的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及到利用一株新的藤倉鐮刀菌發(fā)酵生產(chǎn)赤霉 素 A4的方法，特別是發(fā)酵液中副產(chǎn)物赤霉素 A?占赤霉素 A4+7在4%以下。
【背景技術(shù)】
[0002] 本發(fā)明涉及的赤霉素 A4,其結(jié)構(gòu)式如下：
赤霉素(Gibberellins, GA)屬四環(huán)二砲類化合物，是一類內(nèi)源性植物調(diào)節(jié)物質(zhì)，廣泛 存在于植物中，至今已分離鑒定129種該類物質(zhì)。該類物質(zhì)對種子萌發(fā)、莖葉生長、抽苔座果 和塊莖形成等有顯著調(diào)節(jié)作用，于糧食、蔬菜水果的種植生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛。
[0003] 目前，赤霉素 A3及赤霉素 A4+7是市面上主要的赤霉素類產(chǎn)品，工業(yè)上常用微生物發(fā) 酵生產(chǎn)。近年來，赤霉素 A4+7在經(jīng)濟作物方面的應(yīng)用得到關(guān)注，如?；ū９⒋蚱菩菝叩?。但 是，在應(yīng)用過程中赤霉素 A4和赤霉素 A7發(fā)揮的作用存在明顯差異，甚至起到反作用。如赤霉 素 A4可促進植物花芽形成，而赤霉素 A7會對第二年開花造成不良影響；在促進莖枝伸長方 面，赤霉素 A7的效果大于赤霉素 A4,赤霉素 A7含量過尚會提尚果鎊病變的概率，等等。因此， 研究如何得到高含量的赤霉素 A4產(chǎn)品具有較大的實際意義。
[0004] 由于發(fā)酵工藝所限，目前工業(yè)上發(fā)酵法直接生產(chǎn)得到的都是赤霉素 A4+7的混合物， 且赤霉素 A7的含量普遍大于30%。為得到高含量赤霉素 A4產(chǎn)品，企業(yè)一般采用破壞發(fā)酵液中 赤霉素 A?組份的方法來提高赤霉素 A4含量，如專利CN 1111286A，申請?zhí)?5102240.7中提到 利用酸水解法以破壞發(fā)酵液中的赤霉素 A7以提高赤霉素 A4含量，過程中占發(fā)酵混合物30%以 上的赤霉素 A7被破壞。該方法使下游分離工藝變得復雜，不利于企業(yè)生產(chǎn)成本的控制。而其 他如高效液相色譜、薄層層析等分離方法則存在分離速度不好控制、設(shè)備昂貴、生產(chǎn)規(guī)模不 易放大等缺點。非工業(yè)應(yīng)用的只產(chǎn)赤霉素 A4的菌種曾被報道，Wilhelm Rademacher等 (Bioche. And Biophy.Res.Comm.91(l)，1979)發(fā)現(xiàn)木薯瘡痂病的病原菌Sphaceloma 1〇11；[1101:;[0013只產(chǎn)赤霉素44，但赤霉素44的產(chǎn)量僅為40(^8凡發(fā)酵液，無法達到工業(yè)生產(chǎn)的 最低水平，且至今未見進一步報道。
[0005] 高水平的適合于工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵法直接生產(chǎn)得到高含量赤霉素 A4產(chǎn)品的菌種及 技術(shù)方法未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種藤倉鐮刀菌及利用該藤倉鐮刀菌發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素 A4 的方法，其發(fā)酵液中副產(chǎn)物赤霉素 A7含量占赤霉素 A4+7總量4%以下;在于通過發(fā)酵培養(yǎng)基的 優(yōu)化提尚赤霉素 A4廣量。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為:第一個方面，一種藤倉鐮刀菌，菌種于2015年7月15日保藏 在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西 路1號院3號，保藏編號CGMCC ^).11101，分類命名藤倉鐮刀菌，菌種的拉丁學名？11%411111 fujikuroi。所述的藤倉鐮刀菌，其發(fā)酵產(chǎn)生高水平的赤霉素 A4,發(fā)酵水平達到1447 mg/L， 同時副產(chǎn)物赤霉素 A7占發(fā)酵混合產(chǎn)物(GA4+7)的4%以下。以上所述菌株是從原赤霉素 A4+7生 產(chǎn)菌種篩選誘變而成。具體誘變過程如下： (1)菌絲體富集從斜面挑取活化后的菌絲體于裝有30mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶 中，在26~35 °C，搖床轉(zhuǎn)速160~220 rpm條件下，培養(yǎng)2~3天。
[0008] 富集培養(yǎng)基的組成為(g/L):蔗糖30~50、黃豆粉10~15、NH4N〇3 1.0~2.0、MgS〇4 · 7H20 1.4~2.0 和KH2PO4 1.0~2.0。
[0009] (2)原生質(zhì)體制備將培養(yǎng)好的菌絲體用無菌濾紙過濾至無菌離心管，用緩沖液洗 滌3次后吸干多余水分，按1 OOmL制備好的濕菌絲對應(yīng)加入1.5mL酶液的比例往菌絲體中加 入預(yù)先配制好的酶液并置于30°C搖床上50 rpm震蕩4h，得到原生質(zhì)體。
[0010] 緩沖液的配制：稱取2.6g Na2HP〇4，12.8g NaH2P〇4，14.5g NaCl，用蒸餾水定容至 500mL，用Na2HP〇4調(diào)pH至6.0。高壓蒸汽滅菌后待用。
[0011]酶液的配制:稱取纖維素酶、溶菌酶及蝸牛酶溶解于上述緩沖液中，使三種酶的濃 度分別達到1.5%、0.7%、0.5%(w/v)。0.22nm微孔濾膜過濾除菌待用。
[0012] (3)原生質(zhì)體紫外處理及再生將原生質(zhì)體制備液用緩沖液稀釋后涂于再生平板， 紫外照射3min，遮光培養(yǎng)3天。
