專利名稱：蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體突變蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種蘇云金芽孢桿菌CrylAa殺蟲晶體突變蛋白，其包含選自H168R、N372G或N372A的任一種單點突變，以及它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自20世紀(jì)60年代以來，由于化學(xué)類農(nóng)藥對環(huán)境的危害日漸突出，而且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上害蟲的抗藥性急劇增加，綠色環(huán)保的生物防治方法越來越受到人們的關(guān)注。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)為革蘭氏陽性菌,是一類對害蟲毒力強、致死速度快，且對害蟲天敵無毒性的昆蟲病原微生物，在菌體的穩(wěn)定生長期可形成伴胞晶體蛋白，又稱殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein, ICP)或5 -內(nèi)毒素。ICP是由CRY基因和CYT基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。Bt是目前世界上生產(chǎn)量最大的生物殺蟲劑，已廣泛應(yīng)用于控制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目的害蟲，此外還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目的多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有選擇性的殺蟲活性。由于Bt具有專一性強，對環(huán)境友好，對人畜無害，生物降解無殘毒等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。自1981年Schnepf和Whiteley首次成功地克隆了一個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因以來，迄今為止，已分離出235種殺蟲晶體蛋白(Crickmore et al. ,2012)。這些蛋白按其氨基酸序列的同源性已被分為Cryl Cry70、Cytl、Cyt2、Cyt3共73類,其中Cryl類含有CrylA至M,共14亞類。而CrylAa是CrylAa至CrylAi的一個基因家族,CrylAa共含有21個基因型，依次命名為CrylAal CrylAa21。通過對Cry 1A，Cry2A，Cry3A等具有代表性的毒素蛋白的三維結(jié)構(gòu)以及Cry殺蟲晶體蛋白氨基酸的同源性分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)Cry蛋白在一級結(jié)構(gòu)上存在5 8個保守區(qū)，而空間結(jié)構(gòu)都為相似的球狀蛋白，由三個典型的結(jié)構(gòu)域組成Domainl位于肽鏈的N端，為一組由6 7個兩親的a -螺旋(helix)圍繞著一個疏水核心的a -螺旋形成的a -螺旋束，參與了細(xì)胞膜的穿孔；Domain2位于肽鏈的中間，由三組反平行的￠-折疊片層(sheet)組成，呈P -三棱柱狀圍成一個三角形的疏水內(nèi)核，在Domain2頂端的3個環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)形成一個類似于免疫球蛋白的抗原決定區(qū)，參與了毒素與受體蛋白的識別與結(jié)合(Wu S.，etal. , 1996 ；Bravo A, et al. , 2005);位于C端的Domain3由兩組反平行的￠-折疊片層組成的夾心結(jié)構(gòu)，以P果醬卷(jelly roll)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)排列，主要功能包括保持毒素的穩(wěn)定性，防止蛋白酶對毒素分子的過度降解、調(diào)節(jié)毒素的活性、以及與受體的結(jié)合等(Jenkins J.，et al. , 2005)。不同殺蟲晶體蛋白之間的Domain2的差異最大,尤其是位于頂端的loop部分，在氨基酸序列、長度、構(gòu)象等方面都存在很大的不同，正是由于不同殺蟲晶體蛋白之間的這些差異，Domain2被認(rèn)為是決定蛋白殺蟲特異性的重要因子。定點突變技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于Cry蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究。通過晶體衍射和同源建模的方法進一步理解殺蟲晶體蛋白三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，篩選出關(guān)鍵殘基進行定點突變實驗可以開發(fā)出毒性更高、殺蟲譜更廣的殺蟲蛋白。根據(jù)已有的報道，Cry蛋白的3個結(jié)構(gòu)域的定點突變，都能導(dