專利名稱：一株芽孢桿菌以及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一株芽孢桿菌及其用于轉(zhuǎn)化苯乙二醇環(huán)碳酸 酯、乙酰扁桃酸等化合物獲取光學(xué)純手性化合物的方法。
背景技術(shù)：
手性化合物是目前生物催化的重要產(chǎn)品，主要應(yīng)用于制藥等領(lǐng)域。光學(xué)純手 性二醇及其環(huán)碳酸酯作為重要的手性中間體，有著廣泛的應(yīng)用，其合成制備越來
越受到重視。例如，cs)-苯乙二醇可以作為液晶材料的手性添加劑，用于縮短液
晶面板的響應(yīng)時間；(及)-對硝基苯乙二醇和(5)-3-氯-1,2-丙二醇是心血管藥物|5-阻滯劑的手性中間體；(i )-碳酸丙烯酯和(7S,2/ )-茚滿二醇分別是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 和蛋白酶抑制劑合成的手性中間體。近年來不少企業(yè)與研究小組都投入極大的熱 情研究這些手性化合物的合成新技術(shù)。
已知的手性二醇合成方法有化學(xué)法和生物法?；瘜W(xué)法包括利用有機金屬催 化劑催化烯烴的不對稱雙羥基化、環(huán)氧化物的選擇性水解或手性羥基酸的選擇性 還原等；生物法則包括雙加氧酶催化的烯烴不對稱雙羥基化、環(huán)氧水解酶催化的 環(huán)氧化物對映選擇性水解、酯水解酶催化的二醇羧酸酯的選擇性水解以及氧化還 原酶催化的二醇選擇性氧化或相應(yīng)酮的選擇性還原等。手性環(huán)碳酸酯的化學(xué)合成 報道較多的是采用間接的方法先合成手性二醇或環(huán)氧化物，然后進一步合成手 性環(huán)碳酸酯；近年來也有利用環(huán)氧化物的不對稱羰基化反應(yīng)直接合成手性環(huán)碳酸 酯的報道，但產(chǎn)物的光學(xué)純度較低(最高為70%)。
從原料特點和來源看，化學(xué)法合成環(huán)碳酸酯可由二氧化碳與相應(yīng)的環(huán)氧化物 制得，目前國內(nèi)碳酸丙烯酯等已經(jīng)成功地實現(xiàn)了大噸位合成，原料來源非常豐富；
與其它羧酸酯相比，環(huán)碳酸酯水解產(chǎn)生的二氧化碳避免了有機酸對設(shè)備的腐蝕和 對環(huán)境的污染。結(jié)合生物催化反應(yīng)溫和、選擇性高的特點，環(huán)碳酸酯水解酶催化 的環(huán)碳酸酯立體選擇性水解將是手性環(huán)碳酸酯和手性二醇合成的綠色新方法。
目前，環(huán)碳酸酯水解酶催化環(huán)碳酸酯的立體選擇性水解在國際上屬于一個較新的研究領(lǐng)域，在很多方面的工作都處于剛剛起步的階段。從酶的來源看，種類 較少，多為動物來源，研究內(nèi)容涉及酶的純化、表征和二級結(jié)構(gòu)，利用其催化環(huán) 碳酸酯對映選擇性拆分的研究很少，結(jié)果也不是很理想(Yang Y丄.，Ramaswamy S.， and Jakoby M^.B. Enzymatic hydrolysis of organic cyclic carbonates. / 5/o/. CTzem. 1998,273: 7814-7817)，微生物來源的環(huán)碳酸酯水解酶僅限于日本學(xué)者的個別報 道，其研究對象局限在一端為甲基的雙取代的環(huán)碳酸酯(Matsumoto K, Sato Y, Shimojo M and Hatanaka M. Highly enantioselective preparation of C2-symmetrical diols: microbial hydrolysis of cyclic carbonates. 7^raAedraw: y4砂w附e/^. 2000， 11: 1965-1973)，在微生物的篩選方面還有很大的可開發(fā)空間。在底物譜的研究方面， 多集中在長鏈脂肪族環(huán)碳酸酯和一端為甲基的雙取代環(huán)碳酸酯，對短鏈脂肪族和 芳香族類環(huán)碳酸酯的研究較少，所以篩選新的環(huán)碳酸酯水解酶，制備光學(xué)純苯乙 二醇具有重要的意義。
