專利名稱：一株芽孢桿菌utm03及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種芽孢桿菌菌株UTM03及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
污泥是污水廠處理廢水所產(chǎn)生的固態(tài)廢棄物。隨著現(xiàn)有污水處理廠數(shù)量的不斷增多與處理工藝的不斷革新，污水處理量和處理程度的不斷提高，污泥產(chǎn)量明顯增加。目前，多數(shù)污水處理廠處置污泥的方法主要有焚燒、填埋、投海以及堆肥。相對(duì)而言，污泥高溫堆肥是通過好氧微生物的生物代謝作用，放出熱量，使有機(jī)物轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的腐殖質(zhì)的過程，其處理成本低廉、可有效殺滅病原菌、寄生蟲卵和雜草種籽，并能使水分蒸發(fā)，實(shí)現(xiàn)污泥穩(wěn)定 化、無害化、減量化。污泥高溫堆肥處理工藝既可作為土地利用的前處理手段，又可作為降低污泥含水率，提高污泥熱值的預(yù)處理手段，是一種積極有效的污泥處理方式。在污泥高溫堆肥過程中，由于微生物的代謝作用，堆體的溫度會(huì)上升，先后經(jīng)歷中溫階段、高溫階段和降溫階段。堆肥高溫期，堆體最高溫度可達(dá)60-70°C以上，堆體中絕大部分的寄生蟲、蟲卵、孢子和病原菌等被殺死，是保證堆肥無害化的最重要階段。然而，此時(shí)由于微生物有機(jī)體的重要組成物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸等對(duì)溫度敏感，將隨著溫度的升高遭受不可逆的破壞而導(dǎo)致機(jī)體的死亡，使微生物種群活性受到很大的抑制，表現(xiàn)為種類單一，數(shù)量減少，比中溫階段要少I 2個(gè)數(shù)量級(jí)，這無疑限制了有機(jī)物質(zhì)的快速降解。研究表明，芽孢桿菌屬微生物是污泥堆肥高溫期的主要優(yōu)勢(shì)菌之一，但大多以孢子的形式存在，致使原有物料中有效菌數(shù)量不足，如能從污泥高溫期堆肥中將這些有效菌篩選出來，并接種至污泥堆肥中，增加污泥高溫期堆肥的有效活菌數(shù)，無疑對(duì)于促進(jìn)污泥堆肥進(jìn)程及其無害化將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，將芽孢桿菌應(yīng)用于堆肥的菌種主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，但這些菌株均為中溫菌，在促進(jìn)堆肥進(jìn)入高溫期后，由于無法忍受高溫的環(huán)境，將失去菌體活性。如專利(申請(qǐng)?zhí)?00910035641.X)中所用的高溫微生物菌種土芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的篩選溫度是50°C，并不能保證在70°C以上的污泥堆肥高溫期中仍具活性。因此，此類的常規(guī)堆肥接種劑所得堆肥產(chǎn)品缺乏足夠的有效嗜熱微生物種群，每次進(jìn)行堆肥時(shí)都需重新制備菌劑，這大大增加了污泥堆肥的工作量和成本，也忽視了堆肥返料作為濕污泥的優(yōu)良調(diào)理劑的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種芽孢桿菌(Bacillus sp.)及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的菌株為芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株，是以高溫期污泥堆肥作為分離源，在70°C下經(jīng)富集分離純化得到的，命名為Bacillus sp. UTM 03。采用形態(tài)觀察法和16S rRNA序列測(cè)定相結(jié)合的方法，將該菌鑒定為芽孢桿菌(Bacillus sp.)，并將其命名為芽孢桿菌UTM03。該菌株已于2011年12月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為芽孢桿菌Bacillus sp.，保藏號(hào)為CGMCC No. 5643。嗜熱芽孢桿菌菌株UTM03在LB固體培養(yǎng)基平板上的培養(yǎng)I天后特征是單菌落為淡黃色，圓形，直徑約3mm，表面濕潤，中央扁平，邊緣波狀。其溫度生長特性是在LB固體培養(yǎng)基平板上，挑取單菌落劃線在65-70°C下暗箱培養(yǎng)12-24小時(shí)，便可形成明顯菌落。其菌體細(xì)胞特征是桿菌。所述LB固體培養(yǎng)基的成分是胰蛋白胨8-10g，酵母提取物4-6g，氯化鈉8-12g，瓊脂14-18g，植物凝膠8-12g，蒸餾水1000ml，pH 7. 2-7. 4。本發(fā)明提供了含有嗜熱地芽孢桿菌UTM03的菌劑。