[0013] 再生培養(yǎng)基組成(g/L):土豆汁150~250、葡萄糖10~30和瓊脂15~20。
[0014] (4)發(fā)酵培養(yǎng)及穩(wěn)定性測試挑取再生平板上長勢較好的單菌落，經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā) 酵培養(yǎng)后，檢測發(fā)酵液中赤霉素 A4及赤霉素 A7的濃度。檢測發(fā)現(xiàn)一株赤霉素 A4含量占赤霉素 A4+7 96%的菌株。經(jīng)過五代發(fā)酵培養(yǎng)，赤霉素 A4的含量均在96%以上，且赤霉素 A4的濃度穩(wěn)定 在800ug/mL以上。該菌株發(fā)酵產(chǎn)赤霉素 A4表現(xiàn)十分穩(wěn)定。
[0015] 種子培養(yǎng)基組成為(g/L):蔗糖30~50、黃豆粉10~15、NH4N〇3 1.0~2.0、MgS〇4 · 7H20 1·4~2·(^ΡΚΗ2Ρ〇4?·0~2·0。
[0016] 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為（g/L):玉米淀粉80~100、花生粉20~30、ZnCl2 0.5、Α12〇3 0.8和CaC03 15〇
[0017] 篩選得到的菌株菌絲纏繞分枝、分隔；菌落白色，生長旺盛，質(zhì)地絨狀，表面平坦， 菌落反面黃色，無滲出液和可溶性色素產(chǎn)生。該菌的宏觀和顯微形態(tài)圖如圖1和圖2所示。
[0018] 第二個方面，一種利用上述藤倉鐮刀菌發(fā)酵生產(chǎn)赤霉素 A4的方法，先經(jīng)平板培養(yǎng) 將菌種活化，然后經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到目標產(chǎn)物赤霉素 A4,其具體步驟為： (1)平板培養(yǎng):將菌種接至PDA培養(yǎng)基，在pH6.0~7.0，溫度24~30 °C條件下，培養(yǎng)3~6天， 得到活化的赤霉菌菌落。
[0019] PDA培養(yǎng)基的組成為(g/L):土豆汁150~250、葡萄糖10~30和瓊脂15~20。
[0020] (2)種子培養(yǎng):從PDA培養(yǎng)基上挑取1~2個活化的赤霉菌菌落到裝有種子培養(yǎng)基的 搖瓶中，在pH 6.0~7.0,溫度26~32 °C，搖床轉(zhuǎn)速160~220 rpm條件下，培養(yǎng)1~3天，得到種子 液。種子培養(yǎng)基的裝液量為搖瓶體積的1 〇%~20%。
[0021 ] 種子培養(yǎng)基的組成為(g/L):蔗糖30~50、黃豆粉10~15、NH4N〇3 1.0~2.0、MgS〇4 · 7H20 1.4~2.0 和KH2P〇4 1.0~2.0。
[0022] (3)發(fā)酵培養(yǎng):將種子液按發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3%~10%比例接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基 的搖瓶中，在pH 6.0~7.0,溫度26~35 °C，搖床轉(zhuǎn)速160~220 rpm條件下，培養(yǎng)7~10天，得到 發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為搖瓶體積的10%~20%。
[0023] 發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為（g/L):碳源100~150,氮源20~60、K2S〇4 1.0~3.0、MgS〇4 · 7H20 0.8~1.2和ZnS〇4*7H20 5X 10-3~1X10-2。
【附圖說明】 圖1是本發(fā)明所述藤倉赤霉菌的宏觀形態(tài)圖。 圖2是本發(fā)明所述藤倉赤霉菌的顯微形態(tài)圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此。
[0025] 實施例1: (1)種子培養(yǎng)：種子培養(yǎng)基組成為（g/L):蔗糖40、黃豆粉12、NH4N〇3 1.2、MgS〇4 · 7H20 1.5和KH2P〇4 1.5,裝液量25/250 mL。滅菌后用無菌牙簽將單一的活化的菌落從平板刮下， 置入裝有2 mL水及約20顆直徑0.3 mm無菌玻璃珠的試管中強烈震蕩10 min，打散混勻，吸 取0.5 mL于種子培養(yǎng)基中，在溫度30 °C，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm條件下，培養(yǎng)48 h，得到種子液。 [0026]種子培養(yǎng)前，先將菌種接至PDA培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基的組成為（g/L): 土豆汁150~ 250、葡萄糖10~30和瓊脂15~20，在pH6.0~7.0，溫度24~30 °C條件下，培養(yǎng)3~6天，得到活化 的赤霉菌菌落。
[0027] (2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)基(配方1)組成為(g/L):淀粉120,黃豆餅粉10、玉米漿干 粉30、K2S〇4 2.0、MgS〇4 · 7H20 1.0和ZnS〇4 · 7H20 5 X 10-3,裝液量50/500 mL。接種時，將2 mL種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在31 °C，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm條件下，培養(yǎng)9天，得到發(fā)酵液。 [002