本發(fā)明中涉及到另一類手性分子手性扁桃酸及其衍生物同樣具備廣闊的開-發(fā)前景。光學(xué)純扁桃酸主要應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)，可用于合成環(huán)扁桃酯、扁桃酸烏洛 托品、鹽酸奧西布寧等醫(yī)藥的手性中間體。
制備光學(xué)純扁桃酸及其衍生物的主要方法包括高壓結(jié)晶法、色譜法、酶法拆 分。酶法拆分包括使用腈水解酶或腈水合酶與酰胺酶的組合進行外消旋扁桃腈的 立體選擇性水解；或使用脂肪酶催化扁桃酸酯的水解拆分。到目前為止，使用酶 法催化乙酰扁桃酸水解拆分的報道非常少。本發(fā)明篩選得到的菌株可以對映選擇 性水解乙酰扁桃酸及其衍生物，獲取光學(xué)純扁桃酸及其衍生物，,從而拓展了底物 譜、擴大了生物催化劑的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了 一株新分離的芽孢桿菌及其用于制備光學(xué)活性二醇、扁桃酸以 及鄰氯扁桃酸的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。
本發(fā)明的芽孢桿菌(^^7/"s sp. ECU0015)是屬于芽孢桿菌屬，是發(fā)明人從土 壤樣品中，經(jīng)過初篩、復(fù)篩及分離純化得到的高選擇性環(huán)碳酸酯水解酶產(chǎn)生菌， 該菌株己于2009年01月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo.2874。
上述的菌株是從上海、河北、江蘇、山東、山西、湖北等地區(qū)的300余份土壤中篩選得到的，篩選的具體步驟如下
從不同的環(huán)境中采集土壤樣品，利用苯乙二醇環(huán)碳酸酯為唯一碳源，進行兩 輪富集培養(yǎng)，篩選環(huán)碳酸酯水解酶產(chǎn)生菌。通過反復(fù)篩選，分離得到一株高活力 和高選擇性的環(huán)碳酸酯水解酶產(chǎn)生菌。
本發(fā)明的菌種具有如下的微生物學(xué)特征
1、 形態(tài)大小
桿狀或橢圓形，0.7~1.0^im x 3~5^m;
2、 適宜生長環(huán)境
適宜的生長溫度為25 35 °C，可以在pH5 9環(huán)境中生存；
3、 平板培養(yǎng)菌落特性
在30'C平板上培養(yǎng)12h可形成小的菌落，36h形成干燥、平展的灰色菌落， 邊緣不規(guī)則，中間突出。
根據(jù)"伯杰氏鑒定手冊"提供的鑒定方法和上述的微生物學(xué)特征，并經(jīng)16S rDNA鑒定，確認該菌株為芽孢桿菌屬(萬a"7/iwsp.)，標號為Bflc!7/ws sp. ECU0015。
本發(fā)明的芽孢桿菌株5ac///1^ sp. ECU0015可以用于生產(chǎn)單一對映體的苯乙
二醇、扁桃酸或鄰氯扁桃酸，生產(chǎn)的方法包括如下的步驟
(1) 菌種的準備
將芽孢桿菌株B""7/M; sp. ECU0015在滅過菌(121 °C， 20~40 min)的豐富培養(yǎng) 基(例如甘油1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，瓊脂1.5。/。)平板上劃線，于25~30 。C靜置培養(yǎng)約1-2天后挑取單菌落，作為種子進行斜面培養(yǎng)(培養(yǎng)條件同上)，約 2天后保存于4'C冰箱中備用。
(2) 菌株的培養(yǎng)
將所說的芽孢桿菌株^^7/w sp. ECU0015采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，在發(fā)酵培 養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)24 48 h，溫度20~50 °C;
再以上述培養(yǎng)液作為種子，基于發(fā)酵培養(yǎng)基體積的接種量為1~10%&/力，接 種至50ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20 50'C下100 180rpm搖床上培養(yǎng)24 48h，離心 得到靜息細胞；
所說的發(fā)酵培養(yǎng)基可采用常規(guī)的培養(yǎng)基，其中各組分的含量如下:甘油10~50 g/L，牛肉膏l(xiāng) 20g/L，蛋白胨l~20g/L， KH2P04 l~10g/L， Na2HP04 1 10 g/L，NaC10.1~2g/L， MgSO40.1~2g/L， pH3~8。 (3)底物的生物轉(zhuǎn)化
將收獲的靜息細胞，懸浮于pH為6.0 8.0的磷酸緩沖溶液中，靜息細胞的含 量為IO-IOO g (濕重)/L;加入苯乙二醇環(huán)碳酸酯或其它底物，最終濃度為5 100 mM，在25 40。C和100 160rpm的恒溫搖床上振蕩反應(yīng)1248h，然后從反應(yīng)液中 提取產(chǎn)物(5)-(-)-苯乙二醇、(及)-扁桃酸或(及)-間氯扁桃酸，產(chǎn)品光學(xué)純度接近或 高于98%。
由上述公開的技術(shù)方案可見，采用本發(fā)明的芽孢桿菌株催化拆分苯乙二醇環(huán) 碳酸酯及扁桃酸?；?，不僅具有較好的催化效果，能夠合成高光學(xué)純度(接近 或高于98%)的苯乙二醇及扁桃酸等，而且催化劑易于制備、反應(yīng)條件溫和、底 物適應(yīng)性廣，具有很好的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)前景。
具體實施例方式
下列實施例將有助于進一步理解本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例l菌株的篩選
確定從土壤等環(huán)境中篩選微生物，首先配制富集培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為 (NH4)2S04 1.0g/L， KH2PO43.0g/L, K2HPO46.0 g/L， MgSO40.5g/L， CaCl2 0.05 g/L;另配制豐富培養(yǎng)基，組成為葡萄糖(或甘油)15g/L，牛肉膏5g/L，蛋白 胨5g/L， KH2PO41.0 g/L， Na2HP04 1.0g/L， MgSO40.5 g/L， pH 7.0。取少量不 同來源的的土樣懸浮于2ml的富集培養(yǎng)基中，加入苯乙二醇環(huán)碳酸酯或碳酸二乙 酯(濃度為0.2~1 g/L)為唯一碳源，在25 4(TC、 200 rpm振搖條件下富集培養(yǎng)1 2 天，待微生物生長起來后轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1 2天。富集培養(yǎng)之后取 樣進行薄板層析，半定量地檢測水解產(chǎn)物苯乙二醇的有無或含量，以確定土樣中 是否存在能對碳酸酯進行轉(zhuǎn)化的微生物。對有明顯底物轉(zhuǎn)化的富集培養(yǎng)液，取少 量稀釋涂布于豐富培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)1 2天，然后分別挑取形態(tài)和顏色不同的單 菌落，接種于2ml豐富培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h后加入苯乙二醇環(huán)碳酸酯的甲醇溶液 (苯乙二醇環(huán)碳酸酯的終濃度為IO mM)，生物轉(zhuǎn)化24h之后，反應(yīng)液用乙酸乙酯 萃取，進行薄板層析，檢測苯乙二醇的生成量。保藏具有明顯苯乙二醇環(huán)碳酸酯 水解活性的菌株。將保存的有明顯活性的菌株接種于50ml豐富培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36h后，離心收 集菌體。將離心下來的菌體再懸浮于IO ml的磷酸鉀緩沖液(50 mM， pH 7.3)中， 加入底物苯乙二醇環(huán)碳酸酯(濃度為10mM)進行生物轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化24h后，用等體 積的乙酸乙酯萃取后進行HPLC分析，使用日本Daicel公司的Chiracel OD-H手性 色譜柱(小0.46 cmx25 cm)，流動相為正己垸異丙醇=95:5(v/v),流速l ml/min 分析計算產(chǎn)物的對映體過量值(eep)和底物的轉(zhuǎn)化率。最后在400多株候選菌株中 篩選出了能立體選擇性轉(zhuǎn)化苯乙二醇環(huán)碳酸酯生成(S)-苯乙二醇的微生物 5ac/腸sp. ECU0015。
