本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及利用合成生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建一種具有催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的基因工程菌及其應(yīng)用。

技術(shù)背景

黃酮類化合物(flavonoids)是廣泛存在于自然界的多酚類化合物，最早是指以2-苯基色原酮(flavone)為母核而衍生的一類化合物，現(xiàn)在泛指兩個(gè)苯環(huán)(a環(huán)和b環(huán))通過中間三碳環(huán)(c環(huán))相互連接而成的以c6-c3-c6為基本骨架的一系列化合物。黃酮類化合物是多種藥用植物的有效成分，如黃芩素是植物黃芩的主要藥用活性成分，在植物體內(nèi)多以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在，具有多種生理和藥理活性，如抗氧化、抗抑郁和抗腫瘤等生理活性；已經(jīng)被用于臨床的如野黃芩苷(商品名：朗瑞西樂)在我國(guó)已制成注射劑作為活血化瘀、通脈止痛的藥物應(yīng)用；大豆苷元8-c-葡萄糖苷，即葛根素注射液在我國(guó)用于輔助治療冠心病、心絞痛、心肌梗塞、視網(wǎng)膜動(dòng)、靜脈阻塞、突發(fā)性耳聾，而且國(guó)外也越來越多把葛根素作為食品添加劑使用，用于保健。

但是由于大多數(shù)黃酮苷元及部分黃酮苷類化合物在水相中溶解度較低，限制了其制劑的開發(fā)。目前對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行分子修飾主要是以提高其水溶性為目的，對(duì)其水溶性改善所涉及的化學(xué)反應(yīng)主要是糖苷化修飾，而對(duì)其糖苷化修飾目前研究最多的是葡萄糖苷化反應(yīng)。糖苷化修飾可以提高黃酮類化合物水溶性和生物利用度，增加黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。因此，對(duì)黃酮類化合物的葡萄糖苷化修飾是一種極具潛力的結(jié)構(gòu)修飾技術(shù)，能促進(jìn)黃酮類藥物的臨床應(yīng)用。

對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行糖苷化修飾包括化學(xué)修飾法和生物催化法，對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行糖苷化修飾生物催化法主要包括微生物法和酶法。

化學(xué)修飾法的技術(shù)瓶頸在于位置選擇性的用苯基、芐基或甲氧基等把某一羥基保護(hù)，然后再進(jìn)行糖苷化反應(yīng)，再脫去保護(hù)基團(tuán)，最終得到目標(biāo)產(chǎn)物。例如：對(duì)黃酮的酚羥基先用酰基進(jìn)行保護(hù)，再高選擇性的脫保護(hù)基，然后與活化的糖基供體(如糖基三氯乙酰亞胺酯)進(jìn)行糖苷化反應(yīng)，最后再脫去其它保護(hù)基團(tuán)獲得黃酮糖苷化產(chǎn)物(lim,hanx,yub.facilesynthesisofflavonoid7-o-glycosides.jorgchem,2003,8:6842-6845)。這種葡萄糖苷化的化學(xué)修飾反應(yīng)步驟復(fù)雜，收率低，副產(chǎn)物多，難以進(jìn)行規(guī)模化放大和生產(chǎn)，不具有生產(chǎn)實(shí)用價(jià)值。

微生物法和酶法進(jìn)行葡萄糖苷化修飾反應(yīng)條件溫和，無需進(jìn)行保護(hù)和脫保護(hù)反應(yīng)，立體和區(qū)域選擇性高，可以定向高效地生物催化黃酮苷元或部分水溶性低的黃酮苷發(fā)生糖苷化修飾。

微生物細(xì)胞的糖苷化修飾：kim等利用康氏木霉(trichodermakoningii)對(duì)水飛薊賓a和水飛薊賓b進(jìn)行葡萄苷化修飾，得到水飛薊素a3-o-β-d-葡萄糖苷(轉(zhuǎn)化率18.0％)和水飛薊素a7-o-β-d-葡萄糖苷(轉(zhuǎn)化率7.5％)及水飛薊素b3-o-β-d-葡萄糖苷(轉(zhuǎn)化率15％)和水飛薊素b-7-o-β-d-葡萄糖苷(轉(zhuǎn)化率4.5％)(kimhj,parkhs,leeis.microbialtransformationofsilybinbytrichodermakoningii.bioorgmedchemlett,2006,16:790-793)。shimoda等利用野油菜黃單胞菌(xanthomonascampestris)可以對(duì)橙皮素3',5,和7位羥基進(jìn)行糖苷化修飾反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率分別為12％,10％，15％(shimodak,hamadah.productionofhesperetinglycosidesbyxanthomonascampestrisandcyclodextringlucanotransferaseandtheiranti-allergicactivities.nutrients,2010,2:171-180)。從非專利文獻(xiàn)報(bào)道來看，以微生物細(xì)胞進(jìn)行的葡萄糖苷化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，糖苷產(chǎn)物較復(fù)雜；為提高轉(zhuǎn)化率可增加轉(zhuǎn)化體系的微生物細(xì)胞濃度，同時(shí)微生物細(xì)胞自身也產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。因此，微生物法的產(chǎn)物難以分離純化，但可以進(jìn)行規(guī)模化放大，生產(chǎn)應(yīng)用需要優(yōu)化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的純化工藝。

利用糖基轉(zhuǎn)移酶的酶促催化法修飾：li等將來源于puerarialobata的糖基轉(zhuǎn)移酶plugt1基因通過大腸桿菌的異源表達(dá)純化后，外源性的加入糖供體udp-glucose進(jìn)行酶促催化反應(yīng)，證實(shí)plugt1位置選擇性的催化異黃酮生成異黃酮7-o-葡萄糖苷(lij，liz-b，lic-f，etal.molecularcloningandcharacterizationofanisoflavone7-o-glucosyltransferasefrompuerarialobata.plantcellrep,2014,33:1173–1185)。thuan等在大腸桿菌體內(nèi)同時(shí)引入合成糖供體途徑的基因(即：磷酸葡萄糖變位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶)以及擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶，不需要外源性加入糖供體直接把黃酮芹菜素和黃芩素底物加入工程菌液中分別獲得芹菜素7-o-葡萄糖苷和黃芩素7-o-葡萄糖苷(thuannh,parkjw,sohngjk.towardtheproductionofflavone-7-o-_-d-glucopyranosidesusingarabidopsisglycosyltransferaseinescherichiacoli.processbiochemistry,2013,48:1744–1748)。酶法催化黃酮類化合物糖苷化的主要特點(diǎn)是異源表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶后，用粗酶或純化后的酶作為催化劑，外源加入活性糖基供體，底物加入量較少，在離體緩沖鹽中反應(yīng)。目前為止酶法催化主要用于鑒定酶的催化特性以及尋找新的活性酶，而不用來大量半合成黃酮苷類化合物。大腸桿菌全細(xì)胞半合成黃酮苷類化合物主要特點(diǎn)是大腸桿菌可以內(nèi)源性的生成活性糖基供體，可以把底物直接加入菌體發(fā)酵液中，反應(yīng)一定時(shí)間后，直接從菌體和發(fā)酵液中提取產(chǎn)物黃酮苷類化合物。全細(xì)胞合成黃酮苷類化合物省去了酶法表達(dá)后需要純化的步驟，節(jié)省時(shí)間，而且不需要外源性加入活性糖供體，節(jié)省開支。

釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)具有真核生物的特征，遺傳背景清楚、穩(wěn)定，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，從很久以前就用釀酒酵母來生產(chǎn)食物和酒精飲料等，通常認(rèn)為是非致病菌(generallyregardedassafe，gras)。釀酒酵母表達(dá)體系與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，其適度的糖基化修飾以及翻譯后修飾更適合高等植物蛋白的表達(dá)(limemi,guedone,hehna,etal.productionofphenylpropanoidcompoundsbyrecombinantmicroorganismsexpressingplant-specificbiosynthesisgenes.processbiochem,2008,43:463-479.)。此外，釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)存在大量udp-glucose胞質(zhì)庫(okat,jigamiy.reconstructionofdenovopathwayforsynthesisofudp-glucuronicacidandudp-xylosefromintrinsicudp-glucoseinsaccharomycescerevisiae.febsj,2006,273,2645–2657)，可以為黃酮苷類化合物的合成提供較多的糖供體，有利于黃酮苷的合成。基于以上考慮，將糖基轉(zhuǎn)移酶在釀酒酵母細(xì)胞中表達(dá)，可以為利用重組釀酒酵母細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞催化黃酮苷類化合物生成的工藝奠定基礎(chǔ)。但是釀酒酵母細(xì)胞中存在多種糖苷水解酶，如exg1、spr1和yir007w等(schmidts,rainieris,wittes,etal.identificationofasaccharomycescerevisiaeglucosidasethathydrolyzesflavodoidglucosides.applenvironmicrobiol,2011,77:1751-1757)，可以把生成的黃酮-o-葡萄糖苷水解，而這個(gè)水解過程阻礙了利用釀酒酵母細(xì)胞作為工程菌催化合成黃酮葡萄糖苷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是提供一種具有生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化活性的基因工程菌，其制備過程主要包括以下步驟：1.降低或消除宿主細(xì)胞內(nèi)源性的葡萄糖苷水解酶活性；2.通過提高宿主細(xì)胞參與活化的糖基供體尿苷二磷酸葡萄糖(udp-葡萄糖)合成途徑中的2個(gè)關(guān)鍵酶，即磷酸葡萄糖變位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高udp-葡萄糖胞內(nèi)水平；3.在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)入udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因并通過強(qiáng)啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)，即獲得具有生物催化黃酮葡萄糖苷化的基因工程菌。

本發(fā)明一個(gè)目的是解決釀酒酵母細(xì)胞存在β-葡萄糖苷水解酶水解黃酮類葡萄糖苷的問題，提供一種降低或消除宿主細(xì)胞內(nèi)β-葡萄糖苷水解酶水解黃酮-β-葡萄糖苷的釀酒酵母工程細(xì)胞，因?yàn)樗拗骷?xì)胞具有較高的內(nèi)源性β-葡萄糖苷水解酶活性，不利于生物催化合成的黃酮葡萄糖苷產(chǎn)物的積累和產(chǎn)量提高。

本發(fā)明另一個(gè)目的是解決黃酮類化合物葡萄糖苷化反應(yīng)中活化的udp-葡萄糖供體的合成難題。宿主細(xì)胞代謝池內(nèi)活化的糖基供體尿苷二磷酸葡萄糖濃度很低，不利于提高僅轉(zhuǎn)入尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因的工程菌催化合成黃酮葡萄糖苷的效率。

本發(fā)明另一個(gè)目的是在于解決天然黃酮類苷元化合物溶解度低的問題，提供一種生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的基因工程釀酒酵母細(xì)胞。

本發(fā)明以天然或化學(xué)合成的黃酮苷元為底物，通過糖基化反應(yīng)提高其水溶性，進(jìn)而改善其生物利用率，對(duì)先導(dǎo)物進(jìn)行糖基化修飾后，部分藥物可以提高藥效，降低毒副作用，為黃酮類化合物新藥研制提供一個(gè)新的途徑。

本發(fā)明還提供了一個(gè)通過從搖瓶發(fā)酵到小型發(fā)酵罐放大的生物催化合成黃酮葡萄糖苷的方法。

本發(fā)明提供了一個(gè)獲得具有生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化功能的基因工程釀酒酵母細(xì)胞，該細(xì)胞既能穩(wěn)定高效合成活化的葡萄糖基供體尿苷二磷酸(udp)葡萄糖，又能實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)共表達(dá)的udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)，即這種能夠?qū)崿F(xiàn)自供給udp-葡萄糖的活細(xì)胞可直接用作生物催化劑催化黃酮類化合物葡萄糖苷化反應(yīng)。

本發(fā)明通過在宿主細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)磷酸葡萄糖變位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶，提高細(xì)胞代謝池內(nèi)udp-葡萄糖的濃度。通常狀態(tài)下細(xì)胞代謝池內(nèi)udp-葡萄糖濃度很低，即便細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)了具有催化黃酮類化合物葡萄糖苷化活性的udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，也難以高效地獲得黃酮類化合物的糖苷化反應(yīng)。為提高細(xì)胞代謝池udp-葡萄糖的濃度并實(shí)現(xiàn)與udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的高效耦聯(lián)，本發(fā)明采用整合型表達(dá)載體pδgap′g、pδgaph(tangl,wangw,etal.threepathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)和強(qiáng)啟動(dòng)子釀酒酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子(gap)或巴斯德畢赤三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子gap′的構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)目的基因整合到宿主基因組，從而實(shí)現(xiàn)磷酸葡萄糖變位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶在細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)而提高代謝池內(nèi)udp-葡萄糖水平；同時(shí)再利用整合型表達(dá)載體pδgapg(tangl,wangw,etal.threepathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)和強(qiáng)啟動(dòng)子gap實(shí)現(xiàn)異源的udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的高表達(dá)。

本發(fā)明獲得的釀酒酵母工程菌直接用作生物催化劑，把黃酮苷元直接加入到利用sc培養(yǎng)基培養(yǎng)的活細(xì)胞催化體系中進(jìn)行糖苷化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后利用有機(jī)溶劑分離純化獲得糖苷化的黃酮類化合物。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的一種構(gòu)建具有生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化活性的基因工程菌，其制備過程包括：

i)敲除宿主菌內(nèi)源性的葡萄糖苷水解酶基因；

ii)提高宿主菌中內(nèi)源性或異源性的磷酸葡萄糖變位酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高催化效率；

iii)提高宿主菌中內(nèi)源性或異源性的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高催化效率；

iv)在宿主菌內(nèi)轉(zhuǎn)入尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因，并使其高表達(dá)。

