一株不依賴于甲硫氨酸的頭孢菌素高產(chǎn)基因工程菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于應(yīng)用工業(yè)微生物領(lǐng)域，尤其涉及一株不依賴于甲硫氨酸的頭孢菌素高 產(chǎn)基因工程菌株的構(gòu)建及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 頭孢菌素 C(Cephal〇Sp〇rin C，CPC)是生產(chǎn)頭孢類抗生素重要中間體7-氨基頭孢 燒酸(7-ACA)的主要原料。目前，工業(yè)上主要利用頂頭孢霉菌(Acremonium chrysogenum)來 發(fā)酵獲得CPC。頭孢菌素 C在頂頭孢霉菌中的生物合成途徑已經(jīng)基本研究清楚，且頂頭孢霉 菌的遺傳操作系統(tǒng)相對成熟，這為利用基因工程手段定向改造這一重要的工業(yè)真菌奠定了 良好基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個目的是提供一種重組頂頭孢霉菌。
[0004] 本發(fā)明提供的重組頂頭孢霉菌，為抑制頂頭孢霉菌基因組上的Acppml蛋白活性， 得到的重組菌；
[0005] 所述Acppml蛋白是如下1)或2):
[0000] 1)序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)；
[0007] 2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0008] 上述重組菌中，所述抑制頂頭孢霉菌基因組上的Acppml蛋白活性為敲除所述頂頭 孢霉菌基因組上的Acppml蛋白編碼基因。
[0009] 上述重組菌中，所述敲除所述頂頭孢霉菌基因組上的Acppml蛋白編碼基因為將頂 頭孢霉菌基因組上的Acppml蛋白編碼基因替換為標記基因；
[0010]所述Acppml蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1。
[0011] 上述重組菌中，所述標記基因為潮霉素 B編碼基因；
[0012] 所述潮霉素 B編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中序列6。
[0013] 上述重組菌的保藏編號為CGMCC N0.12103。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種產(chǎn)生頭孢菌素的方法。
[0015] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:在甲硫氨酸缺失體系中發(fā)酵上述的重組菌，得 到頭孢菌素。
[0016] 本發(fā)明第三個目的是提供一種蛋白。
[0017] 本發(fā)明提供的蛋白，是如下1)或2):
[0018] 1)序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)；
[0019] 2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0020] 為了使（1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0021] 表1標簽的序列
[0023]上述(2)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。 上述(2)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個 氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端 連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0024]編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍。
[0025]編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子具體是如下1)-3)中任一種的DNA分子：
[0026] 1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子；
[0027] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0028] 3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0029] 上述嚴格條件可為在6 X SSC、0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2 X SSC、 0 · 1 % SDS和 1 X SSC、0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0030] 抑制上述蛋白基因表達的物質(zhì)，其為用于同源重組的DNA分子或含有該DNA分子的 重組載體，包括上述蛋白基因上游同源臂、標記基因和上述蛋白基因下游同源臂；
[0031] 所述上述蛋白基因上游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列3;
[0032] 所述上述蛋白基因下游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列4。
[0033] 所述標記基因為潮霉素編碼基因，核苷酸序列為6。
[0034] 含有用于同源重組的DNA分子的重組載體將Acppml上游同源重組臂（序列3)插入 pAgl-H3載體的Apal和Apal酶切位點，且將Acppml下游同源重組臂（序列4)插入pAgl-H3載 體的AscI和Pad酶切位點，且將博萊霉素抗性表達框(ble)(序列5)插入pAgl-H3載體的 Swal和Swal酶切位點，得到的重組載體為pAgl-AcppmlDM，使Acppml上游同源重組臂、 Acppml下游同源重組臂和位于二者之間的且為pAgl-H3載體上的潮霉素編碼基因（序列6) 組成同源重組的DNA片段。
[0035] 上述蛋白或上述DNA分子或上述的物質(zhì)在調(diào)控頂頭孢霉菌在甲硫氨酸缺失條件下 產(chǎn)生頭孢菌素的量中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高。
[0036] 或抑制上述蛋白在提高頂頭孢霉菌在甲硫氨酸缺失條件下產(chǎn)生頭孢菌素的量中 的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0037]或上述的重組菌在生產(chǎn)頭孢菌素或提高頭孢菌素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范 圍。
[0038] 所述頂頭孢霉菌為頂頭孢霉菌CGMCC 3.3795。
[0039] 頂頭孢霉菌AcppmlDM已于2016年01月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物 研究所，郵編100101)，保藏中心登記入冊編號為CGMCCNo. 12103,分類命名為頂頭孢霉 Acremonium chrysogenum。
[0040] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明敲除頂頭孢霉菌的Acppml基因得到Acppml基因敲除重 組菌;該重組菌在去掉甲硫氨酸CPC的發(fā)酵水平反而較出發(fā)菌株提高了3倍。可以看出，敲除 Acppml基因可以使重組菌不僅在發(fā)酵過程中省去了甲硫氨酸的添加，而且提高了現(xiàn)有菌株 的CPC發(fā)酵水平。
【附圖說明】
[0041 ]圖1為基因敲除質(zhì)粒pAgl-AcppmlDM構(gòu)建示意圖。
[0042]圖2為頂頭孢霉菌Acppml基因敲除菌株的構(gòu)建示意圖(A)與PCR驗證(B)。
[0043]圖3為甲硫氨酸對頂頭孢霉菌野生型菌株WT與定向遺傳改造基因工程菌菌株 Acppml DM生長的影響。
[0044] 圖4為發(fā)酵條件下頂頭孢霉菌野生型菌株WT與基因工程菌株AcppmlDM的CPC產(chǎn)量 比較。
[0045] 圖5為在頂頭孢霉菌野生型菌株WT與基因工程菌株AcppmlDM發(fā)酵過程中CPC生物 合成基因 pcbC和cefEF的轉(zhuǎn)錄水平比較。
【具體實施方式】
[0046] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0048] 下述實施例中所用部分培養(yǎng)基配方見表2:
[0049] 表2為MM、IM和CM培養(yǎng)基配方
[0050]
[0051 ]注：葡萄糖、FeS〇4、MES和硫酸卡那霉素儲存液分別進行過濾除菌，并-20°c儲存、 備用。
[0052] 實施例l、Acppml基因的擴增
[0053] 通過分析頂頭孢霉菌以.(^巧8(^61111111)061〇：勵.3.3795的全基因組序列，獲得一 個可能的甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因 Acppml。
[0054] 采用Trizol試劑提取頂頭孢霉菌CGMCC N0.3.3795的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為 模板，以引物Ppml-Fl/Ppml-Rl和高保真酶(KOD-Plus)進行PCR擴增，得到1230bpPCR擴增產(chǎn) 物。
[0055] Ppml-Fl：CACACCATCGTCGTTCGAGT
[0056] Ppml-Rl：CGGAGAATCCAAAGAGCGAC
[0057]經(jīng)過測序，PCR擴增產(chǎn)物所示的基因命名為Acppml，其核苷酸序列為序列表中序列 1，編碼的蛋白為序列表中序列2，蛋白命名為Acppml。
[0058]實施例2、頂頭孢霉菌Acppml基因敲除菌株的構(gòu)建 [0059] 1、用于Acppml基因敲除的質(zhì)粒pAgl-AcppmlDM
[0060] l)Acp