實施例2微生物的培養(yǎng)
培養(yǎng)基配方甘油15g/L，牛肉膏8g/L，蛋白胨5g/L， KH2PO41.0g/L， Na2HPO41.0g/L， MgSO40.5g/L, pH7.0。 121 。C高溫滅菌20 min。
取4 t:保藏的芽孢桿菌斜面，挑取一環(huán)接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml的搖 瓶中。在30'C下，160rpm搖床培養(yǎng)12h，按5% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至裝有100 ml 培養(yǎng)基的500ml的搖瓶中，于30'C、 160rpm繼續(xù)培養(yǎng)36h，離心收獲細胞。測得 發(fā)酵液的酶活力約為5.08 U/L，細胞濃度約25 g (濕重)/L，單位濕細胞的酶活為 0.20U/g濕細胞。
整細胞活力定義為在30'C、 pH7.3，底物濃度10mM的條件下，每分鐘催 化苯乙二醇環(huán)碳酸酯生成l.O nmol苯乙二醇所需要的酶量定義為一個活力單位 (U)。
實施例3利用靜息細胞制備(5)-(-)-苯乙二醇
將離心得到的芽孢桿菌Bacz7/w sp. ECU0015靜息細胞12 g懸浮于100 ml磷酸 緩沖液(100mM， pH7,3)中，加入底物苯乙二醇環(huán)碳酸酯，使其終濃度為10mM， 在30。C和l60 rpm的恒溫搖床上振蕩反應(yīng)24 h后，將反應(yīng)液以12，000 x g離心10 min，除去細胞。在上清液中加入NaCl至飽和，用50 ml的無水乙醚萃取，重復(fù)三 次。離心得到的細胞用20 ml無水乙醚浸泡，重復(fù)兩次，將這兩部分乙醚溶液合 并，用飽和NaCl溶液洗滌兩次，每次10ml。得到的乙醚萃取液用10% (w/v)的無 水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，得到產(chǎn)物的結(jié)晶粗品，通過硅膠柱層析(石油醚乙酸乙酯，體積比為4:l)純化后得到(5)-苯乙二醇，精制后得到白色針 狀晶體，產(chǎn)率27.8%， ^為99.8%。
<formula>formula see original document page 8</formula>
實施例4~5利用靜息細胞轉(zhuǎn)化乙酰扁桃酸和間氯乙酰扁桃酸 稱取12 g Bacz7/w sp. ECU0015靜息細胞懸浮于100 ml磷酸緩沖液(100 mM，
pH7.3)中，加入乙酰扁桃酸或間氯乙酰扁桃酸，底物濃度為10mM，在30'C和160
rpm的恒溫搖床振蕩反應(yīng)大約36 h,間歇取樣測定產(chǎn)物的對映體過量值，至轉(zhuǎn)化
產(chǎn)物的對映體過量值最高時結(jié)束反應(yīng)。于反應(yīng)液中加入NaCl至飽和，用等體積
無水乙醚分三次萃取，萃取液干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，過硅膠柱純化，得到
(及)-扁桃酸和(及)-間氯扁桃酸純品，產(chǎn)率和產(chǎn)品光學(xué)純度列于下表中。
<formula>formula see original document page 8</formula>
實施例6利用靜息細胞轉(zhuǎn)化較高濃度苯乙二醇環(huán)碳酸酯 稱取3 g 5acz7/w sp. ECU0015靜息細胞懸浮于10 ml磷酸緩沖液(100 mM， pH7.3)中，加入苯乙二醇環(huán)碳酸酯，底物濃度為50mM，在30'C和160 rpm的恒溫搖 床上振蕩反應(yīng)36h，間歇取樣測定產(chǎn)物的對映體過量值。轉(zhuǎn)化率為32.4%時，eep 最高，為97.4%。
