蘇云金芽孢桿菌vip3A-6基因、表達蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蘇云金芽孢桿菌vip3A-6基因、表達蛋白及其應(yīng)用，屬于生物化 學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜菜夜蛾，學(xué)名：Laphygma exigua Hubner，英文名：Beet army worm，別名：貪夜 蛾。蟲態(tài)有成蟲、卵、幼蟲、蛹，以幼蟲為害植株。初孵幼蟲群集葉背，吐絲結(jié)網(wǎng)，在葉內(nèi)取 食葉肉，留下表皮，成透明的小孔；3齡后可將葉片吃成孔洞或缺刻；大齡幼蟲還可鉆蛀青 椒、番茄果實。發(fā)生規(guī)律和危害特點：初齡幼蟲在葉背群集吐絲結(jié)網(wǎng)，食量小，3齡后，分散 為害，食量大增，晝伏夜出，危害葉片成孔缺刻，嚴重時，可吃光葉肉，僅留葉脈，甚至剝食莖 桿皮層。幼蟲可成群迀飛，稍受震擾吐絲落地，有假死性。3-4齡后，白天潛于植株下部或 土縫，傍晚移出取食為害。一年發(fā)生6-98代，7-8月發(fā)生多，高溫、干旱年份更多，常和斜紋 夜蛾混發(fā)，對葉菜類威脅甚大。甜菜夜蛾這種間隙性大發(fā)生的雜食性害蟲，自上世紀90年 代開始在棉區(qū)發(fā)生危害以來，近些年的發(fā)生危害呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢，已經(jīng)擴展到甘藍、白 菜、番茄、青椒、馬鈴薯、芹菜等多種蔬菜及大豆等170余種植物。近年來甜菜夜蛾為害猖 獗，暴發(fā)成災(zāi)，許多農(nóng)民頻繁用藥仍防效不佳，只得每天早晚到田里捕捉，望田興嘆。蘇云金 芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)在《伯杰氏細菌鑒定手冊》第九版中歸屬于 第二類第十八群，革蘭氏陽性，芽孢桿菌屬的一個種。它形成芽孢的過程中，在菌體內(nèi)的一 端或兩端形成一個或多個形狀一致或不同的伴胞晶體（parasporal crystal)。這種伴胞 晶體的主要成分是具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)，故又稱為殺蟲晶體蛋白（ICPs)或內(nèi)毒素 (S -endotoxin)。該殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛 目等多種昆蟲，以及線蟲、螨類和原生動物等具有特異性的殺蟲活性（G.M. Faust等1983 ; D. L. Edwards等1988 ;F. Baroy等1998)。Bt對人畜無害，不污染環(huán)境，因而Bt在害蟲的生 物防治中得到了最廣泛的應(yīng)用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)Bt在營養(yǎng)期分泌的一類新型殺蟲毒蛋白 即營養(yǎng)期殺蟲蛋白（VIPs)，它不同于Bt的殺蟲晶體蛋白，是一種在Bt營養(yǎng)生長中期和產(chǎn)胞 期分泌到細胞外的毒素蛋白，直至穩(wěn)定前期達到最高峰（J. J. Estruch等1996 ;G. W. Warren 等1998 ;J. J. Estruch等2000)，它一般不形成伴胞晶體。具有熱不穩(wěn)定性（E. Schnepf等 1998);對鱗翅目、鞘翅目昆蟲具有較廣譜的殺蟲活性，甚至是一些對Bt殺蟲晶體蛋白有很 強抗性的昆蟲如小地老虎都有較強活性，而且對草地貪夜蛾、甜菜夜蛾、煙蚜夜蛾、棉鈴蟲 等一系列害蟲都有活性（L.L.L 〇gUerci〇等2002)，毒效都在納克（ng)水平上。該蛋白的發(fā) 現(xiàn)使得Bt殺蟲劑在殺蟲活性、殺蟲范圍方面得到很大突破，在一定程度上克服了許多害蟲 對Bt內(nèi)毒素低敏感或不敏感的弊端?？梢姡琕IPs是一個極為豐富而且是具有巨大潛力的 資源。該領(lǐng)域已成為Bt研宄的熱點。PCR鑒定體系的建立和應(yīng)用，極大地加快了 Bt菌株篩 選、生物活性測定、新基因的分離克隆等項研宄的速度。研宄表明，通過PCR和生物活性測 定相結(jié)合是收集Bt中營養(yǎng)期殺蟲蛋白活性的首選策略（L. L. Loguercio等2002)。vip基 因的發(fā)現(xiàn)與鑒定對于研宄Bt資源的多樣性、預(yù)測其殺蟲活性、快速篩選優(yōu)良菌株、分離克 隆新的Vip基因有十分重要的意義。如何尋找到蘇云金芽孢桿菌表達蛋白對甜菜夜蛾有高 毒力的基因成為急需解決的難題？