所述i)、ii)、iii)、iv)以任意順序操作完成后即得到所述具有生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化活性的基因工程菌。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中,采用的宿主菌是釀酒酵母，宿主細(xì)胞自身具有很強(qiáng)的內(nèi)源性糖苷水解酶活性，為消除宿主細(xì)胞內(nèi)源性糖苷水解酶活性，通過同源重組的的方法分別敲除了糖苷水解酶exg1、spr1和yir007w基因。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中同時(shí)敲除了exg1和spr1兩個(gè)基因。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了一個(gè)敲除糖苷水解酶exg1基因所使用的具有seqidno.1所示堿基序列的同源雙交換整合框。首先利用pcr方法首先從宿主基因組dna獲得糖苷水解酶exg1基因的長(zhǎng)度分別為450bp和542bp同源dna片段，然后通過限制性內(nèi)切酶酶切和dna連接的方式在2個(gè)同源片段中間插入篩選標(biāo)記基因trp，即得到如seqidno1所示的含有exg1同源片段和篩選標(biāo)記表達(dá)框trp的質(zhì)粒ez-exg1-trp，其中第1-450和第1674-2216堿基序列為exg1同源片段，第451-1673堿基序列包括篩選標(biāo)記trp基因啟動(dòng)子、開放閱讀框和終止子的整個(gè)表達(dá)框。通過noti單酶切線性化后，通過liac轉(zhuǎn)化法把同源dna片段整合至釀酒酵母基因組中，實(shí)現(xiàn)糖苷水解酶exg1基因的敲除。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中提供了一個(gè)敲除糖苷水解酶spr1基因所使用的具有seqidno.2所示堿基序列的同源雙交換整合框。首先利用pcr方法從宿主基因組dna獲得糖苷水解酶spr1基因的長(zhǎng)度分別為574bp和454bp同源dna片段，然后通過限制性內(nèi)切酶酶切和dna連接的方式在2個(gè)同源片段中間插入篩選標(biāo)記基因ade2，即得到如seqidno2所示的含有spr1同源片段和篩選標(biāo)記表達(dá)框ade2的質(zhì)粒ez-spr1-ade2，其中第1-575和第2839-3292堿基序列為spr1同源片段，第576-2838堿基序列包括ade2基因啟動(dòng)子、開放閱讀框和終止子的整個(gè)表達(dá)框。質(zhì)粒ez-spr1-ade2用saci線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中，實(shí)現(xiàn)糖苷水解酶spr1基因的敲除。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中提供了一個(gè)敲除糖苷水解酶yir007w基因所使用的具有seqidno.3所示堿基序列的同源雙交換整合框。首先利用pcr方法從宿主基因組dna獲得糖苷水解酶yir007w基因的長(zhǎng)度分別為508bp和525bp同源dna片段，然后通過限制性內(nèi)切酶酶切和dna連接的方式在2個(gè)同源片段中間插入篩選標(biāo)記基因ura3，即得到如seqidno3所示的含有yir007w同源片段和篩選標(biāo)記表達(dá)框ura3的質(zhì)粒ez-yir-ura3，其中第1-508和第1640-2164堿基序列為yir007w同源片段，第509-1639堿基序列包括ura3基因啟動(dòng)子、開放閱讀框和終止子的整個(gè)表達(dá)框。質(zhì)粒ez-yir-ura3用saci線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中，實(shí)現(xiàn)糖苷水解酶yir007w基因的敲除。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了一個(gè)提高宿主細(xì)胞內(nèi)活化的糖基供體udp-葡萄糖合成的技術(shù)方法。首先以釀酒酵母基因組dna為模板，利用pcr反應(yīng)和dna連接的基因克隆方法獲得編碼磷酸葡萄糖變位酶基因pgm2和尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因ugp1的dna片段，然后分別亞克隆到含有畢赤酵母和釀酒酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子(組成型高表達(dá)啟動(dòng)子(gap))的整合型表達(dá)載體上pδgap′g和pδgaph(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)，即獲得了2個(gè)整合型的表達(dá)載體pδgap′g-pgm2和pδgaph-ugp1，然后利用noti線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組的δ位點(diǎn)中，通過g418和潮霉素即可篩選獲得陽性克隆，這樣獲得工程菌具有較高的合成udp-葡萄糖潛能的基礎(chǔ)工程菌株w303-1b/es/pu(e表示敲除exg1基因，s表示敲除spr1基因，p表示整合pgm2基因進(jìn)入宿主基因組，u表示整合ugp1基因進(jìn)入宿主基因組)，再與udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因組合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了野黃芩素葡萄糖苷的高效合成。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中也提供了一個(gè)提高宿主細(xì)胞內(nèi)活化的糖基供體udp-葡萄糖合成的技術(shù)方法。首先以大腸桿菌基因組dna為模板，利用pcr反應(yīng)和dna連接的基因克隆方法獲得的異源磷酸葡萄糖變位酶基因(pgm)和尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因(galu)的dna片段，然后分別亞克隆到含有釀酒酵母和甲醇酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子(組成型高表達(dá)啟動(dòng)子(gap))的整合型表達(dá)載體pδgaph和pδgap′z，其中質(zhì)粒載體pδgap′z是用博來霉素(zeocin)抗性標(biāo)記基因置換pδgap′g中g(shù)418篩選標(biāo)記基因kanmx的衍生載體，即獲得了2個(gè)整合型的表達(dá)載體pδgaph-pgm和pδgap′z-galu，然后利用noti線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組的δ位點(diǎn)中，通過潮霉素和博來霉素即可篩選獲得陽性克隆，這樣獲得工程菌同樣具有較高的合成udp-葡萄糖能力的基礎(chǔ)工程菌株w303-1b/es/peg(pe表示整合大腸桿菌的pgm基因進(jìn)入宿主基因組，g表示整合大腸桿菌的galu基因進(jìn)入宿主基因組)，再與udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因組合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了野黃芩素葡萄糖苷的高效合成。

本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中提供了一種具有生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的基因工程釀酒酵母細(xì)胞。宿主細(xì)胞自身不具有催化udp-葡萄糖和黃酮底物合成黃酮葡萄糖苷的活性，本發(fā)明選取中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01410185256.4中seqidno:29所示堿基序列(編碼的氨基酸序列為seqidno:12)并通過pcr和亞克隆的方式構(gòu)建能在酵母細(xì)胞中表達(dá)的整合表達(dá)載體pδgapg-sbgt34，最后再用noti線性化質(zhì)粒pδgapg-sbgt34轉(zhuǎn)化工程化的基礎(chǔ)菌株w303-1b/es/pu，即獲得菌種編號(hào)為cgmccno.11381的工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34。

本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中也提供了另一種具有生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的基因工程釀酒酵母細(xì)胞。宿主細(xì)胞自身不具有催化udp-葡萄糖和黃酮底物合成黃酮葡萄糖苷的活性，本發(fā)明選取中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01410185256.4中seqidno:29所示堿基序列(編碼的氨基酸序列為seqidno:12)并通過pcr和亞克隆的方式構(gòu)建能在酵母細(xì)胞中表達(dá)的整合表達(dá)載體pδgapg-sbgt34，最后再用noti線性化質(zhì)粒pδgapg-sbgt34轉(zhuǎn)化工程化的基礎(chǔ)菌株w303-1b/es/peg(pe表示整合大腸桿菌的pgm基因進(jìn)入宿主基因組，g表示整合大腸桿菌的galu基因進(jìn)入宿主基因組)，即獲得菌種編號(hào)為cgmccno.12057的工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34在反應(yīng)瓶中用sc合成培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，而后在加入不同的黃酮類苷元(如木犀草素、柚皮素、木蝴蝶素a、白楊素、漢黃芩素、槲皮素、黃芩素以及大豆黃酮)，生物催化合成相應(yīng)的產(chǎn)物黃酮葡萄糖苷。

本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中提供了工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34生物催化野黃芩素葡萄糖苷化反應(yīng)的優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案，即在碳源葡萄糖的濃度為10％和ph值5.5時(shí)生物催化效率較高。

本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中還提供了工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34在10-l發(fā)酵罐內(nèi)生物催化野黃芩素葡萄苷合成的放大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案，通過控制ph值和葡萄糖的濃度使得野黃芩素葡萄苷的產(chǎn)量能從搖瓶轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的215mg/l提高到了1200mg/l。

在本發(fā)明的實(shí)施方案中，獲得2株具有生物催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的基因工程釀酒酵母細(xì)胞，生物材料樣品保藏信息：

分類命名：釀酒酵母；拉丁學(xué)名：saccharomycescerevisiae；保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)、中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏編號(hào)為：cgmccno.11381、cgmccno.12057，其保藏日期分別為：2015年09月15日和2016年1月19日。

附圖說明

圖1.宿主菌釀酒酵母基因操作示意圖。glucose，葡萄糖；glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸；glucose-1-phosphate，葡萄糖-1-磷酸；udp-glucose，udp-葡萄糖；flavonoid，黃酮；flavonoid-o-glucoside，黃酮-o-葡萄糖苷；hk，己糖激酶；pgm，磷酸葡萄糖變位酶；ugpase，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶；gts，udp-葡萄糖轉(zhuǎn)移酶；glycosidase，葡萄糖苷水解酶。

圖2.釀酒酵母胞內(nèi)葡萄糖苷酶的活性鑒定。a.木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品hplc色譜圖；b.木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品hplc色譜圖；c.釀酒酵母全細(xì)胞催化木犀草苷反應(yīng)后hplc色譜圖。

圖3.敲除釀酒酵母葡萄糖苷酶同源重組質(zhì)粒的構(gòu)建以及同源替換基因組的示意圖。a.敲除exg1基因的示意圖(含有啟動(dòng)子/終止子序列)；b.敲除spr1基因的示意圖；c.敲除yir007w基因的示意圖。

圖4.同源重組敲除釀酒酵母糖苷水解酶基因工程酵母的pcr鑒定。ck^-，沒有敲除葡萄糖苷水解酶基因的釀酒酵母基因組pcr擴(kuò)增結(jié)果；ck+，構(gòu)建測(cè)序正確的沒有轉(zhuǎn)入釀酒酵母基因組的陽性質(zhì)粒pcr擴(kuò)增結(jié)果。a、b、c分別是敲除exg1、spr1和yir007w基因后陽性克隆的pcr擴(kuò)增結(jié)果。

圖5.敲除葡萄糖苷酶基因后宿主酵母細(xì)胞對(duì)木犀草苷水解活性的鑒定。w303-1b、w303-1b/exg1、w303-1b/spr1和w303-1b/yir007w分別代表宿主菌、敲除exg1基因、敲除spr1基因和敲除yir007w基因的工程菌。a.葡萄糖苷酶基因敲除后工程菌對(duì)木犀草苷水解活性的分析結(jié)果。b.葡萄糖苷酶基因敲除工程菌的細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)果。