實施例7利用5flc說"s sp. ECU0015生長細胞克級制備Cy)-苯乙二醇
40個裝有100 ml豐富培養(yǎng)基的500 ml搖瓶，按5% (v/v)的接種量接種如實施
例2所述的種子培養(yǎng)液，接種12 h后各加入2 ml溶解有苯乙二醇環(huán)碳酸酯的甲醇溶 液，培養(yǎng)基中底物的終濃度為5mM。在3(fC和160rpm的恒溫搖床上振蕩反應(yīng)， 加入底物48h后停止反應(yīng)，離心去除細胞。上清液中加入NaCl至飽和，等體積無 水乙醚分三次萃取(無水乙醚回收后重復(fù)利用)，得到的無水乙醚萃取液用10% (w/v)無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無水乙醚，通過硅膠柱層析(石油醚: 乙酸乙酯，體積比4:l)純化后得到(5)-苯乙二醇0.98g，收率為35.6%, eep = 98.3%。
權(quán)利要求
1.一株芽孢桿菌Bacillus sp.ECU0015，保藏號為CGMCC No.2874。
2. —種如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌用于催化生產(chǎn)光學(xué)純手性苯乙二醇、 扁桃酸或間氯扁桃酸。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的芽孢桿菌5ac///^ sp. ECU0015催化生產(chǎn)光學(xué)純手 性化合物的用途，包括如下步驟(1) 將權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌5"c///^ sp. ECU0015在發(fā)酵培養(yǎng)基中進 行擴增培養(yǎng)；(2) 離心收集(l)中培養(yǎng)的靜息細胞，重新懸浮于pH為6.0-8.0的磷酸鉀緩 沖液中，加入苯乙二醇環(huán)碳酸酯、乙酰扁桃酸或間氯乙酰扁桃酸；或直接在(l) 的培養(yǎng)液中加入苯乙二醇環(huán)碳酸酯、乙酰扁桃酸或間氯乙酰扁桃酸；在254(TC 反應(yīng)1040h，然后采用常規(guī)的分離方法從反應(yīng)混合物中收集光學(xué)純的苯乙二醇、 扁桃酸或間氯扁桃酸。
4. 根據(jù)權(quán)利3所述的用途，其特征在于，所述的靜息細胞在磷酸鹽緩沖液 中的濕重含量為10 ~ 150 g/L、生長細胞在發(fā)酵液中濕重含量為10 ~ 50 g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利3所述的用途，其特征在于，苯乙二醇環(huán)碳酸酯、乙酰扁桃酸 或間氯乙酰扁桃酸的濃度為5 ~ 100 mmol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利3所述的用途，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下甘 油10~50 g/L，蛋白胨1~20 g/L，牛肉膏1~20 g/L，KH2P04 1~10 g/L，Na2HP04 1~10 g/L， NaCl 0.1~2 g/L， MgS04 0.1~2 g/L， pH4~8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株芽孢桿菌Bacillus sp.ECU0015，保藏號為CGMCC No.2874。以該菌株的靜息細胞及生長細胞為生物催化劑，催化苯乙二醇環(huán)碳酸酯、乙酰扁桃酸及其衍生物不對稱水解，制備獲得光學(xué)活性的手性苯乙二醇和扁桃酸等手性化合物。本發(fā)明所述的菌種立體選擇性高，生物轉(zhuǎn)化工藝簡單、安全，成本低廉，環(huán)境友好，而且產(chǎn)物容易純化，具有工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/20GK101613666SQ200910054358
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者磊 常, 毅 徐, 江 潘, 許建和 申請人:華東理工大學(xué)