尖孢鐮刀菌核酸序列定性標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種尖孢鐮刀菌核酸序列定性標(biāo)準(zhǔn)樣品及其 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 世界糧農(nóng)組織(FA0)報(bào)告，全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受真菌及其真菌毒素污 染，約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，由此估算，全球每年因真菌 毒素污染而造成的直接及間接損失將可能達(dá)到數(shù)百億美元。
[0004] 在目前已知的真菌毒素中，鐮刀菌(Fusarium)是一種重要的植物病原菌，危害小 麥、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，造成嚴(yán)重的減產(chǎn)，所產(chǎn)生的玉米赤霉烯酮毒素鐮刀菌毒素具 有明顯的細(xì)胞毒和對(duì)蛋白質(zhì)、DNA合成的抑制作用，并有肯定的致畸性和致突變性，且污染 十分廣泛。目前針對(duì)真菌毒素的檢測(cè)，我國(guó)主要為理化方法，只能檢測(cè)到已經(jīng)產(chǎn)生的毒素， 對(duì)于已被污染但尚未產(chǎn)生毒素的高風(fēng)險(xiǎn)食品卻束手無(wú)策，更無(wú)法溯源，而且由于真菌的形 態(tài)相似性及產(chǎn)毒真菌的產(chǎn)毒狀況的復(fù)雜性，目前各菌種保藏中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株基本信息 不全，基本不涵蓋產(chǎn)毒信息，使檢驗(yàn)工作難以獲得真正的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)樣品。
[0005] 真菌毒素是困擾食品安全的大問(wèn)題，但是目前針對(duì)真菌毒素檢測(cè)的化學(xué)方法無(wú)法 檢測(cè)還未產(chǎn)生毒素但攜帶毒素基因的潛在產(chǎn)毒真菌，而分子生物學(xué)方法則可以快速篩選， 預(yù)先排除存在的產(chǎn)毒真菌，從而避免糧食、食品的大面積的污染。但是由于真菌孢子易于飄 散，極易污染且難以消除等特性，需要特殊的操作空間，一些實(shí)驗(yàn)室不具備相應(yīng)的工作條 件，檢測(cè)工作難以完成。
[0006] 近年來(lái)PCR技術(shù)在微生物的檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。ITS(Internal Transcribed Spacer):內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，是真菌核糖體RNA(rRNA)基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分。用 于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5 .8 S和ITS24DNA上的5 .8S、18S和28S rRNA基 因有極大的保守性，即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體，所以 ITS片段在進(jìn)化過(guò)程中承受的自然選擇壓力非常小，因此能容忍更多的變異，在絕大多數(shù) 的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能 在ITS序列上表現(xiàn)出差異，顯示最近的進(jìn)化特征。研究表明，ITS片段的進(jìn)化速率是18 S rDNA的10倍，這就是ITS序列在微生物種類(lèi)鑒定和群落分析的理論基礎(chǔ)。ITS1和ITS2 是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯。這種特點(diǎn)使 ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育 關(guān)系分析。由于ITS的序列分析能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對(duì)差異， 同時(shí)ITS序列片段較小、易于分析，目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的 系統(tǒng)發(fā)育研究中。ITS的序列分析還有效地解決真菌應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類(lèi)所引起的紛 爭(zhēng)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類(lèi)上的一些不足。
[0007] 另外，目前已研制的分類(lèi)定級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品多數(shù)溯源至相應(yīng)的文字標(biāo)準(zhǔn)，生物類(lèi) 定性標(biāo)準(zhǔn)樣品多數(shù)溯源至公認(rèn)的測(cè)試方法，部分國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品沒(méi)有溯源性的描述。對(duì)2010 年~2015年批準(zhǔn)的146項(xiàng)分類(lèi)定級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品溯源性描述的調(diào)查表明：無(wú)溯源性描述內(nèi) 容的35項(xiàng)，溯源至測(cè)試方法標(biāo)準(zhǔn)的102項(xiàng)，溯源至核酸序列的22項(xiàng)，溯源至產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的5項(xiàng)， 溯源至計(jì)量基準(zhǔn)的1項(xiàng)，溯源至權(quán)威專家的1項(xiàng)。分類(lèi)定級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品溯源性描述的狀況 說(shuō)明人們對(duì)這類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品的溯源性認(rèn)識(shí)和理解上處于比較混亂的階段，還沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的 規(guī)范。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是克服上述不足問(wèn)題，提供一種生物和產(chǎn)毒信息明確的尖孢鐮刀菌 核酸序列定性標(biāo)準(zhǔn)樣品制備方法，同時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分類(lèi)定級(jí)理論，建立尖孢鐮刀菌核酸 序列定性標(biāo)準(zhǔn)樣品定值溯源參照系與參照指標(biāo)。本發(fā)明的另一目的是提供一種尖孢鐮刀菌 核酸序列定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法。
[0009] 本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是:一種尖孢鐮刀菌核酸序列定性標(biāo)準(zhǔn) 樣品，其特征在于:所述尖孢鐮刀菌核酸序列定性標(biāo)準(zhǔn)樣品包含的序列為： 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)基因（ITS)序列： TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTT GCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAA CTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGC AAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTAT TCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGT TCCCCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGC CACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAGGAG GCGAATAAC； 核糖體rRNA 18S基因（18S)序列： GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCAATTATACAGCGAAACTGCGAA TGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATAC ATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGATGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTTCGGGGCTCACTGGTGAT TCATGATAACTCCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATG TTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAAC GGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACT GATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAA GTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTT GAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCA TGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCT CGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTA ATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGA AAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTC TTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAG TGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAG； 核糖體rRNA 28S基因（28S)序列： GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGTTTATGACCAGACTTGGGCTTGGTTAATCATCTGGGGTTCTCCCCAGTGC ACTTTTCCAGTCCAGGCCAGCATCAGTTTTCCCCGGGGGATAAAGGCGGCGGGAATGTGGCTCTCTTCGGGGAGTGT TATAGCCCACCGTGTAATACCCTGGGGGGGACTGAGGTTCGCGCATCTGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAAC GACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTC； 尖孢鐮刀菌18S特異序列基因(F.Oxy)序列： TACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTC TGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATC GAT