圖6.敲除葡萄糖苷酶后并整合了糖基轉(zhuǎn)移酶sbgt34的工程菌對(duì)野黃芩素轉(zhuǎn)化率的影響。w303-1b/sbgt34是宿主菌直接整合糖基轉(zhuǎn)移酶基因sbgt34后對(duì)野黃芩素催化動(dòng)力學(xué)的曲線。w303-1b/es/sbgt34是敲除exg1和spr1基因同時(shí)整合了糖基轉(zhuǎn)移酶基因sbgt34后對(duì)野黃芩素催化動(dòng)力學(xué)的曲線。w303-1b/es/peg/sbugt34是在w303-1b/es/sbgt34基礎(chǔ)上高表達(dá)大腸桿菌糖代謝過程基因pgm和galu后對(duì)野黃芩素催化動(dòng)力學(xué)的曲線。w303-1b/es/pu/sbugt34是在w303-1b/es/sbgt34基礎(chǔ)上高表達(dá)釀酒酵母糖代謝過程基因pgm2和ugp1對(duì)野黃芩素催化動(dòng)力學(xué)的曲線。

圖7.不同濃度野黃芩素底物的轉(zhuǎn)化率及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。野黃芩素底物濃度分別為0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm和1.0mm，工程菌是w303-1b/es/pu/sbgt34，即敲除糖苷酶exg1和spr1基因并同時(shí)過表達(dá)磷酸葡萄糖變位酶(pgm2)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ugp1)和糖基轉(zhuǎn)移酶sbgt34。a.不同濃度野黃芩素底物的轉(zhuǎn)化率。b.沒有加入底物的工程菌以及加入不同濃度底物的工程細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

圖8.不同濃度葡萄糖和ph條件對(duì)工程菌催化野黃芩素糖苷化的影響。工程菌是w303-1b/es/pu/sbgt34，底物野黃芩素濃度是0.6mm，圖a是葡萄糖濃度分別為2％、5％、10％和15％時(shí)工程細(xì)胞對(duì)野黃芩素的轉(zhuǎn)化率；圖b是不同ph條件對(duì)工程細(xì)胞催化野黃芩素糖苷化的影響：反應(yīng)液中加入50mm磷酸鹽緩沖液，其中ph條件分別為4.5、5.0、5.5、6.0、ck(沒有加入磷酸緩沖鹽調(diào)節(jié)ph)。

圖9.工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34在10-l發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)對(duì)野黃芩素的生物催化活性。產(chǎn)物是野黃芩素7-o-葡萄糖苷，紅色曲線代表目的產(chǎn)物隨時(shí)間的延伸累積量的變化曲線；綠色曲線代表細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，即在od600nm下測(cè)定的菌體生長(zhǎng)情況。

圖10.工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34催化不同黃酮底物的hplc色譜圖。底物分別為木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素a、野黃芩素、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮，箭頭所示是催化產(chǎn)生的黃酮-o-葡萄糖苷化產(chǎn)物。

圖11.工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34催化不同黃酮底物的相對(duì)活性。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了構(gòu)建一個(gè)具有高效催化合成葡萄糖苷化的工程菌及其在黃酮糖苷化合物合成中的應(yīng)用。其中所述的糖苷水解酶、磷酸葡萄糖變位酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶等基因以及黃酮類化合物葡萄糖苷化反應(yīng)及其產(chǎn)物分析，簡(jiǎn)介如下：

1.本發(fā)明中編碼糖苷水解酶exg1、spr1和yir007w的多核苷酸

在實(shí)施例中工程化的釀酒酵母基因組中有3個(gè)糖苷水解酶exg1、spr1和yir007w基因，其相應(yīng)的同源dna片段是直接從宿主細(xì)胞釀酒酵母w303-1b基因組中利用nested-pcr方法擴(kuò)增獲得的，然后與篩選標(biāo)記基因trp、ade2、ura3分別構(gòu)建同源整合載體ez-exg1-trp、ez-spr1-ade2和ez-yir-ura3，進(jìn)而通過同源替換的方式整合到釀酒酵母基因組中，使得釀酒酵母中的葡萄糖苷酶基因失活或降低，不能發(fā)揮其糖苷水解活性。

2.本發(fā)明中編碼酵母磷酸葡萄糖變位酶pgm2和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶ugp1的多核苷酸

在實(shí)施例中工程化的釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)同源的pgm2、ugp1基因，其相應(yīng)的多核苷酸是直接從宿主細(xì)胞釀酒酵母w303-1b基因組中利用常規(guī)pcr方法擴(kuò)增獲得的，然后與畢赤酵母gap啟動(dòng)子或釀酒酵母gap啟動(dòng)子和pgk終止子構(gòu)建成融合基因，再通過同源替換的方式到整合到釀酒酵母基因組中，目的是促進(jìn)細(xì)胞代謝通路向著udp-葡萄糖合成方向進(jìn)行，進(jìn)而提高細(xì)胞代謝池內(nèi)udp-葡萄糖的水平；對(duì)這2個(gè)功能酶基因而言，它們不僅限于細(xì)胞自身的功能基因，本發(fā)明的保護(hù)范圍只受權(quán)利要求書的限制。將實(shí)施例中所使用的啟動(dòng)子和表達(dá)載體替換為本領(lǐng)域中常用的其它組成型表達(dá)的啟動(dòng)子(如adh1啟動(dòng)子、tpi啟動(dòng)子等)或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如gal1啟動(dòng)子)和表達(dá)載體，或這2個(gè)功能基因也可以用相同功能的其它多核苷酸替換，這是本領(lǐng)域工作人員所能夠理解并實(shí)現(xiàn)的。

3.本發(fā)明中編碼大腸桿菌磷酸葡萄糖變位酶pgm和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶galu的多核苷酸

在實(shí)施例中工程化的釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)異源的pgm、galu基因，其相應(yīng)的多核苷酸是直接從大腸桿菌基因組中利用常規(guī)pcr方法擴(kuò)增獲得的，然后與釀酒酵母gap啟動(dòng)子或畢赤酵母gap啟動(dòng)子和pgk終止子構(gòu)建成融合基因，再通過同源替換的方式到整合到釀酒酵母基因組中，參與udp-葡萄糖合成的來自其它異源生物的磷酸葡萄糖變位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶通過高表達(dá)同樣可以用于促進(jìn)udp-葡萄糖的合成，進(jìn)而提高細(xì)胞代謝池內(nèi)udp-葡萄糖的水平；說明這2個(gè)功能基因也可以用相同功能的其它多核苷酸替換，這是本領(lǐng)域工作人員所能夠理解并實(shí)現(xiàn)的。

4.本發(fā)明中編碼尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶ugt的多核苷酸

本發(fā)明中將來源于植物黃芩的糖基轉(zhuǎn)移酶基因sbgt34亞克隆到表達(dá)載體得到質(zhì)粒ptwinb-ugt34^#(中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01410185256.4中seqidno:29)。以連接到ptwinb-ugt34^#質(zhì)粒為模板，用pcr擴(kuò)增獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因，再經(jīng)過ndei和xbai雙酶切連接到pδgapg載體上獲得釀酒酵母整合型質(zhì)粒。為提高其在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的活性，將該基因亞克隆到已高表達(dá)磷酸葡萄糖變位酶和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的工程菌中w303-1b/es/pu和w303-1b/es/peg，使其3個(gè)基因共表達(dá)，形成一個(gè)生物催化黃酮葡萄糖苷化的代謝途徑，即獲得具有高效催化黃酮類化合物葡萄糖苷化的工程化釀酒酵母細(xì)胞。

5.黃酮類化合物葡萄糖苷化反應(yīng)及其產(chǎn)物分析

本發(fā)明中所用載體都是整合型表達(dá)載體，整合入基因組中的外源基因隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而表達(dá)。在ypd液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的工程化細(xì)胞生長(zhǎng)到od600nm約為3.0左右，轉(zhuǎn)接入sc液體培養(yǎng)基中(1/100體積比)，生長(zhǎng)約10h，通過利用新鮮的sc液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞生物量至od600nm為1.0，將調(diào)節(jié)后的菌液分裝于反應(yīng)瓶中，往菌液中加入10μl溶于dmso的黃酮類化合物，使其終濃度為0.6mm，于30℃反應(yīng)，取樣1ml，冷凍干燥，冷干樣品加入500ul熱甲醇超聲萃取3次，合并萃取液后揮干所有甲醇，再用1ml甲醇溶解提取物，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后高效液相色譜分析催化產(chǎn)物。

