物DL-精氨酸出發(fā)，經(jīng)基因工程菌組成型表達(dá)的精氨酸酶直接水解L-精氨酸，制備L-鳥氨酸，同時(shí)保留D-精氨酸。酶促反應(yīng)條件如下，酶源細(xì)胞催化條件為f5g/L，轉(zhuǎn)化溫度為2(T80°C;轉(zhuǎn)化pH值為6 11 ;Mn2+濃度為0. lmT2mM。最佳的催化反應(yīng)條件為優(yōu)選溫度為60°C ;優(yōu)選轉(zhuǎn)化pH值為9. 0 ;優(yōu)選Mn2+濃度為0. 5mM, 2g/L酶源細(xì)胞催化，當(dāng)?shù)孜風(fēng)-精氨酸濃度為100g/L時(shí)，反應(yīng)12h，底物L(fēng)-精氨酸的轉(zhuǎn)化率為98. 17%。所述用于組成型表達(dá)的精氨酸酶來自以上構(gòu)建的基因工程菌株E.coliDH5 a-ARG的菌體細(xì)胞，由于精氨酸酶I基因已經(jīng)重組進(jìn)E.coli DH5 a的基因組中，隨著細(xì)菌基因組的復(fù)制而復(fù)制進(jìn)行表達(dá)，該基因成為基因組的一部分，使得精氨酸酶基因的表達(dá)無需誘導(dǎo)，表達(dá)更穩(wěn)定。該重組菌株具備表達(dá)精氨酸酶的能力，并能進(jìn)行L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L-鳥氨酸的反應(yīng)，及以DL-精氨酸為底物拆分制備D-精氨酸和L-鳥氨酸。在本發(fā)明實(shí)施例中，采用柱前衍生化HPLC法來測定DL-精氨酸及L-鳥氨酸，衍生化試劑為Marfey試劑，即I-氟-2, 4_ 二硝基苯基-5-L-丙氨酸胺(FDAA)。柱前衍生化方法如下以IOOiiL IOmmoI/L Na2CO3溶液(pH 9)溶解氨基酸，使其終濃度為l(T40mmOl/L，隨后加入到1%的FDAA 200ilL丙酮溶液中，4(rC孵育lh后，加入2N HCl 20yL終止反應(yīng)，20 u L 進(jìn)樣分析。色譜柱C18 色譜柱(Phenomenex Luna 5 u , 100A, 250 X 4. 6mm);進(jìn)樣體積20 ii L。流動相冰(含0. 1%TFA):乙腈(含0. 1%TFA) =45 :55為流動相；室溫；流速為 1mT ,/min ;檢測波長 340nm。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果
本發(fā)明構(gòu)建了組成型表達(dá)精氨酸酶I的基因工程菌株DH5 a -ARG,以L-精氨酸或DL-精氨酸為底物，表達(dá)精氨酸酶I的菌體細(xì)胞為起始酶源，酶法制備L-鳥氨酸或D-精氨酸。由于采用組成型表達(dá)的酶源細(xì)胞，在制備的過程中無需加入誘導(dǎo)劑，方便易行，且有效降低成本，并縮短了發(fā)酵周期。同時(shí)，酶的組成型表達(dá)相對于誘導(dǎo)表達(dá)更穩(wěn)定，克服了誘導(dǎo)表達(dá)過程中菌株易退化，質(zhì)粒易丟失的缺陷，因此本發(fā)明在L-鳥氨酸和D-精氨酸的綠色工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。


圖I是獲得的15株組成型表達(dá)精氨酸酶活性的Ε. coli DH5 a -ARG的酶活分析；圖2是氨基酸的HPLC檢測；圖3是催化條件的優(yōu)化，A :反應(yīng)溫度與L-精氨酸轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；B ρΗ與L-精氨酸轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；C =Mn2+與L-精氨酸轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；圖4產(chǎn)物L(fēng)-鳥氨酸HPLC檢測結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I精氨酸酶基因的克隆及組成型表達(dá)取KM小鼠肝臟，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)Genbank提供序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增ArgI基因，回收后連接至pRE112載體，構(gòu)建pRE112_ARG載體，常規(guī)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入E. coli S17 ApirA中篩選、鑒定、測序后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 α，于Cm/LB平板培養(yǎng)，篩選并鑒定陽性克隆，最終獲得組成型表達(dá)精氨酸酶的E. coli DH5 a -ARG。