專利名稱：一種抗高血壓活性肽vppipp的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗高血壓活性肽，具體涉及通過將抗高血壓功能肽段異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)和纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸(VPP)反式鏈接并通過體外和體內生物活性實驗驗證的一種的抗高血壓的合成六肽。
背景技術：
我國高血壓患病率的態(tài)勢越來越嚴峻，當前常見的治療高血壓的藥物有以下六種:利尿劑(可能引起低血鉀癥，影響糖代謝，使糖耐量下降)、β 一阻滯劑(可帶來中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及血管系統(tǒng)的不良反應)、α 一阻滯劑、鈣拮抗劑(會導致水腫、頭痛、潮紅、多尿、低血壓以及心臟傳導受阻)、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素II受體阻滯劑(可引起干咳、血鉀高、甚至血管性水腫)。由于現(xiàn)有大部分藥物都有較強的副作用，所以科學家們一直致力于開發(fā)高效低毒的藥品或食品，譬若說，含有抑制血管緊張素轉換酶(angiotensin converting enzyme,ACE, EC3.4.15.1)活性的小肽的功能食品或藥品，使高血壓患者得益，本發(fā)明就是基于此背景誕生的。ACE酶是一種外肽酶，是調節(jié)血壓的重要因子，主要存在于血管的內皮細胞，在肺毛中含量最為豐富。根據(jù)文獻:趙海珍，陸兆新，劉戰(zhàn)民等.天然食品來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的研究進展[J].中國生化藥物雜志，2004, 25(5):315-317及文獻:陳強.血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素II受體拮抗劑聯(lián)合應用治療腎小球疾病[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2001，10(3):274-277的報道，ACE酶的主要作用有兩個，一個是使得血管緊張素I(Ang I)轉化為血管緊張素II(Ang
II)，另外一個是使緩激肽失活，以這兩個作用影響腎素一血管緊張素系統(tǒng)(RAS)來完成血壓的調節(jié)。血管緊張素II可以與血管組織中的特異性受體ATl相結合，通過血流動力學作用，使得血管收縮，收縮腎小球出球小動脈，使腎血流量下降，腎小球毛細血管內壓升高，緩激肽可以通過血流動力學作用，使血管舒張，舒張腎小球出球小動脈，使腎血流量上升，腎小球毛細血管內壓降低。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的是提供一種高效低毒的通過抑制ACE酶活性來實現(xiàn)抗高血壓作用的活性肽。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是:一種抗高血壓活性肽，其氨基酸序列分別為:纈氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)-異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)(簡稱VPPIPP)。本發(fā)明的活性肽VPPIPP選擇了抗高血壓功能肽段:IPP和VPP，通過反式鏈接形成N-末端和C-末端之間的近似“回文結構”。由于ACE酶C端催化位點有易受到Ang I (DRVYIHPFHL)的Pro、Phe和His基團影響的部位，而VPPIPP的C端第四個氨基酸也為Pro，與Ang I相類似。因此VPPIPP會比IPP和VPP順式鏈接形成的IPPVPP具有更好的抗高血壓能力。
本發(fā)明的第二個目的是提供活性肽VPPIPP在制備預防或治療高血壓的藥物或食物中的應用。由此，本發(fā)明的第三個目的是提供一種抗高血壓的組合物，其中含有活性肽VPPIPP作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體和/或賦形劑。本發(fā)明的活性六肽VPPIPP能夠采用本領域常規(guī)方法制備，如采用固相多肽合成方法合成，具體包括以下具體步驟:首先在脯氨酸二氯樹脂上接入芴甲氧羰基脯氨酸，同時加入TBTU和DIEA進行偶聯(lián)，偶聯(lián)時間為30分鐘，并用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次去除末端芴甲氧羰基基團，然后用六氫吡啶進行脫保護，脫保護結束后再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次。抽干后加入芴甲氧羰基異亮氨酸，TBTU和DIEA進行偶聯(lián)，偶聯(lián)時間為30分鐘，并用20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次，用六氫吡啶進行脫保護，再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次抽干。抽干后加入芴甲氧羰基脯氨酸，TBTU和DIEA進行偶聯(lián)，偶聯(lián)時間為30分鐘，并用20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次，用六氫吡啶進行脫保護，再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次抽干。抽干后加入芴甲氧羰基脯氨酸，TBTU和DIEA進行偶聯(lián)，偶聯(lián)時間為30分鐘，并用20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次，用六氫吡啶進行脫保護，再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次抽干。抽干后加入芴甲氧羰基纈氨酸，TBTU和DIEA進行偶聯(lián)，偶聯(lián)時間為30分鐘，并用20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次，用六氫吡啶進行脫保護，再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次抽干，最后通過半制備型反相高效液相色譜(反相柱:VYDAC - C18柱(4.6 X 250mm，5ym);線性梯度:溶液A(溶解于分析純級乙腈的0.1%(ν/ν)三氟乙酸)，梯度:5%-30%(ν/ν)25分鐘、100% (ν/ν)25.1分鐘、停止30分鐘；溶液Β(溶解于純水的0.1% (ν/ν)三氟乙酸)，梯度:95%-70% (ν/ν)25分鐘、0%25.1分鐘、停止30分鐘；流速:1.0毫升/分鐘；分離收集洗脫峰，凍干后備用。本發(fā)明的六肽VPPIPP是基于已經(jīng)得到廣泛應用的兩種三肽IPP和VPP反式鏈接成的，擁有較好的抗高血壓能力，由體外和體內生物活性進行驗證。本發(fā)明獲得的具有抗高血壓能力的合成六肽，能夠用于抑制血管緊張素轉化酶(ACE酶)的活性，降低血管緊張素