通過以下的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。

需要注意的是，除非特別指明，下面實(shí)施例中所用的各種材料和試劑都是本領(lǐng)域中常用的材料和試劑，可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑獲得；所用方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法。

實(shí)施例1：釀酒酵母工程菌的制備

步驟一：釀酒酵母基因組dna提?。翰捎帽本┛禐槭兰o(jì)生物科技有限公司的酵母基因組dna提取試劑盒提取基因組dna，具體操作步驟如下：

(1)挑單克隆接菌于10ml液體ypd(10g/lyeastextract,20g/ltryptone，20g/lglucose)培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)15-20h(對(duì)數(shù)期)。

(2)12000rpm，1min多次離心收集菌體于1.5mlep管中(4-5次)，離心棄上清。

(3)酵母細(xì)胞壁的去除：向菌體中加入600μllyticaseworkingbuffer(使用前加入β-巰基乙醇，使其終濃度為0.1％)，并加入5μllyticase(10u/μl)，充分混勻，30℃處理30min，4000rpm離心10min，棄上清，收集沉淀。

(4)向沉淀中加入200μlbuffergtl，加入40mg玻璃珠(glassbeads)，渦旋5min，12000rpm離心5min，將上清移到一個(gè)新的離心管中。

(5)加入20μlproteinasek，混勻，55℃振蕩水浴1h，溫育期間每20-30min顛倒混勻一次，然后加入10μl濃度為20mg/ml的rnasea溶液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

(6)13000rpm離心5min，小心吸取上清至新離心管中。

(7)加入200μlbuffergl，充分混勻。70℃孵育10min，其間顛倒混勻數(shù)次。

(8)加入200μl無水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，短暫離心，使管壁和管蓋上的液體集中到管底。

(9)將步驟8所得溶液和沉淀全部加入到已裝入收集管(collectiontube)的吸附柱(spincolumndm)中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

(10)向吸附柱中加入500μlbuffergw1，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

(11)向吸附柱中加入500μlbuffergw2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

(12)12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。

(13)將吸附柱置于一個(gè)新的離心管中，向吸附柱的中間部位懸空加入100μlbufferge或滅菌水，室溫放置2-5min，10000rpm離心1min，收集dna溶液，-20℃保存dna。

步驟二：釀酒酵母exg1基因克隆和同源整合表達(dá)載體ez-exg1-trp的構(gòu)建

以基因數(shù)據(jù)庫genbank注冊(cè)號(hào)為m34341的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成pcr反應(yīng)引物：

以釀酒酵母w303-1b的基因組dna為模板，用引物exg1_1/exg1_8進(jìn)行第一輪pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用引物exg1_2/exg1_4和exg1_5/exg1_7進(jìn)行exg1基因5′和3′兩個(gè)片段的nested-pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二輪pcr擴(kuò)增得到的兩條片段有互補(bǔ)區(qū)段，通過pcr的方式把兩條片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,60s；72℃，1min，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接產(chǎn)物為模板，用引物exg1_3/exg1_6進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一條長(zhǎng)約為1009bp的dna片段。從瓊脂糖凝膠中純化目的dna片段，然后用限制性內(nèi)切酶kpni和saci雙酶切，再與用相同的內(nèi)切酶酶切的載體ez-t(genstar康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)進(jìn)行dna連接反應(yīng)，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，使用通用測(cè)序引物m13f和m13r進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，即得到含有exg1基因同源片段的質(zhì)粒ez-exg1。

為實(shí)現(xiàn)exg1基因敲除后便于篩選，選擇篩選標(biāo)記trp。具體做法為：用引物trp_exg1和trp_exg2和野生型釀酒酵母基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得trp篩選標(biāo)記的dna片段，瓊脂糖凝膠純化dna片段用nhei和hpai雙酶切后與用nhei和hpai雙酶切的ez-exg1進(jìn)行dna連接反應(yīng)，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，即得到如seqidno1所示的含有exg1同源片段和篩選標(biāo)記表達(dá)框trp的質(zhì)粒ez-exg1-trp，其中第1-450和第1674-2216堿基序列為exg1同源片段，第451-1673堿基序列包括篩選標(biāo)記trp基因啟動(dòng)子、開放閱讀框和終止子的整個(gè)表達(dá)框。通過noti單酶切線性化后，通過liac轉(zhuǎn)化法把同源dna片段整合至釀酒酵母基因組中。圖3a是構(gòu)建的質(zhì)粒圖及同源重組的示意圖

步驟三：釀酒酵母spr1基因克隆和同源整合載體ez-spr1-ade2的構(gòu)建

以genbank注冊(cè)號(hào)為nm_001183609的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成pcr反應(yīng)引物如下：

以釀酒酵母w303-1b的基因組dna為模板，用引物spr1_1/spr1_8進(jìn)行第一輪pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用引物spr1_2/spr1_4和spr1_5/spr1_7進(jìn)行spr1基因5′和3′兩個(gè)片段的nested-pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二輪pcr擴(kuò)增得到的兩條片段有互補(bǔ)區(qū)段，通過pcr的方式把兩條片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,60s；72℃，1min，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接產(chǎn)物為模板，用引物spr1_3/spr1_6進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一條長(zhǎng)約為1056bp的dna片段。從瓊脂糖凝膠中純化目的dna片段，然后用限制性內(nèi)切酶kpni和saci雙酶切，再與用相同的內(nèi)切酶酶切的載體ez-t(genstar康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)進(jìn)行dna連接反應(yīng)，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，使用通用測(cè)序引物m13f和m13r進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，即得到含有spr1基因同源片段的質(zhì)粒ez-spr1。

為實(shí)現(xiàn)spr1基因敲除后的篩選鑒定，選擇篩選標(biāo)記ade2。具體做法為：用引物ade2_spr1和ade2_spr2和野生型釀酒酵母基因組dna為模板為模板獲得ade2片段，瓊脂糖凝膠純化ade2片段用sphi和spei雙酶切后與用sphi和nhei雙酶切的ez-spr1進(jìn)行dna連接反應(yīng)，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，即得到seqidno2所示含有spr1同源片段和ade2篩選標(biāo)記基因的質(zhì)粒ez-spr1-ade2，其中第1-575和第2839-3292堿基序列為spr1同源片段，第576-2838堿基序列包括ade2基因啟動(dòng)子、開放閱讀框和終止子的整個(gè)表達(dá)框。質(zhì)粒ez-spr1-ade2用saci線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中。圖3b是構(gòu)建的質(zhì)粒圖及同源重組的示意圖。

步驟四：釀酒酵母yir007w基因克隆和同源整合載體ez-yir-ura3的構(gòu)建

以genbank注冊(cè)號(hào)為nm_001179529的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成pcr反應(yīng)引物：

以釀酒酵母w303-1b的基因組dna為模板，用引物yir_1/8進(jìn)行第一輪pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用引物yir_2/4和yir_5/7進(jìn)行yir基因5′和3′兩個(gè)片段的nested-pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二輪pcr擴(kuò)增得到的兩條片段有互補(bǔ)區(qū)段，通過pcr的方式把兩條片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,60s；72℃，1min，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接產(chǎn)物為模板，用引物yir_3/6進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一條長(zhǎng)約為1050bp的dna片段。從瓊脂糖凝膠中純化目的dna片段，然后用限制性內(nèi)切酶kpni和saci雙酶切，再與用相同的內(nèi)切酶酶切的載體ez-t(genstar康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)進(jìn)行dna連接反應(yīng)，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，使用通用測(cè)序引物m13f和m13r進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，即得到含有yir007w基因同源片段的質(zhì)粒ez-yir。

為實(shí)現(xiàn)yir007w基因敲除后的篩選鑒定，選擇ura3篩選標(biāo)記。具體做法為：用引物ura3_yir1和ura3_yir2和和野生型釀酒酵母基因組dna為模板為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得ura3基因片段，瓊脂糖凝膠純化ura3片段用sphi和nhei雙酶切后與用sphi和nhei雙酶切的ez-yir進(jìn)行dna連接反應(yīng)，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，即得到如seqidno3所示的含有yir007w基因同源片段和ura3篩選標(biāo)記基因的質(zhì)粒ez-yir-ura3，其中第1-508和第1640-2164堿基序列為yir007w同源片段，第509-1639堿基序列包括ura3基因啟動(dòng)子、開放閱讀框和終止子的整個(gè)表達(dá)框。質(zhì)粒ez-yir-ura3用saci線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中。圖3c是構(gòu)建的質(zhì)粒圖及同源重組的示意圖。