本發(fā)明提供了嗜熱地芽孢桿菌UTM03或其發(fā)酵產(chǎn)物或上述菌劑在堆肥中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了嗜熱地芽孢桿菌UTM03或其發(fā)酵產(chǎn)物或上述菌劑在制備堆肥接種劑中的應(yīng)用。 本發(fā)明還提供了一種污泥堆肥的方法，包括以下步驟I)發(fā)酵菌液的制備取芽孢桿菌菌株UTM03的菌種斜面經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后,入發(fā)酵罐繼續(xù)培養(yǎng)，制得；2)原種子堆肥的制備將輔料與污泥調(diào)配后，添加步驟I)制得的發(fā)酵菌液，混合均勻，堆肥發(fā)酵，得原種子堆肥；3)將步驟2)制得的原種子堆肥與含水率70% -90%的污泥混合，進(jìn)行堆肥發(fā)酵，得腐熟堆肥，即為一級(jí)種子堆肥；4)將一級(jí)種子堆肥，按步驟2)代替原種子堆肥進(jìn)行發(fā)酵，得腐熟堆肥，即為二級(jí)種子堆肥，如此傳代發(fā)酵制備三級(jí)種子堆肥和四級(jí)污泥種子堆肥。進(jìn)一步，步驟I)斜面活化培養(yǎng)的條件為6-12小時(shí)，65_70°C ;擴(kuò)大培養(yǎng)方法與條件搖床振蕩，振蕩頻率100-200rpm，溫度65-75°C，時(shí)間1_3天；發(fā)酵罐培養(yǎng)，溫度65-70°C，間隔4-12小時(shí)攪拌10-30分鐘，攪拌速率100_250rpm，間隔4-12小時(shí)通氣10-30分鐘，通氣量I : 0.5-1. 5m3/(V ^m3),發(fā)酵時(shí)間2-6天；培養(yǎng)液為LB培養(yǎng)基，各級(jí)擴(kuò)培時(shí)，其OD6tltl在2-4之間，停止培養(yǎng)。進(jìn)一步，步驟2)所述輔料為3_5mm長的木屑、稻草和花生殼粉等含水率在20%以下的碳素物料。進(jìn)一步，步驟2)所述堆體的碳氮比在20-30 I，含水率在50%-65%，按物料總干重的0. 1%-0. 5%添加發(fā)酵菌液，并將輔料、發(fā)酵種子液與污泥混合均勻進(jìn)行堆肥，堆肥發(fā)酵10-15天。進(jìn)一步，步驟2)、步驟3)所述堆肥是采用條垛式堆肥方式，堆體高I. 2-3m,寬3-6m，長度6-30m，采用強(qiáng)制翻堆的形式進(jìn)行供氧，期間堆肥間隔2_5天翻堆一次，中心溫度高于75°C時(shí)進(jìn)行翻堆。進(jìn)一步，步驟3)所述的將原種子堆肥與污泥混合，堆體含水率在50% -65%,堆肥發(fā)酵時(shí)間為15-30天。上述步驟3)中，所述腐熟堆肥可作為第I代污泥種子堆肥，按步驟3)所述進(jìn)行污泥堆肥，當(dāng)?shù)?代污泥種子堆肥利用完畢時(shí)，需重新利用輔料與發(fā)酵菌液，再次制備原種子堆肥。本發(fā)明還提供了上述污泥堆肥的方法在污泥堆肥中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供了一株在70°C下能快速增殖的芽孢桿菌UTM03。本發(fā)明還提供了菌株UTM03污泥堆肥中的應(yīng)用。利用本發(fā)明提供的菌株UTM03進(jìn)行污泥堆肥，其優(yōu)點(diǎn)在于腐熟堆肥可作為原種子堆肥繼續(xù)循環(huán)使用，降低污泥堆肥調(diào)理劑的使用量，降低堆肥成本，質(zhì)量穩(wěn)定，且綠色環(huán)保，無污染，性能優(yōu)良。原種子堆肥的使用代數(shù)控制在4代以內(nèi)，避免了污泥堆肥過程中由于鹽分或重金屬濃縮所帶來的次代種子堆肥中鹽度過高，使微生物失活或堆肥產(chǎn)品中因鹽度過高對(duì)植物帶來傷害或重金屬超標(biāo)的問題。可廣泛應(yīng)用于污泥堆肥，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


圖I為顯微鏡下嗜熱芽孢桿菌菌株UTM03 (1000X)圖2為本發(fā)明菌株UTM03應(yīng)用于污泥堆肥的流程示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I芽孢桿菌UTM03的分離與鑒定在無菌的環(huán)境中，稱取5g污泥堆肥樣品于裝有10粒玻璃珠的50ml無菌水三角瓶中，置于搖床上160r/min振蕩30分鐘，使樣品充分散開，然后放置70°C下，靜置培養(yǎng)12小時(shí)。取出以上靜置培養(yǎng)的三角瓶，在無菌的環(huán)境中，靜置3分鐘，再用無菌吸管吸取5ml上清液加到裝有50ml已滅菌的細(xì)菌培養(yǎng)液中，充分搖勻，放置于70°C下，靜置富集培養(yǎng)48小時(shí)，如此，傳代培養(yǎng)4代。細(xì)菌液體培養(yǎng)基配方為牛肉膏0. 5g，蛋白胨lg，氯化鈉
0.5g，蒸餾水 100ml, pH7. 2-7. 4，121°C 滅菌 20 分鐘。取出以上培養(yǎng)4代的富集培養(yǎng)三角瓶，用Iml無菌吸管吸取Iml上清液加到裝有9ml無菌水中即得(KT1)稀釋液。依次類推，制得KT1至10_6稀釋液。取6個(gè)無菌平皿，用Iml無菌吸管分別吸取以上稀釋液0. 2ml，接入平皿；將已融化并冷卻至50°C左右的細(xì)菌培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約20ml，前后左右輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液充分混勻，凝固后，在培養(yǎng)皿上作好稀釋度及日期標(biāo)記.待平板凝固后，將上述平板置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在70°C下進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)。觀察各平板的生長情況，選擇菌落分散較好的平板上挑取菌落形態(tài)不同的單菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，如此至4代以后，將形態(tài)一致的菌落制片，進(jìn)行簡單染色，在油鏡下觀察菌體形態(tài)。多視野下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)，確認(rèn)菌體形態(tài)一致后，用細(xì)菌培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)至豐厚，于4°C冰箱中保存菌種，備用。細(xì)菌固體培養(yǎng)基的成分為在細(xì)菌液體培養(yǎng)基中加入瓊脂1.6%，植物凝膠1.0%。以本發(fā)明菌株的DNA為模板，PCR擴(kuò)增其16S rRNA序列，引物為(27f)5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和(1492r):5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30s，53°C退火45s，72°C延伸90s，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)其純度后測(cè)序。擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。獲得的16SrRNA基因序列測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)(http://blast,ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，發(fā)現(xiàn)與 Bacillus sp. BGSC W9A22 (AY608987. I)同源性最高，把該菌株鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus 8 .)，將其命名為^￥03，并于2011年12月26日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為芽孢桿菌Bacillussp.，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5643。實(shí)施例2發(fā)酵種子液的制備取本發(fā)明菌株Bacillus sp. UTM03的斜面在70°C下活化培養(yǎng)8小時(shí)，然后接種裝有已滅菌的LB培養(yǎng)液的搖瓶中，置于水浴恒溫振蕩器上進(jìn)行一級(jí)擴(kuò)培,振蕩頻率160rpm,時(shí)間36小時(shí)，溫度70°C，經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)液OD6tltl為2. 523 ;取一級(jí)培養(yǎng)液在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)培，控制溫度65°C，間隔6小時(shí)攪拌15分鐘，轉(zhuǎn)速150rpm，間隔6小時(shí)通氣15分鐘，通氣量
I I. 2 (V/V)，發(fā)酵時(shí)間3天后，檢測(cè)發(fā)酵液0D_為3. 003，即為發(fā)酵種子液。實(shí)施例3發(fā)酵種子液的制備取本發(fā)明菌株Bacillus sp. UTM03的培養(yǎng)斜面在65°C下活化培養(yǎng)12h，然后接種裝有已滅菌的LB培養(yǎng)液的搖瓶中，置于水浴恒溫振蕩器上進(jìn)行一級(jí)擴(kuò)培，振蕩頻率180rpm,時(shí)間36小時(shí)，溫度65°C，經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)液0D600為2. 815 ;取一級(jí)培養(yǎng)液在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)培，控制溫度65 °C，間隔4小時(shí)攪拌10分鐘，攪拌速度160rpm，間隔4小時(shí)通氣10分鐘，通氣量I : 0.8(V/V)，發(fā)酵時(shí)間4天后，檢測(cè)發(fā)酵液0D600為3. 103，即為發(fā)酵種子液。實(shí)施例4種子堆肥的制備及應(yīng)用下面以花生殼粉作為輔料，具體說明。首先對(duì)脫水污泥、輔料花生殼粉進(jìn)行采樣檢測(cè)分析，其基本性質(zhì)見下表I :