II(Ang II)的生成水平，達到降低血壓的效果。該抗高血壓活性肽具有高效低毒的特點，對于開發(fā)治療高血壓藥物和功能食品有著較好的應用前景。由于能通過人工化學合成技術進行大規(guī)模制備，為將來藥物開發(fā)中低成本和高產(chǎn)率的制備奠定了基礎。


圖1為大鼠喂養(yǎng)異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)(簡稱IPP) (1.5mg/kg)后收縮壓(Systolic Blood Pressure, SBP)與時間的關系圖；圖2 為大鼠喂養(yǎng) VPPIPP (1.5mg/kg)后收縮壓(Systolic Blood Pressure, SBP)與時間的關系圖；圖3為空白組大鼠收縮壓(Systolic Blood Pressure, SBP)與時間的關系圖。
具體實施例方式下面進一步闡述本發(fā)明。

六肽分子VPPIPP抗高血壓活性測試:
實驗材料:新西蘭大白兔:上海交通大學藥學院動物實驗中心提供；20周齡雄性高血壓模式大鼠(SHR):上海實驗動物中心提供；IPP、VPPIPP，吉爾生化(上海)有限公司制備；微量移液器(100 1000 μ L，20 200 μ L，10 100 μ L，0.5 10μ L)，Eppendorf Ltd ;過濾器(Φ50^>,上海醫(yī)藥工業(yè)研究所；微孔濾膜(Φ 50mm，孔徑為0.22 μ m),上海摩速科學器材有限公司；Centrifuge 5415 D 小型高速離心機，Eppendorf Ltd ；AKTApunf ier 10 層析系統(tǒng)，Superdex 30 prep grade 層析柱(GE Healthcare, USA) ；Zorbax bB_C18 反相色譜柱(Agilent);摩爾超純水機，上海摩勒科學儀器有限公司；GL-22M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器廠JY2002型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器，上海醫(yī)用核子儀器廠；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；LabDancer 試管振蕩器，IKA Works Guangzhou ；Electrolux BCD-252T 型冰箱,伊萊克斯(中國)電器有限公司；DW-HW138型超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限責任公司；分析天平，Meitele1-tolido, German ;大鼠血壓計:SoftronBP_98A,北京軟隆生物技術有限公司。合成六肽VPPIPP的體外ACE酶抑制活性結果分析:馬脲酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-L-histidyl-L_leucine,HHL)在ACE酶的催化下快速分解產(chǎn)生馬尿酸(Hippuric Acid, HA)和二肽histidyl-leucine (HL),加入ACE酶抑制劑后，ACE酶的活性受到抑制，HA和HL的生成量減少，通過RP-HPLC方法(色譜柱=ZorbaxSB-C18 柱(80 A, 5 μ m, 4.6mmX 250mm ;流動相:20%(v/v)分析純乙腈 + 0.1%(ν/ν)三氟乙酸；流速:1.0毫升/分鐘))測定228 nm下HA的生成量，按下列公式評價ACE酶抑制劑對ACE酶的抑制率。ACE酶抑制率(%) =IOOX (A對照一 A樣品)/ (A對照一 A空白)A對照:100mM硼酸鈉緩沖液(BBS，pH8.3)代替六肽時生成HA的峰面積；A樣品:六肽樣品時生成HA的峰面積；A空白，鹽酸先于HHL加入時IOOmM硼酸鈉緩沖液(BBS，pH8.3)代替六肽時生成HA的峰面積。反應體系和條件見表1:表權利要求
1.一種抗高血壓活性肽，其特征在于:該活性肽的氨基酸序列為:纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸。
2.如權利要求1所述的抗高血壓活性肽在制備預防或治療高血壓的藥物或食物中的應用。
3.一種抗高血壓的組合物，其中含有權利要求1中所述的活性肽作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體和/或 賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗高血壓活性肽，其氨基酸序列為纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸，本發(fā)明是在前期研究的基礎上，選擇了更可取的降血壓肽的結構，并通過體外和體內生物活性驗證合成六肽的抗高血壓能力，本發(fā)明獲得的具有抗高血壓能力的合成六肽，可分別用于抑制ACE酶的活性，降低AngII的生成水平，達到降低血壓的效果。該抗高血壓活性肽具有高效低毒的特點，對于開發(fā)治療高血壓藥物和功能食品有著較好的應用前景，由于能通過人工化學合成技術進行大規(guī)模制備，為將來藥物開發(fā)中低成本和高產(chǎn)率的制備奠定了基礎。
文檔編號C07K7/06GK103204909SQ201310132969
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月17日 優(yōu)先權日2013年4月17日
發(fā)明者錢炳俊, 溫堯林 申請人:蘇州凱祥生物科技有限公司