步驟五：釀酒酵母pgm2基因的克隆和整合表達(dá)載體pδgap′g-pgm2的構(gòu)建

以基因數(shù)據(jù)庫genbank注冊(cè)號(hào)為nm_001182605的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成pcr反應(yīng)引物：

由于釀酒酵母w303-1b的pgm2基因含有2個(gè)限制性內(nèi)切酶ndei位點(diǎn)和1個(gè)限制性內(nèi)切酶kpni位點(diǎn)，不適合于表達(dá)載體的構(gòu)建，于是合成pcr引物進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增和閱讀框的拼接。首先以釀酒酵母w303-1b的基因組dna為模板，用引物pgm_y1/pgm_y9進(jìn)行第一輪pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用引物pgm_y5/pgm_y6和pgm_y7/pgm_y8進(jìn)行pgm基因3′端的dna片段(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，30s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二輪pcr擴(kuò)增得到的兩條片段有互補(bǔ)區(qū)段，通過pcr的方式把兩條片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,50s；72℃，45s，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接產(chǎn)物為模板，用引物pgm_y5/pgm_y8進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，43℃，50s，72℃，45s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一條長(zhǎng)約為568bp的dna片段；然后進(jìn)行“ta”克隆到ez-t載體上，即得到ez-pgm58；同樣利用第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用引物pgm_y3/pgm_y4的nested-pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，pcr擴(kuò)增獲得pgm5′端的1027bpdna片段，然后進(jìn)行“ta”克隆到ez-t載體上，即得到ez-pgm34；再利用這2個(gè)片段內(nèi)的ncoi進(jìn)行閱讀框的拼接，即得到ez-pgm38；最后再利用質(zhì)粒ez-pgm38為模板和引物pgm_y2/pgm_y8進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，即獲得編碼seqidno4所示的氨基酸殘基序列的長(zhǎng)度為1710bp(seqidno5)的dna片段，再利用限制性內(nèi)切酶ndei和xbai酶切與經(jīng)ndei和nhei酶切的質(zhì)粒pδgap′g(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)進(jìn)行dna連接反應(yīng)，該質(zhì)粒載體pδgap′g含有甲醇酵母gap啟動(dòng)子、釀酒酵母δ整合位點(diǎn)、釀酒酵母pgk1終止子和可用g418進(jìn)行篩選的標(biāo)記基因kanmx，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，即得到釀酒酵母整合型質(zhì)粒pδgap′g-pgm2。質(zhì)粒再用noti線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中。

步驟六：釀酒酵母ugp1基因的克隆和整合表達(dá)載體pδgaph-ugp1的構(gòu)建

以genbank注冊(cè)號(hào)為nm_001179601的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成pcr反應(yīng)引物：

由于釀酒酵母w303-1b的ugp1基因含有限制性內(nèi)切酶kpni、xbaincoi、ecori、sali,bglii位點(diǎn)，不適合于表達(dá)載體的構(gòu)建，于是合成pcr引物進(jìn)行基因片段的擴(kuò)增和閱讀框的拼接。首先以釀酒酵母w303-1b的基因組dna為模板，用引物ugp1_1/ugp1_8進(jìn)行第一輪pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)。再利用第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用引物ugp1_2/ugp1_3和ugp1_4/ugp1_5進(jìn)行ugp1基因5′端的dna片段(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，30s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，由于第二輪pcr擴(kuò)增得到的兩條片段有互補(bǔ)區(qū)段，通過pcr的方式把兩條片段拼接(95℃，5min；95℃，50s；43℃,50s；72℃，45s，7cycles；72℃，10min；4℃，10min)。最后以pcr拼接產(chǎn)物為模板，用引物ugp1_2/ugp1_5進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，43℃，50s，72℃，45s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一條長(zhǎng)約為550bp的dna片段；然后進(jìn)行“ta”克隆到ez-t載體上，即得到ez-ugp25；同樣利用第一輪pcr產(chǎn)物為模板，用引物ugp1_6/ugp1_7的nested-pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，50s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，pcr擴(kuò)增獲得pgm3′端的957bpdna片段，然后進(jìn)行“ta”克隆到ez-t載體上，即得到ez-ugp67；再利用bamhi和xbai酶切純化回收獲得ugp67片段，然后亞克隆到用bglii和xbai酶切處理的質(zhì)粒ez-ugp25上，連接轉(zhuǎn)化篩選獲得陽性克隆，測(cè)序驗(yàn)證獲得含有完整的ugp1閱讀框的質(zhì)粒ez-ugp27；最后再利用質(zhì)粒ez-ugp27為模板和引物ugp1_2/ugp1_7進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，即獲得編碼seqidno6所示的氨基酸殘基序列的長(zhǎng)度為1500bp(seqidno7)的dna片段，再利用限制性內(nèi)切酶ndei和spei酶切與經(jīng)ndei和nhei酶切的質(zhì)粒pδgaph(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)進(jìn)行dna連接反應(yīng)，該質(zhì)粒載體pδgaph含有釀酒酵母gap啟動(dòng)子、釀酒酵母δ整合位點(diǎn)、釀酒酵母pgk1終止子和可用潮霉素進(jìn)行篩選的標(biāo)記基因hygb，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，即得到釀酒酵母整合型質(zhì)粒pδgaph-ugp1。質(zhì)粒再用noti線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中。

步驟七：大腸桿菌的pgm基因的克隆和整合表達(dá)載體pδgaph-pgm的構(gòu)建

以genbank注冊(cè)號(hào)eg12144的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成pcr反應(yīng)引物：

以大腸桿菌的基因組dna為模板，用引物pgm_1/pgm_4進(jìn)行第一輪pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，2.0min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min),再第1輪以pcr產(chǎn)物為模板，用引物pgm_2/pgm_3進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，50s，72℃，1.5min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一條長(zhǎng)約為1.6kb的dna片段；然后用限制性內(nèi)切酶ndei和nhei酶切,再與經(jīng)ndei和nhei酶切的質(zhì)粒pδgaph(tangl,wangw,etal.three-pathwaycombinationforglutathionebiosynthesisinsaccharomycescerevisiae.microbcellfact,2015,14:139)進(jìn)行dna連接反應(yīng)，該質(zhì)粒載體pδgaph含有釀酒酵母gap啟動(dòng)子、釀酒酵母δ整合位點(diǎn)、釀酒酵母pgk1終止子和可用潮霉素進(jìn)行篩選的標(biāo)記基因hygb，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，即得到釀酒酵母整合型質(zhì)粒pδgaph-pgm。質(zhì)粒再用noti線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中。

步驟八：大腸桿菌的galu基因的克隆和整合表達(dá)載體pδgap′z-galu的構(gòu)建

以genbank注冊(cè)號(hào)np_415752的核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成pcr反應(yīng)引物：

以大腸桿菌的基因組dna為模板，用引物galu_1/galu_4進(jìn)行第一輪pcr(95℃，5min；95℃，50s，50℃，1min，72℃，1min，30cycles；72℃，10min；4℃，10min),再第1輪以pcr產(chǎn)物為模板，用引物galu_2/galu_3進(jìn)行pcr擴(kuò)增(95℃，5min；95℃，50s，50℃，50s，72℃，50s，30cycles；72℃，10min；4℃，10min)，得到一條長(zhǎng)約為0.9kb的dna片段；然后用限制性內(nèi)切酶ndei和nhei酶切,再與經(jīng)ndei和nhei酶切的質(zhì)粒pδgap′z進(jìn)行dna連接反應(yīng)；其中質(zhì)粒pδgap′z是用引物tyr-zh1/tyr-ze1和質(zhì)粒ppiczαa為模板經(jīng)pcr擴(kuò)增得到博來霉素(zeocin)篩選標(biāo)記基因，再置換質(zhì)粒pδgap′g上的標(biāo)記基因kanmx，該質(zhì)粒載體pδgap′z含有甲醇酵母gap啟動(dòng)子、釀酒酵母δ整合位點(diǎn)、釀酒酵母pgk1終止子和可用博來霉素進(jìn)行篩選的標(biāo)記基因zeocin，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，即得到釀酒酵母整合型質(zhì)粒pδgap′z-galu。質(zhì)粒再用noti線性化后通過liac轉(zhuǎn)化法把目的片段整合至釀酒酵母基因組中。