權(quán)利要求
1.一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株UTM03，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 5643。
2.含有權(quán)利要求I所述芽孢桿菌UTM03的菌劑。
3.權(quán)利要求I所述的芽孢桿菌UTM03或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求2所述的菌劑在污泥堆肥中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述的嗜熱地芽孢桿菌UTM03或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求2所述的菌劑在制備堆肥接種劑中的應(yīng)用。
5.一種污泥堆肥方法，其特征在于，包括以下步驟 1)發(fā)酵菌液的制備取權(quán)利要求I所述芽孢桿菌菌株UTM03的菌種斜面經(jīng)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后，繼續(xù)培養(yǎng)，制得； 2)原種子堆肥的制備將輔料與污泥調(diào)配后，添加步驟I)制得的發(fā)酵菌液，混合均勻，堆肥發(fā)酵，得原種子堆肥； 3)將步驟2)制得的原種子堆肥與含水率70%-90%的污泥混合，進(jìn)行堆肥發(fā)酵，得腐熟堆肥，即為一級(jí)種子堆肥； 4)將一級(jí)種子堆肥，按步驟2)代替原種子堆肥進(jìn)行發(fā)酵，得腐熟堆肥，即為二級(jí)種子堆肥，如此傳代發(fā)酵制備三級(jí)種子堆肥和四級(jí)污泥種子堆肥。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟I)斜面活化培養(yǎng)的條件為6-12小時(shí)，65-70°C ;擴(kuò)大培養(yǎng)方法與條件搖床振蕩，振蕩頻率100-200rpm，溫度65_75°C，時(shí)間1-3天；發(fā)酵培養(yǎng)，溫度65-70°C，間隔4-12小時(shí)攪拌10-30分鐘，攪拌速率100_250rpm，間隔4-12小時(shí)通氣10-30分鐘，通氣量I 0. 5-1. 5m3/(V ^m3)，發(fā)酵時(shí)間2-6天；培養(yǎng)液為LB培養(yǎng)基，各級(jí)擴(kuò)培時(shí)，其OD_在2-4之間，停止培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述輔料為3-5mm長的木屑、稻草和花生殼粉等含水率在20%以下的碳素物料。
8.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述堆體的碳氮比在20-30 I，含水率在50% -65%，按物料總干重的0. I % -0. 5 %添加發(fā)酵菌液，并將輔料、發(fā)酵種子液與污泥混合均勻進(jìn)行堆肥，堆肥發(fā)酵10-15天。
9.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟2)、步驟3)所述堆肥是采用條垛式堆肥方式，堆體高I. 2-3m,寬3-6m，長度6_30m，采用強(qiáng)制翻堆的形式進(jìn)行供氧，期間堆肥間隔2-5天翻堆一次，中心溫度高于75°C時(shí)進(jìn)行翻堆。
10.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟3)所述的將原種子堆肥與污泥混合，堆體含水率在50-65%，堆肥發(fā)酵時(shí)間為15-30天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株芽孢桿菌(Bacillus sp.)菌株UTM03，其保藏編號(hào)為CGMCC No.5643。本發(fā)明提供的菌株UTM03在70℃下能快速增殖。本發(fā)明還提供了菌株UTM03在污泥堆肥中的應(yīng)用。利用本發(fā)明提供的菌株UTM03制備的種子堆肥及其污泥堆肥應(yīng)用方法，可避免了污泥堆肥中因鹽分或重金屬濃縮，所帶來的使微生物失活或堆肥產(chǎn)品對(duì)植物帶來傷害或重金屬超標(biāo)的問題，可廣泛應(yīng)用于污泥堆肥，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102703351SQ20121017764
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月21日
發(fā)明者劉永躍, 周順桂, 汪涌, 許宜北 申請(qǐng)人:大地綠源環(huán)?？萍?北京)有限公司