專利名稱：抗高血壓藥物療效檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個體抗高血 壓藥物療效的試劑盒，通過檢測降壓藥物用藥靶向位點CYP3A4基因、CYP2D6基因、CYP2C9 基因和CYP2C19基因多態(tài)性位點來評估個體抗高血壓藥物療效。
背景技術(shù)：
高血壓可分為原發(fā)性及繼發(fā)性兩大類。在絕大多數(shù)患者中，高血壓的病因不明，稱 之為原發(fā)性高血壓，占總高血壓著的95%以上；在不足5%患者中，血壓升高是某些疾病的 一種臨床表現(xiàn)，本身有明確而獨立的病因，稱為繼發(fā)性高血壓。原發(fā)性高血壓(primary hypertension)是以血壓升高為主要臨床表現(xiàn)的綜合征， 簡稱為高血壓。高血壓是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險因素，影響重要臟器例如 心、腦、腎的結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致這些器官的功能衰竭，迄今仍是心血管疾病死亡的主要 原因之一。治療高血壓的主要目標(biāo)是最大限度地降低新血管病死亡和病殘的總危險。治療原 則包括先基礎(chǔ)治療，后藥物治療；基礎(chǔ)治療包括改善生活方式，消除不利于心理和身體健 康的行為和習(xí)慣，減少高血壓以及其他心血管病的發(fā)病危險。當(dāng)前用于降壓的藥物主要為 以下6類，即利尿藥、β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素II體拮 抗劑、鈣拮抗劑和α阻滯劑。CYP3A4，5是重要的I相代謝酶，主要通過C-或N-脫烴、C-羥化等反應(yīng)來代謝藥 物。參與約50%的藥物代謝。高血壓治療常用藥物鈣通道阻滯劑(氨氯地平、地爾硫卓、 非洛地平、樂卡地平、硝苯地平、尼卡地平、尼索地平、尼群地平、維拉帕米)，β受體阻滯劑 (卡維地洛)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制藥(氯沙坦、厄貝沙坦、依普利酮)CYP3A4，5都參 與了代謝過程，并且有的處于主要代謝途徑，此時酶活性的高低對藥物藥效及安全性的影 響極大。因此，CYP3A4，5基因多態(tài)性導(dǎo)致的酶活性改變將在很大程度上反映抗高血壓藥物 的用藥效果，CYP3A4，5基因的分型檢測對于臨床抗高血壓藥物的用藥指導(dǎo)具有的重要現(xiàn)實
眉、οCYP2D6是重要的I相代謝酶，參與約25%臨床常用藥物的代謝，包括β受體阻滯 劑、抗抑郁藥物、抗精神病藥物及化療藥物等。由于CYP2D6基因存在遺傳多態(tài)性導(dǎo)致個體 之間CYP2D6酶活性有差異，出現(xiàn)藥物代謝能力的多態(tài)性，導(dǎo)致病人用藥時很難獲得最佳血 藥濃度，如血藥濃度過低無法有效發(fā)揮藥物療效或濃度過高出現(xiàn)毒副作用。高血壓治療常 用藥物鈣通道阻滯劑(維拉帕米)，β受體阻滯劑(烯丙洛爾、普萘洛爾、卡維地洛美托洛 爾、丁呋洛爾、奈比洛爾)，CYP2D6都參與了代謝過程，并且對于某些藥物2D6是主要代謝 酶，此時酶活性的高低對藥物藥效及安全性的影響極大。因此，CYP2D6基因多態(tài)性導(dǎo)致的 酶活性改變將在很大程度上反映抗高血壓藥物的用藥效果，CYP2D6基因的分型檢測對于臨 床抗高血壓藥物的用藥指導(dǎo)也具有的重要現(xiàn)實意義。CYP2C9是重要的I相代謝酶，高血壓治療常用藥物鈣通道阻滯劑(地爾硫卓)，β受體阻滯劑(卡維地洛)，以及腎素_血管緊張素系統(tǒng)抑制藥(氯沙坦、厄貝沙坦)CYP2C9 都參與了代謝過程，并且對于某些藥物2C9是主要代謝酶，此時酶活性的高低對藥物藥效 及安全性的影響極大。因此，CYP2C9基因多態(tài)性導(dǎo)致的酶活性改變將在很大程度上反映抗 高血壓藥物的用藥效果，CYP2C9基因的分型檢測對于臨床抗高血壓藥物的用藥指導(dǎo)也具有 的重要現(xiàn)實意義。CYP2C19是重要的I相代謝酶，高血壓治療常用藥物β受體阻滯劑(普萘洛爾)， CYP2C19參與代謝過程，該酶活性的高低對普萘洛爾的藥效及安全性的影響極大。因此， CYP2C19基因多態(tài)性導(dǎo)致的酶活性改變將在很大程度上反應(yīng)該藥物的用藥效果，CYP2C19 基因的分型檢測對于臨床抗高血壓藥物的用藥指導(dǎo)也具有的重要現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
基于降壓藥物用藥靶向位點CYP3A4基因、CYP2D6基因、CYP2C9基因和CYP2C19基 因多態(tài)性可用來評估個體抗高血壓藥物療效的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個體抗高血壓 藥物療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測降壓藥物用藥靶向位點CYP3A4基因、CYP2D6基因、CYP2C9基因和CYP2C19基 因多態(tài)性位點的特異性引物對及特異性熒光探針對；熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是能夠輕易完成設(shè)計的，特異性熒光探針對 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液4 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 4 μ 1，25mM MgC12 溶液 2· 4μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 1 μ 1，20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水 21.2 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實施例檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進行4次獨立的熒光定量PCR反應(yīng)，每次
4反應(yīng)的體系為總體積10 μ 1，包含濃度為20ng/μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR 反應(yīng)緩沖液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA聚合酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶 FAM熒光探針各0. 25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進行60個循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4 基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點進行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號的強弱即可確定所檢測的SNP位點的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測個體抗高血壓藥物療效的試劑盒，其特征在于包括檢測降壓藥物用藥靶向位點CYP3A4基因、CYP2D6基因、CYP2C9基因和CYP2C19基因多態(tài)性位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液4 μ 1，`25mM dNTP 混合液 0. 4 μ 1，`25mM MgCl2 溶液 2. 4 μ 1，`5units/y 1 Taq DNA 聚合酶 0.1 μ 1，`20 μ M特異性引物對每條引物各0. 225 μ 1，`10 μ M特異性熒光探針對每條探針各0. 25 μ 1，去離子水21. 2 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個體抗高血壓藥物療效的試劑盒。該試劑盒包括檢測降壓藥物用藥靶向位點CYP3A4基因、CYP2D6基因、CYP2C9基因和CYP2C19基因多態(tài)性位點的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測降壓藥物用藥靶向位點CYP3A4基因、CYP2D6基因、CYP2C9基因和CYP2C19基因多態(tài)性位點來評估個體抗高血壓藥物療效。
文檔編號C12Q1/68GK101928757SQ20091005395
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司