步驟九：釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞制備及l(fā)iac轉(zhuǎn)化方法

(1)挑單克隆接菌于25ml液體ypd培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)16-18h至od600約為0.8-1.0。

(2)將菌液分裝于數(shù)個(gè)1.5mlep管中(4管為一次轉(zhuǎn)化的感受態(tài)量)，每管1.5ml，1500rpm離心5min，棄上清，750μl滅菌水清洗后1500rpm離心5min，棄去上清。

(3)每管用30μl，100mmliac重懸并將4管合并為一管，12000rpm離心15s，棄上清，用50μl100mmliac重懸即為感受態(tài)細(xì)胞(現(xiàn)用現(xiàn)做)。

(4)將2mg/ml的單鏈鮭魚精載體dna(ssdna)煮沸5min，迅速置于冰上冷卻。

(5)感受態(tài)細(xì)胞12000rpm離心15s，棄上清。

(6)按順序加入240μl500g/lpeg(peg3350)，36μlliac(1m)，25μlssdna，50μl質(zhì)粒(2-3μg，若線性化整合則需10-20μg線性化質(zhì)粒)，漩渦劇烈混勻1min。

(7)30℃靜置孵育30min，42℃水浴熱擊60min，其間顛倒混勻數(shù)次。

(8)離心棄上清，加入ypd培養(yǎng)基復(fù)性2h。

(9)離心棄去部分上清，吹打混勻，涂于含有相應(yīng)抗生素平板或缺陷性篩選標(biāo)記的平板上篩選，30℃培養(yǎng)3d。

(10)將獲得的菌株轉(zhuǎn)接于含高濃度抗生素或缺陷性篩選標(biāo)記的平板上進(jìn)行高拷貝整合陽性克隆復(fù)篩。

目的基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入工程菌后都需要提取釀酒酵母基因組，通過pcr鑒定酵母基因組的方式確定目的基因是否轉(zhuǎn)入釀酒酵母工程菌中，pcr鑒定完成后以各基因的引物測(cè)序進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

步驟十：酵母葡萄糖苷酶基因的的敲除

釀酒酵母w303-1b基因組中3個(gè)葡萄糖苷酶exg1、spr1和yir007w基因敲除過程如下：首先利用限制性內(nèi)切酶noti或saci線性化的同源整合質(zhì)粒dna，然后采用liac轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞，利用營(yíng)養(yǎng)缺餡型篩選標(biāo)記ade2、trp、ura3進(jìn)行陽性克隆篩選。提取陽性克隆的基因組，再利用3組引物exg1_3/exg1_6、spr1_3/spr1_6、yir_3/yir_6分別對(duì)被敲除exg1、spr1和yir007w三個(gè)基因的陽性工程菌株進(jìn)行pcr擴(kuò)增鑒定。圖4是三個(gè)葡萄糖苷酶exg1、spr1和yir007w基因敲除后的pcr擴(kuò)增dna片段的電泳分析，結(jié)果表明都能擴(kuò)增出預(yù)期的整合dna片段，再純化pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

步驟十一：敲除糖苷水解酶后對(duì)黃酮7-o-葡萄糖苷水解活性的分析

釀酒酵母w303-1b(matαade2-1leu2-3,112his3-11,15ura3-1trp1-1)胞內(nèi)糖苷酶的初步鑒定：將活化在ypd固體平板上的w303-1b單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm過夜培養(yǎng)至od6003.0左右，轉(zhuǎn)接于sc液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h左右用新鮮的sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)od600至1.0后，將調(diào)節(jié)后的菌體分裝于滅菌的100ml三角瓶中，每個(gè)三角瓶分裝10ml菌液。分裝完成后直接往菌液中加入木犀草素7-o-葡萄糖苷作為底物，反應(yīng)6h后取樣hplc檢測(cè)野生型釀酒酵母對(duì)木犀草素7-o-葡萄糖苷的水解情況，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果可知野生型釀酒酵母w303-1b胞內(nèi)存在糖苷酶。

以葡萄糖苷酶基因敲除菌株w303-1b/exg1、w303-1b/spr1和w303-1b/yir007w為實(shí)驗(yàn)組，原始菌w303-1b為對(duì)照組鑒定三個(gè)糖苷酶敲除完成后對(duì)木犀草苷的水解情況以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。以木犀草素7-o-葡萄糖苷為底物鑒定糖苷酶敲除完成后對(duì)黃酮葡萄糖苷水解活性的變化，具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的各工程菌單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600nm到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始光密度od600nm為1.0，把調(diào)節(jié)光密度od600后的工程菌液1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每種工程菌3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入木犀草苷為反應(yīng)底物，使得木犀草苷的終濃度為0.2mm，30℃，165rpm反應(yīng)。

(4)分別于反應(yīng)1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22um濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖5和表1所示糖苷酶基因敲除后對(duì)木犀草素7-o-葡萄糖苷的水解活性大大降低，其中exg1是胞內(nèi)糖苷水解酶的主效基因；spr1基因敲除能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。

表1.

a.

b.

步驟十二：編碼黃芩ugt的表達(dá)載體構(gòu)建和酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化

以中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01410185256.4中克隆得到的質(zhì)粒ptwinb-ugt34#為模板，用引物sbugt_n1和sbugt_x1擴(kuò)增獲得糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段：

sbugt_n1：agatatacatatgggacaactccacatagtccttg(劃線為ndei位點(diǎn))

sbugt_x1：gagctctctagactagtttaagccctgtttcataggagg(劃線為xbai位點(diǎn))

pcr擴(kuò)增獲得的糖基轉(zhuǎn)移酶基因片段用ndei和xbai雙酶切后與用ndei和nhei雙酶切的pδgapg載體進(jìn)行dna連接反應(yīng)，經(jīng)cacl2轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，篩選獲得陽性克隆，使用引物sbugt_n1和sbugt_x1進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，即得到pδgapg-sbgt34整合型表達(dá)載體。利用限制性內(nèi)切酶noti線性化質(zhì)粒，然后采用liac轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入釀酒酵母細(xì)胞w303-1b和w303-1b/es(e表示exg1基因敲除，s表示spr1基因敲除)即可獲得工程菌株w303-1b/sbgt34和w303-1b/es/sbgt34。

工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34構(gòu)建過程如下：首先用限制性內(nèi)切酶noti線性化質(zhì)粒pδgap′g-pgm2和pδgaph-ugp1轉(zhuǎn)化敲除了糖苷水解酶exg1和spr1基因的工程菌w303-1b/es，利用g418和潮霉素進(jìn)行陽性克隆的篩選鑒定；然后使用cre-loxp重組系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒psh47-zeocin(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)到陽性克隆，其表達(dá)重組酶cre能切除基因組中l(wèi)oxp-marker-loxp結(jié)構(gòu)中l(wèi)oxp位點(diǎn)間的g418或潮霉素抗性基因，留下一個(gè)loxp位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)抗性篩選標(biāo)記重復(fù)使用，即獲得工程菌株w303-1b/es/pu(p表示整合pgm2基因進(jìn)入宿主基因組，u表示整合ugp1基因進(jìn)入宿主基因組)；最后再用noti線性化質(zhì)粒pδgapg-sbgt34轉(zhuǎn)化工程宿主細(xì)胞w303-1b/es/pu，再使用g418抗性進(jìn)行篩選即可以獲得菌種編號(hào)為cgmccno.11381的工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34。

工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34構(gòu)建過程如下：首先用限制性內(nèi)切酶noti線性化質(zhì)粒pδgaph-pgm和pδgap′z-galu轉(zhuǎn)化敲除了糖苷水解酶exg1和spr1基因的工程菌w303-1b/es，利用潮霉素和博來霉素進(jìn)行陽性克隆的篩選鑒定；獲得工程菌株w303-1b/es/peg(pe表示整合pgm基因進(jìn)入宿主基因組，g表示整合galu基因進(jìn)入宿主基因組)；最后再用noti線性化質(zhì)粒pδgapg-sbgt34轉(zhuǎn)化工程宿主細(xì)胞w303-1b/es/peg，再使用g418抗性進(jìn)行篩選即可以獲得菌種編號(hào)為cgmccno.12057的工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34。