將獲得的基因工程菌株于Cm/LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，收集菌體細(xì)胞，用于L-精氨酸轉(zhuǎn)化，確認(rèn)是否具備精氨酸酶活性。催化體系為底物L(fēng)-精氨酸用量為5g/L ；Mn2+濃度為ImM ;轉(zhuǎn)化pH值為8 ;轉(zhuǎn)化時(shí)間為lh，轉(zhuǎn)化溫度為37°C。酶活力定義在上述條件下，Ih內(nèi)轉(zhuǎn)化I μ mol精氨酸的酶量為一個酶活力單位。篩選獲得的15個菌株中，分別測定其酶活力，如圖I所示，最高可達(dá)873U/g。實(shí)施例2反應(yīng)液中L-鳥氨酸及DL-精氨酸的高效液相色譜法檢測以IOOyL IOmmoI/L Na2CO3溶液(pH 9)溶解DL-精氨酸及L-鳥氨酸，使其終濃度為l(T40mmOl/L，隨后加入到1%的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育Ih后，加入2N HCl 20 μ L終止反應(yīng)，20 μ L進(jìn)樣分析。色譜柱C18色譜柱(Phenomenex Luna5μ，100Α, 250X4. 6mm);進(jìn)樣體積20μ L0流動相水乙腈(含O. 1%TFA)=1 1為流動相；室溫；流速為lmL/min ;檢測波長340nm，檢測結(jié)果如圖2所示，L-鳥氨酸、D-精氨酸、L-精氨酸和FDAA均可有效分離。實(shí)施例3組成型表達(dá)的精氨酸酶反應(yīng)條件優(yōu)化以上述實(shí)施例I組成型表達(dá)精氨酸酶的E. coli DH5 a -ARG的菌懸液為酶源(2g/L)，反應(yīng)體系中Mn2+濃度為O. lmT2mM ;轉(zhuǎn)化溫度為2(T80°C ;轉(zhuǎn)化pH值為6 11 ;考察不同的轉(zhuǎn)化條件對L-精氨酸轉(zhuǎn)化率的影響。在最適反應(yīng)條件下，測定底物L(fēng)-精氨酸的濃度由10g/L到100g/L，反應(yīng)達(dá)到90%以上的時(shí)間。并采用實(shí)施例2中的方法檢測L-鳥氨酸的含量，計(jì)算L-精氨酸的轉(zhuǎn)化率。圖3A :考察反應(yīng)溫度與L-精氨酸轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；底物L(fēng)-精氨酸用量為20g/L ；Mn2+為ImM ;轉(zhuǎn)化pH值為8 ;轉(zhuǎn)化時(shí)間為3h。圖3B :考察pH與L-精氨酸轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；底物L(fēng)-精氨酸用量為20g/L ；Mn2+為ImM ;轉(zhuǎn)化時(shí)間為3h ;轉(zhuǎn)化溫度為60°C。圖3C :考察Mn2+與L-精氨酸轉(zhuǎn)化率的關(guān)系；底物L(fēng)-精氨酸用量為10g/L ;轉(zhuǎn)化溫度為60°C ;轉(zhuǎn)化pH值為9. O ;轉(zhuǎn)化時(shí)間為3h。確認(rèn)最佳轉(zhuǎn)化條件反應(yīng)溫度，60°C ；pH 9 ；Mn2+濃度，O. 5mM。 在最適酶促反應(yīng)條件下，當(dāng)?shù)孜風(fēng)-精氨酸濃度為100g/L時(shí)，反應(yīng)12h底物L(fēng)-精氨酸的轉(zhuǎn)化率為98. 17%。實(shí)施例4L-鳥氨酸的制備及分離以實(shí)施例3確定的最佳條件，以組成型表達(dá)的酶源細(xì)胞為酶源酶法制備L-鳥氨酸，隨后過濾，收集上清液，采用重結(jié)晶方法制備L-鳥氨酸，IOOmL體系中加入0. 2g酶源細(xì)胞，IOg L-精氨酸，可制備L-鳥氨酸白色粉末7. 48g，采用HPLC檢測，產(chǎn)物純度達(dá)到98. 9%(圖 4)。實(shí)施例5DL-精氨酸的拆分以實(shí)施例3確定的最佳條件，以組成型表達(dá)的酶源細(xì)胞為酶源酶法拆分DL-精氨酸，隨后過濾，收集上清液，采用大孔吸附樹脂001 X 7層析分離，制備L-鳥氨酸和D-精氨酸，IOOmL體系中加入0. 2g酶源細(xì)胞，20g DL-精氨酸，可制備L-鳥氨酸白色粉末7. 44g，D-精氨酸9. 71g，采用HPLC檢測，產(chǎn)物純度均達(dá)到98. 1%以上。