所以，發(fā)明蘇云金芽孢桿菌vip3A-6基因、表達蛋白及 其應(yīng)用，尋找到一個表達蛋白對甜菜夜蛾具有高毒力以應(yīng)用于害蟲生物防治的蘇云金芽孢 桿菌vip3A-6基因是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了克服尋找蘇云金芽孢桿菌表達蛋白對甜菜夜蛾有高毒力基因的難題，本發(fā)明 提供了一個蘇云金芽孢桿菌vip3A-6基因、表達蛋白及其應(yīng)用，該蘇云金芽孢桿菌vip3A-6 基因、表達蛋白及其應(yīng)用其表達蛋白對甜菜夜蛾生物活性試驗進行初篩和復(fù)篩，7d后分別 調(diào)查死、活蟲數(shù)，計算校正死亡率和LC 5(I。結(jié)果可知，蘇云金芽孢桿菌的vip3A-6基因表達蛋 白在復(fù)篩時對甜菜夜蛾半致死濃度為4. 783 y g/g (2. 234-7. 784 y g/g)，當表達蛋白濃度達 到81 y g/g時，所有甜菜夜蛾均死亡，可見vip3A-6基因表達蛋白對甜菜夜蛾具有高毒力。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0005] 蘇云金芽孢桿菌vip3A_6基因、表達蛋白及其應(yīng)用的核酸序列為Seq ID N〇:l，具 體構(gòu)建及驗證過程如下：
[0006] 1.基因的PCR擴增：將提取的Bt菌基因組DNA使用vip-5/vip-3引物對進行PCR 擴增，引物序列見表1。參照GenBank中公布的vip3A基因編碼區(qū)的N端和C端序列同源 性，設(shè)計合成一對特異性引物vip-5/vip_3,分別在5'端引入Ndel和Sail酶切位點（箭頭 所示），用于擴增全長基因。
[0007] 2. 2.PCR反應(yīng)體系：KOD聚合酶反應(yīng)體系50yL;K0D酶lyL;引物對（lOmmol/ L) 1 U L ;模板 1 y L ; 10x PCR Buffer 5 y L ;MgS043 y L ;dNTP 5 y L ;ddH20 補足至 50 y L ;
[0008] 3. PCR反應(yīng)條件（表2)
[0009] 4. DNA回收：⑴使用滅菌解剖刀切下含目的DNA片段的凝膠，置于1.5mL離心 中；（2)加入3倍體積溶膠的溶膠緩沖液A，置于50°C水浴鍋中l(wèi)Omin左右；（3)待膠完全 溶解后加入〇. 5個A溶膠緩沖液體積的B溶液；(4)混勻后轉(zhuǎn)入回收柱，12000r/min離心 lmin ; (5)去除殘留液體，加入洗脫緩沖液W1 500 y L，12000r/min離心lmin ; (6)去除殘留 液體，洗脫緩沖液W2 700 y L，洗脫兩次；（7)將30 y L的TE溶液加入回收柱中，室溫靜置 2min;(8)將上步回收柱12000r/min離心lmin，備用。如需要可以重復(fù)7-8步驟一次。 [0010] 5.連接反應(yīng)：將DNA膠回收產(chǎn)物與pEB載體按照連接體系（目的片段DNA 4 y L， 載體DNA 1 y L，連接試劑盒Solution I 5 y L)進行連接反應(yīng)。充分混勻后，16°C連接4h或 4°C條件下連接過夜。
[0011] 6.大腸桿菌熱激轉(zhuǎn)化：將連接產(chǎn)物全量加入到100 y L大腸桿菌JM109的感受態(tài) 細胞中，混勻，冰浴30min以上，取出離心管42°C準確熱擊90s，再冰浴3min，加入900 y L LB 液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)lh左右，取200 yL于LB固體平板涂布，加入相應(yīng)的抗生素，X-gal溶 液40 y L，IPTG溶液4 y L，37°C培養(yǎng)過夜，進行藍白班篩選，篩選出方向連接正確的陽性克 隆，以PEB載體的正向引物pEBF和所克隆基因的反向引物進行PCR鑒定。提取陽性克隆菌 株的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta菌株感受態(tài)細胞中。經(jīng)PCR、酶切等鑒定后再通過序列測 定，鑒定出的正確重組轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)和表達目的蛋白。
[0012] 7.大腸桿菌質(zhì)粒DNA提取：（1)挑取陽性轉(zhuǎn)化子于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，取 l_4ml菌液于12000r/min離心lmin，棄去上清；（2)加入250 y L含有50mg/ml RNAase的 SI溶液懸浮沉淀；（3)加入250 y L細菌