實(shí)施例2：敲除糖苷水解酶的工程菌轉(zhuǎn)入糖基轉(zhuǎn)移酶sbgt34催化野黃芩素活性分析

工程菌w303-1b/es/sbgt34為實(shí)驗(yàn)組。以原始菌w303-1b為基礎(chǔ)通過liac轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化獲得只含有糖基轉(zhuǎn)移酶sbgt34的工程菌w303-1b/sbgt34；敲除糖苷水解酶exg1和spr1基因的工程菌為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)入糖基轉(zhuǎn)移酶基因sbgt34獲得工程菌w303-1b/es/sbgt34。以野黃芩素為底物鑒定糖苷水解酶敲除完成前后對(duì)黃酮底物糖苷化活性的變化，具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始o(jì)d600為1.0，把調(diào)節(jié)光密度后的工程菌1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每種工程菌3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入野黃芩素為反應(yīng)底物，使得野黃芩素的終濃度為0.2mm，30℃，165rpm反應(yīng)。

(4)分別于反應(yīng)3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖6和表2所示敲除了糖苷酶exg1、spr1的工程菌w303-1b/es/sbgt34對(duì)野黃芩素的轉(zhuǎn)化率從對(duì)照w303-1b/sbgt34的37％提高到了76％。

表2.

實(shí)施例3：釀酒酵母糖代謝途徑pgm2和ugp1基因?qū)こ叹呋S酮底物轉(zhuǎn)化率的影響

以工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34為實(shí)驗(yàn)組，工程菌w303-1b/es/sbgt34為對(duì)照組鑒定pgm2和ugp1基因?qū)こ叹呋S酮底物轉(zhuǎn)化率的影響。以野黃芩素為底物鑒定糖苷水解酶敲除完成前后對(duì)黃酮底物糖苷化活性的變化，具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始o(jì)d為1.0，把調(diào)節(jié)od后的工程菌1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每種工程菌3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入野黃芩素為反應(yīng)底物，使得野黃芩素的終濃度為0.2mm，30℃，165rpm反應(yīng)。

(4)分別于反應(yīng)3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)室的反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖6所示釀酒酵母糖代謝途徑pgm2和ugp1基因的表達(dá)能提高細(xì)胞udp-葡萄糖的合成，工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34對(duì)野黃芩素的轉(zhuǎn)化率從對(duì)照w303-1b/es/sbgt34的76％提高到了92％。

實(shí)施例4：大腸桿菌糖代謝途徑pgm和galu基因?qū)こ叹呋S酮底物轉(zhuǎn)化率的影響

以工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34為實(shí)驗(yàn)組，工程菌w303-1b/es/sbgt34為對(duì)照組鑒定pgm和galu基因?qū)こ叹呋S酮底物轉(zhuǎn)化率的影響。以野黃芩素為底物鑒定糖苷水解酶敲除完成前后對(duì)黃酮底物糖苷化活性的變化，具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始o(jì)d為1.0，把調(diào)節(jié)od后的工程菌1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每種工程菌3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入野黃芩素為反應(yīng)底物，使得野黃芩素的終濃度為0.2mm，30℃，165rpm反應(yīng)。

(4)分別于反應(yīng)3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取出3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)室的反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖6所示大腸桿菌糖代謝途徑pgm和galu基因的表達(dá)能提高細(xì)胞udp-葡萄糖的合成，工程菌w303-1b/es/peg/sbgt34對(duì)野黃芩素的轉(zhuǎn)化率從對(duì)照w303-1b/es/sbgt34的76％提高到了84％。

實(shí)施例5：不同濃度野黃芩素對(duì)工程菌轉(zhuǎn)化率以及生長(zhǎng)的影響

選取工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34為催化工程菌，野黃芩素底物終濃度分別為0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm和1.0mm。具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始光密度od600為1.0，把調(diào)節(jié)光密度od600后的工程菌1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每種濃度梯度3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入相同體積的野黃芩素(10ul)為反應(yīng)底物，使得野黃芩素的終濃度為0.2mm、0.4mm、0.6mm、0.8mm和1.0mm(母液濃度不同)，30℃，165rpm反應(yīng)。

(4)分別于反應(yīng)3h、6h、12h、24h、48h、72h取出3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組的反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。3次萃取液的甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22um濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖7和表3所示不同濃度的底物轉(zhuǎn)化率存在較大差異，底物濃度過高是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用。

表3.

a.

b.

實(shí)施例6：不同濃度葡萄糖和ph條件對(duì)釀酒酵母工程菌轉(zhuǎn)化黃酮底物的影響葡萄糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：

選取工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34為催化工程菌，野黃芩素底物終濃度分別為0.6mm，葡萄糖終濃度分別為2％、5％、10％和15％。具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始光密度od600為1.0，把調(diào)節(jié)光密度od600后的工程菌1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每個(gè)葡萄糖濃度3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入10ul野黃芩素使得終濃度為0.6mm，30℃，165rpm反應(yīng)。

(4)于反應(yīng)96h取出反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并后的萃取液甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖8a和表4a所示，葡萄糖濃度的提高能促進(jìn)底物的轉(zhuǎn)化，在葡萄糖濃度為10％時(shí)轉(zhuǎn)化率較高。

ph條件對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響：

選取工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34為催化工程菌，野黃芩素底物終濃度分別為0.6mm，葡萄糖終濃度為10％，ph梯度分別為4.5、5.0、5.5、6.0，ck為沒有加入磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)自然狀態(tài)下的轉(zhuǎn)化率，具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始光密度od600為1.0，把調(diào)節(jié)初始光密度od600后的工程菌1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每個(gè)葡萄糖濃度3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入10ul野黃芩素使得終濃度為0.6mm，30℃，165rpm反應(yīng)。

(4)于反應(yīng)96h取出反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并后的萃取液甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖8b和表4b所示不同ph條件對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響，在ph為5.5時(shí)轉(zhuǎn)化率較高。

表4.

a.

b.

實(shí)施例7：10-l發(fā)酵罐放大培養(yǎng)合成黃酮葡萄糖苷類化合物

工程菌為w303-1b/es/pu/sbgt34，底物為野黃芩素，具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)測(cè)定其od值，加入適量的菌液值至含4-lsc培養(yǎng)基的10-l發(fā)酵罐中，使得其初始o(jì)d值為1.0。

(4)分別于發(fā)酵0h和12h加入40ml和80ml(濃度為100mm)野黃芩素底物，發(fā)酵條件為：溫度為30℃，溶氧為25％，ph為5.5。

(5)分別于發(fā)酵6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h和72h取樣用于檢測(cè)底物轉(zhuǎn)化生成黃酮-o-葡萄糖苷的情況。

(6)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出的1ml樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并萃取液的甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm濾膜過濾后樣品后hplc分析。結(jié)果如圖9和表5所示發(fā)酵放大能大大提高黃酮底物的轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)量能從搖瓶轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的215mg/l提高到了1200mg/l。

表5.

實(shí)施例8：工程菌w303-1b/es/pu/sbgt34對(duì)不同黃酮類底物的生物催化

工程菌為w303-1b/es/pu/sbgt34，底物分別為木犀草素、柚皮素、白楊素、漢黃芩素、木蝴蝶素a、野黃芩素、黃芩素、槲皮素以及大豆黃酮，具體做法如下：

(1)轉(zhuǎn)化生成的單克隆接種于ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，220rpm，培養(yǎng)至od600到3.0左右。

(2)按1％的接種量轉(zhuǎn)接到sc合成培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)約10h。

(3)用sc培養(yǎng)基調(diào)節(jié)生物量，使得初始光密度od600為1.0，把調(diào)節(jié)光密度od600后的工程菌1ml分裝于5ml反應(yīng)瓶中，每個(gè)反應(yīng)瓶中加入相同體積的不同底物，并使得各底物中終濃度為0.6mm，此外每個(gè)底物有3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

(4)于反應(yīng)96h后取出所有反應(yīng)瓶，取出樣品冷干后用500ul甲醇萃取3次。合并后的萃取液甲醇完全揮干后，再用1ml甲醇溶解萃取物，0.22μm濾膜過濾后樣品后hplc分析(如圖10所示)。圖11和表6為各催化底物反應(yīng)完成后工程菌對(duì)各底物的相對(duì)催化活性。

表6.