權(quán)利要求
1.一株組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌株，其特征在于該菌株是在能夠誘導(dǎo)表達(dá)精氨酸酶的重組表達(dá)載體pET21a(+)-ARG基礎(chǔ)上，通過自殺質(zhì)粒pRE112，構(gòu)建重組載體PRE112-ARG，將其轉(zhuǎn)化至不能表達(dá)Ji蛋白的宿主細(xì)胞E. coli DH5 a，并通過氯霉素(Cm)抗性篩選，獲得的組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌株E. coli DH5 a -ARG。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工程菌株，其特征在于所述的自殺質(zhì)粒PRE112與宿主細(xì)胞染色體發(fā)生重組，使精氨酸酶I基因可組成型表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工程菌株，其特征在于所述的自殺質(zhì)粒PRE112的復(fù)制及轉(zhuǎn)化載體的制備和篩選在E. coli S17 A pirA宿主細(xì)胞進(jìn)行。
4.權(quán)利要求I所述的基因工程菌株E.coli DH5 a -ARG在L-鳥氨酸和D-精氨酸制備中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于以組成型表達(dá)精氨酸酶的E.coliDH5 a -ARG菌體作為酶源，以L-精氨酸為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，酶源細(xì)胞催化條件為f 5g/L，轉(zhuǎn)化溫度為2(T80°C ;轉(zhuǎn)化pH值為6 11 ;Mn2+濃度為0. lmlT2mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于在優(yōu)選溫度為60°C;優(yōu)選轉(zhuǎn)化pH值為.9.0 ;優(yōu)選Mn2+濃度為0. 5mM的最適反應(yīng)條件下，2g/L酶源細(xì)胞催化，當(dāng)?shù)孜風(fēng)-精氨酸濃度為100g/L時(shí)，反應(yīng)12h，底物L(fēng)-精氨酸的轉(zhuǎn)化率為98. 17%。
全文摘要
一株組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌株及其應(yīng)用。通過自殺質(zhì)粒pRE112構(gòu)建組成型表達(dá)精氨酸酶的基因工程菌菌株E.coliDH5α-ARG，其篩選后獲得的高活性菌株酶活力為873U/g，該菌株與實(shí)驗(yàn)室保存的誘導(dǎo)型表達(dá)的菌株相比，酶活力沒有顯著性差異。優(yōu)化的最佳催化反應(yīng)條件為反應(yīng)溫度，60℃；pH9.0；Mn2+濃度，0.5mM。最適反應(yīng)條件下，以2g/L細(xì)胞為酶源，當(dāng)?shù)孜風(fēng)-精氨酸濃度為100g/L時(shí)，反應(yīng)12h，底物L(fēng)-精氨酸的轉(zhuǎn)化率為98.17%。利用該酶源在該條件下轉(zhuǎn)化10gL-精氨酸可制備L-鳥氨酸7.48g，純度為98.9%，拆分20gDL-精氨酸可制備L-鳥氨酸7.44g和D-精氨酸9.71g，二者純度均達(dá)98.1%以上。
文檔編號C12N15/70GK102703370SQ201210177959
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者張奇, 李鳴, 楊潔, 白芳, 白鋼 申請人:南開大學(xué)