本發(fā)明涉及藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種同時(shí)制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學(xué)對(duì)照品的方法。

背景技術(shù)：

野漆樹苷（Rhoifolin），是類黃酮化合物，來源于沽油科山香圓的干燥葉和蕓香科植物果實(shí)，藥理作用：抗氧化，抗腫瘤，抗高血壓，黃嘌呤氧化酶抑制劑，由于是黃嘌呤氧化酶抑制劑，可以有效抑制體內(nèi)尿酸的生成，因而是開發(fā)治療痛風(fēng)新藥的特效成分。

柚皮苷（Naringin）是一種雙氫黃酮類化合物，有苦味，天然存在于蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，也是骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼、化橘紅等中藥的主要有效成分之一。柚皮苷具有多方面的生物活性，例如：抗氧化作用、抗癌作用、抗炎作用、抑菌作用和降血脂等作用。

目前，對(duì)相關(guān)天然產(chǎn)物的提取分離，藥物生理活性的研究，藥量藥效質(zhì)量控制，需要檢測(cè)野漆樹苷和柚皮苷的含量，因而需要使用對(duì)照品，由于柚皮柚普遍存在，對(duì)照品容易獲得，價(jià)格一般（65元/20mg），野漆樹苷植物來源少，其對(duì)照品價(jià)格昂貴，1300元/20mg，是柚皮苷價(jià)格的20倍。目前，野漆樹苷的來源主要為中藥山香圓葉或蕓香科毛橘紅果實(shí)，它們的含量均比較低，只占干物質(zhì)的0.1～0.6％，提取分離困難，在化橘紅果實(shí)中，野漆樹苷不足柚皮苷的5%，而且野漆樹苷與柚皮苷結(jié)構(gòu)與性質(zhì)高度相似，因而在提取分離中難以分開，要得到純度高的野漆樹難度更大，化橘紅葉中的野漆樹苷含量較高，是果實(shí)中的十幾倍，葉齡越小，野漆樹苷和柚皮苷的比例越大，野漆樹苷含量甚至比柚皮苷的高，兩者的總和占干物質(zhì)量可達(dá)13%以上。

溶劑法從化橘葉中提取野漆樹苷，通過液液萃取分離去除葉綠素和柚皮苷，再通過結(jié)晶和重結(jié)晶可得到純度高的野漆樹苷，但是要把大量的柚皮苷去除，工藝復(fù)雜，有機(jī)溶劑用量大，得率低，成本高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學(xué)對(duì)照品的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

本發(fā)明從中藥化橘紅葉中同時(shí)制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學(xué)對(duì)照品，包括化橘紅葉經(jīng)柱層析乙醇溶液提取、正丁醇-石油醚混合液萃取、水洗去除水溶性雜質(zhì)、反相高效液相制備色譜精制四個(gè)步驟，從而得到野漆樹苷和柚皮苷兩種化學(xué)對(duì)照品。兩種對(duì)照品的結(jié)構(gòu)如下：

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種同時(shí)制備野漆樹苷和柚皮苷兩種化學(xué)對(duì)照品的方法，步驟如下：

（1）化橘紅葉粉末制備：摘取化橘紅嫩葉，50～60℃烘箱烘干至恒重，粉碎過40～60目篩，得粉末備用；

（2）柱層析法提?。喝~粉末用乙醇溶液濕樣上柱，用相同濃度乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮回收溶劑，得化橘紅葉的乙醇提取物浸膏；

（3）有機(jī)溶劑萃取除去葉色素：浸膏轉(zhuǎn)移到分液漏斗，分3次用水洗滌燒瓶，合并到分液漏斗，用等體積正丁醇-石油醚混合液萃取去上層液，重復(fù)3次，得下層溶液混合物及沉淀；

（4）水洗去除水溶性雜質(zhì)：上述所得下層部分轉(zhuǎn)置4℃冰箱靜置12～20h，用冷水洗滌離心，去除水溶性多糖和蛋白質(zhì)雜質(zhì)，得粗產(chǎn)品；

（5）反相高效液相制備色譜精制：粗產(chǎn)品混合物以甲醇-水溶液溶解，0.22μm微孔濾膜過濾，以反相高效液相制備色譜儀分離，甲醇-水溶液為洗脫系統(tǒng)，325nm檢測(cè)，分別收集制備色譜中的兩個(gè)色譜峰物質(zhì)，減壓回收溶劑，48～52℃恒溫真空干燥22～26h，即得野漆樹苷和柚皮苷兩個(gè)化學(xué)對(duì)照品。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（1）中的嫩葉是抽出10～20天的嫩葉。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（2）中層析柱直徑為2～8cm，上樣的高徑比為9～11，洗脫液體積濃度為70～95%，收集洗脫液體積3～8倍量，減壓溫度45～80℃。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（3）中正丁醇-石油醚混合液其體積比為0.5～1.5：9.5～8.5，萃取3～4次。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（4）中水洗去除水溶性雜質(zhì)時(shí)，用水量是樣品體積2～4倍，離心轉(zhuǎn)速4000～10000r/min，重復(fù)3次。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（5）中野漆樹苷和柚皮苷的混合物以60％的甲醇溶解，樣品濃度為20～30mg/mL，反相高效液相制備色譜柱為ODS-C18。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（5）中，反相高效制備液相進(jìn)樣體積為1～4mL，流速為10～15mL/min，流動(dòng)相為甲醇-水溶液，梯度洗脫，時(shí)間程序：30%甲醇（0～5min），30～50%甲醇（5～25min）。

