專利名稱：蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明是涉及生物學免疫方法的測定技術領域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測蘇云金芽孢桿菌的檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)于1901年在日本被發(fā)現(xiàn)， 1911年由柏林納從地中海粉螟的患病幼蟲中分離出來，并依其發(fā)現(xiàn)地點德國蘇云金省而命名。蘇云金芽孢桿菌簡稱蘇云金桿菌，為革蘭氏陽性土壤桿菌，屬于芽孢桿菌屬，其菌體為短桿狀，生鞭毛，單生或形成短鏈。它在芽孢形成過程中產(chǎn)生稱為S-內(nèi)毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白(控制合成這種蛋白質(zhì)的基因在質(zhì)粒上)，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術，制備一種快速檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑盒。 這種方法開始于上個世紀90年代中期，是在免疫滲濾法的基礎上發(fā)展起來的，是免疫親和技術、印刷技術、免疫標記技術和層析技術的結合。這種方法不僅具有敏感、特異、便捷、快速等特點，而且適合基層和現(xiàn)場使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方便、快捷地檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑盒，用于檢測樣本中的蘇云金芽孢桿菌。本試劑盒的工作原理是利用特異性抗原-抗體的結合，用膠體金標記抗體，與待檢抗原結合后，與包被在硝酸纖維素膜上的抗體結合形成夾心物而顯色。 本發(fā)明還涉及制備上述檢測試劑盒的方法。本發(fā)明的技術方案一種蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒，由樣品墊(1)、膠體金墊 O)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)組成，PVC支撐板上依次粘貼樣品墊、 膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸樣墊，膠體金墊上包被了蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上依次包被有蘇云金芽孢桿菌多抗和羊抗鼠IgG抗體，其中以蘇云金芽孢桿菌多抗包被線作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG抗體包被線作為質(zhì)控線(C線)。本發(fā)明還提供了一種蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟(1)制備膠體金顆粒取0. 01 %的氯金酸水溶液IOOmL,加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液0. 75mL,繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。(2)制備膠體金墊取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，用0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的 PH值調(diào)至9. 0，室溫放置10分鐘；逐滴加入蛋白濃度為0. 2mg/ml的蘇云金芽孢桿菌多抗0. (Mml，混合均勻，室溫放置30分鐘；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；11000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，用含5%蔗糖的 0. 002mol/L pH 9. 0的硼酸鹽緩沖液5mL復溶，重復2次；最后用硼酸鹽緩沖液溶解至3mL， 得到蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物；將蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物按ImL鋪56cm2的比例均勻鋪在無紡布上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥 2-4小時，制成膠體金墊。(3)包被蘇云金芽孢桿菌多抗、羊抗鼠IgG設定劃膜儀涂覆參數(shù)1 μ L/cm,分別用微量進樣器取0. 2mL蘇云金芽孢桿菌多抗、 羊抗鼠IgG，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆蘇云金芽孢桿菌多抗(T線)、羊抗鼠IgG (C線)。劃線后將硝酸纖維素膜放置在烘箱中，溫度38°C，干燥M小時，備用。(4)試劑盒的組裝將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊由一端依次黏附在PVC支撐板上，即可形成檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑條，試劑條也可以裝入塑料卡中形成卡型包裝。本發(fā)明采用層析式雙抗體夾心法，運用樣品中含有的蘇云金芽孢桿菌與金標蘇云金芽孢桿菌多抗結合，然后在毛細管作用下層析至檢測區(qū)，與事先包被在檢測區(qū)的蘇云金芽孢桿菌多抗反應，形成夾心物而顯色的原理檢測蘇云金芽孢桿菌。本發(fā)明所述試劑盒的檢測方法為將被檢樣品平衡至室溫；取出蘇云金芽孢桿菌檢測裝置，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，10分鐘時觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。本發(fā)明所述的試劑盒采用膠體金免疫層析技術測定蘇云金芽孢桿菌，檢測時，將被測樣品加在試紙條(卡)上的樣品墊上，可以直接觀察到免疫反應的結果，完成樣品檢測。本發(fā)明可用于檢測樣本中可能存在的蘇云金芽孢桿菌，具有使用方便、操作簡單、反應迅速、經(jīng)濟實用等特點。


圖1蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒結構示意圖；附圖符號說明1 樣品墊；2 含有標記蘇云金芽孢桿菌多抗的膠體金墊；3 硝酸纖維素膜(T 包被了蘇云金芽孢桿菌多抗的檢測線；C 包被了羊抗鼠IgG 的質(zhì)控線)；4 吸樣墊；5 =PVC 支撐板；圖2本發(fā)明試劑盒的檢測結果示意圖。自左至右依次為T、C兩條線陽性檢測結果；C 一條線陰性檢測結果；無效。
具體實施例方式實施例1 蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒的制備(1)制備膠體金顆粒取0. 01 %的氯金酸水溶液IOOmL,加熱煮沸。根據(jù)需要迅速加入1 %枸櫞酸三鈉水溶液0. 75mL,繼續(xù)煮沸約5min，出現(xiàn)橙紅色。這樣制成的膠體金顆粒的大小為20-40nm。(2)制備膠體金墊
取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，用0. lmol/L K2CO3將膠體金溶液的 PH值調(diào)至9. 0，室溫放置10分鐘；逐滴加入蛋白濃度為0. 2mg/ml的蘇云金芽孢桿菌多抗0. (Mml，混合均勻，室溫放置30分鐘；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA)溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；11000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，用含5%蔗糖的 0. 002mol/L pH 9. 0的硼酸鹽緩沖液5mL復溶，重復2次；最后用硼酸鹽緩沖液溶解至3mL， 得到蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物；將蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物按ImL 鋪56cm2的比例均勻鋪在無紡布上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥 2-4小時，制成膠體金墊。(3)包被蘇云金芽孢桿菌多抗、羊抗鼠IgG設定劃膜儀涂覆參數(shù)1 μ L/cm,分別用微量進樣器取0. 2mL蘇云金芽孢桿菌多抗、 羊抗鼠IgG，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆蘇云金芽孢桿菌多抗(T線)、羊抗鼠IgG (C線)。劃線后將硝酸纖維素膜放置在烘箱中，溫度38°C，干燥M小時，備用。(4)試劑盒的組裝將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊由一端依次黏附在PVC支撐板上，即可形成檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑條，試劑條也可以裝入塑料卡中形成卡型包裝。實施例2 蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒的要求(1)陰性參考品符合率用磷酸緩沖溶液(PBS 0. Olmol/L、pH 7. 5)配制濃度為100 μ g/mL的大腸桿菌標準溶液進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，T線不顯色，C線均呈現(xiàn)紅色，結果為陰性。用磷酸緩沖溶液(PBS 0. Olmol/L、pH 7. 5)配制濃度為100 μ g/mL的牛血清蛋白標準溶液進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，T線不顯色，C線均呈現(xiàn)紅色，結果為陰性。(2)陽性參考品符合率用磷酸緩沖溶液(PBS0. 01mol/L,pH 7. 5)配制濃度為 500、1000、1500ng/mL 的蘇云金芽孢桿菌標準品，各濃度分別進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，T、C線均呈現(xiàn)紅色條帶，結果為陽性。(3)最低檢出量用磷酸緩沖溶液(PBS0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為 0、300、500、1000ng/mL 的蘇云金芽孢桿菌標準品，各濃度分別進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，0、 300ng/mL的蘇云金芽孢桿菌標準品的檢測結果為僅C線顯色且顯色度均一，為陰性結果； 500U000ng/mL的蘇云金芽孢桿菌標準品的檢測結果為T、C線均顯色，判定為陽性檢測結果；最低檢出量不高于500ng/mL。(4)重復性用磷酸緩沖溶液(PBS 0. 01mol/L、pH 7. 5)配制濃度為500ng/mL的蘇云金芽孢桿菌標準品，進行10次平行檢驗，10分鐘時觀察檢測結果，結果均為陽性，顯色度均一。(5)穩(wěn)定性37°C放置10天后，各項指標均符合以上要求。
實施例3 蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒的檢測方法將被檢樣品平衡至室溫；取出蘇云金芽孢桿菌檢測裝置，水平放置；在樣品墊中加入2-3滴樣品，樣品中的液體依靠虹吸作用上行，10分鐘時觀察并記錄C、T線的顯色情況，判斷檢測結果。檢測樣本時，若樣本中含有蘇云金芽孢桿菌，則與膠體金標記的蘇云金芽孢桿菌多抗結合形成相應的復合物，在毛細管作用下復合物向吸樣墊一端層析，當樣品-膠體金標記蘇云金芽孢桿菌多抗復合物層析至硝酸纖維素膜上的蘇云金芽孢桿菌多抗包被線(T 線)上時，復合物與蘇云金芽孢桿菌多抗結合，形成“膠體金-蘇云金芽孢桿菌多抗-蘇云金芽孢桿菌-蘇云金芽孢桿菌多抗”夾心物而凝聚顯色，此時T包被線可觀察到紅色條帶。 無論樣品中是否含有蘇云金芽孢桿菌，膠體金標記蘇云金芽孢桿菌多抗繼續(xù)向吸樣墊一端層析，與包被在硝酸纖維素膜上的羊抗鼠IgG結合而凝聚顯色，此時C包被線可觀察到紅色條帶。在T包被線可觀察到紅色條帶，判定為陽性結果，即樣品中含有蘇云金芽孢桿菌；無論樣品中是否含有蘇云金芽孢桿菌，一條紅色條帶都會出現(xiàn)在質(zhì)控線(C)。質(zhì)控區(qū)線(C)所顯現(xiàn)的紅色條帶是判定是否有足夠樣本，層析過程是否正常的標準，同時也作為試劑的內(nèi)控標準。
權利要求
1.一種蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于由樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊和PVC支撐板組成，樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊依次粘貼在PVC支撐板上，膠體金墊為膠體金標記的蘇云金芽孢桿菌多抗玻璃纖維或無紡布，硝酸纖維素膜上依次包被了蘇云金芽孢桿菌多抗作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線(C線)。
2.—種權利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的樣品墊為玻璃纖維或無紡布，吸樣墊為吸水濾紙。
3.—種權利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑枸櫞酸三鈉作用下制成大小為20-40nm的膠體金顆粒。
4.一種權利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的膠體金墊的制備方法為取顆粒大小為20-40nm的膠體金溶液5ml，用0. lmol/L K2COdf 膠體金溶液的PH值調(diào)至9. 0，室溫放置10分鐘；逐滴加入蛋白濃度為0. 2mg/ml的蘇云金芽孢桿菌多抗0. (Mml，混合均勻，室溫放置30分鐘；加入0. 075ml 10%牛血清蛋白(BSA) 溶液，混合均勻，室溫放置10分鐘；11000轉離心30分鐘，仔細吸取上清液，棄去，用含5% 蔗糖的0. 002mol/L pH 9. 0的硼酸鹽緩沖液5mL復溶，重復2次；最后用硼酸鹽緩沖液溶解至3mL，得到蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物；將蘇云金芽孢桿菌多抗-膠體金標記物按ImL鋪56cm2的比例均勻鋪在無紡布上，再置干燥間，在溫度38°C，濕度小于30%的條件下干燥2-4小時，制成膠體金墊。
5.一種權利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的硝酸纖維素膜上的兩條線的包被方法為設定劃膜儀涂覆參數(shù)1 μ L/cm,分別用微量進樣器取0. 2mL蘇云金芽孢桿菌多抗、羊抗鼠IgG，按順序接到劃膜儀的A、B管道接口。將貼有硝酸纖維素膜的PVC板置于劃膜儀的往復運動平臺上，開啟劃膜儀，在硝酸纖維素膜上涂覆蘇云金芽孢桿菌多抗(T線)、羊抗鼠IgG(C線)。劃線后將硝酸纖維素膜放置在烘箱中，溫度38 V，干燥M小時，備用。
6.一種權利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法，其特征在于所述的蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒的組裝方法為將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸樣墊由一端依次黏附在PVC支撐板上，即可形成檢測蘇云金芽孢桿菌的試劑條，試劑條也可以裝入塑料卡中形成卡型包裝。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物學免疫方法的測定技術領域，特別涉及一種蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒及其制備方法。試劑盒包括樣品墊(1)、膠體金墊(2)、硝酸纖維素膜(3)、吸樣墊(4)和PVC支撐板(5)。膠體金墊為膠體金標記的蘇云金芽孢桿菌多抗玻璃纖維(或無紡布)，硝酸纖維素膜上依次包被了蘇云金芽孢桿菌多抗作為檢測線(T線)，羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線(C線)。本發(fā)明采用膠體金免疫層析技術制備蘇云金芽孢桿菌檢測試劑盒，用于檢測樣本中可能存在的蘇云金芽孢桿菌，本發(fā)明具有使用方便、操作簡單、反應迅速、經(jīng)濟實用等特點。
文檔編號G01N33/531GK102253202SQ201010173609
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權日2010年5月17日
發(fā)明者李鋒, 陳立柱 申請人:北京庫爾科技有限公司