作為本發(fā)明再進(jìn)一步的方案：所述步驟（5）中，收集保留時(shí)間分別為13.5min和20.0min的餾分。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

1、本發(fā)明首次從化橘紅葉中制備野漆樹苷和柚皮苷兩個(gè)化學(xué)對(duì)照品，效率高，成本低，有效利用化橘紅葉資源，開辟了兩種化學(xué)對(duì)照品制備的新途徑，特別是野漆樹苷對(duì)照品的來源。

2、本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，化橘紅葉經(jīng)乙醇提取、正丁醇-石油醚萃取、反相高效液相制備色譜精制三個(gè)步驟，即可同時(shí)獲得純度大于98％的野漆樹苷和柚皮苷兩個(gè)化學(xué)對(duì)照品。

3、本發(fā)明成本低，綠色環(huán)保。原料資源化橘紅葉來源豐富、價(jià)廉，它含有兩種黃酮總和占干物質(zhì)的6～13.8%，所用試劑全部可回收利用。

附圖說明

圖1為高效液相制備柚皮苷與野漆樹苷色譜圖（325nm），從圖中可看出，在325nm波長(zhǎng)被檢測(cè)到的主要為柚皮苷和野漆樹苷，并且柚皮苷的保留時(shí)間先于野漆樹苷約6min，因此有足夠的時(shí)間差可以讓它們徹底分開。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

（1）乙醇提取：將化橘紅葉粉碎，過40目篩，稱取1kg粉末，用95%濕法均勻裝入玻璃層析柱中，用95%乙醇作洗脫液，洗脫液速度10mL/min，收集洗脫液2L。

（2）正丁醇-石油醚混合液萃?。菏占南疵撘航?jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮回收溶劑，得化橘紅葉的乙醇提取物浸膏約125mL，轉(zhuǎn)移到分液漏斗，分三次用少量水洗殘余，合并到分液漏斗，共200mL，用200mL正丁醇-石油醚（V/V，1：9）混合液萃取3次，去除上層葉色素液，得到下層含目標(biāo)成分沉淀和溶液。

（3）冷卻析出：把上述得到的下層部分轉(zhuǎn)移到離心管中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH4，置4℃冰箱中過夜，取出冷凍離心機(jī)離心15min，轉(zhuǎn)速8000r/min，去上清液，沉淀再用3倍冷水洗滌2次，得到淡綠色沉淀，即野漆樹苷和柚皮苷混合物粗產(chǎn)品，干重7.2g。

（4）反相高效液相制備色譜精制：野漆樹苷和柚皮苷的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成濃度為30mg/mL的樣品溶液，微孔濾膜過濾，色譜柱為ODS-C18（10mm×250mm，15μm），進(jìn)樣體積為4mL，流速為30mL/min，流動(dòng)相為甲醇-水溶液，梯度洗脫，時(shí)間程序：30%甲醇（0~5min），40%甲醇（5~25min），收集保留時(shí)間分別為13.5min和20.0min的餾分，減壓回收溶劑，干燥，即得柚皮苷和野漆樹苷兩種對(duì)照品。

采用反相高效液相分析色譜分析了其純度，純度均達(dá)到98％以上，如圖1所示。單針進(jìn)樣可獲取野漆樹苷56mg、柚皮苷45mg，收率約為89％，野漆樹苷淡綠色粉末，柚皮苷為白色粉末。

實(shí)施例2

（1）乙醇提?。簩⒒偌t葉粉碎，過40目篩，稱取1kg粉末，用95%濕潤(rùn)均勻裝入玻璃層析柱中，用95%乙醇作洗脫液，洗脫速度10mL/min，收集洗脫液3L。

（2）正丁醇-石油醚混合液萃?。菏占南疵撘航?jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮回收溶劑，得化橘紅葉的乙醇提取物浸膏約150mL，轉(zhuǎn)移到分液漏斗，分三次用少量水洗殘余，合并到分液漏斗，共200mL，用200mL正丁醇-石油醚（V/V，1：9）混合液萃取4次，去除上層葉色素液，得到下層含目標(biāo)成分沉淀和溶液。

（3）冷卻析出：把上述得到的下層部分轉(zhuǎn)移到離心管中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH4，置4℃冰箱中過夜，取出冷凍離心機(jī)離心15min，轉(zhuǎn)速5000r/min，去上清液，沉淀再用2倍冷水洗滌3次，得到淡綠色沉淀，即野漆樹苷和柚皮苷混合物粗產(chǎn)品，干重8.1g。

（4）反相高效液相制備色譜精制：野漆樹苷和柚皮苷的混合物以60％甲醇水溶液溶解，配成濃度為50mg/mL的樣品溶液，微孔濾膜過濾，色譜柱為ODS-C18（20mm×250mm，15μm），進(jìn)樣體積為5mL，流速為50mL/min，流動(dòng)相為甲醇-水溶液，梯度洗脫，時(shí)間程序：30%甲醇（0~5min），40%甲醇（5~25min），收集保留時(shí)間分別為13.5min和20.0min的餾分，減壓回收溶劑，干燥，即得柚皮苷和野漆樹苷兩種對(duì)照品。

采用反相高效液相分析色譜分析了其純度，純度均達(dá)到98％以上。單針進(jìn)樣可獲取野漆樹苷106mg、柚皮苷129mg，收率約為86％，野漆樹苷淡綠色粉末，柚皮苷為白色粉末。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的任何附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。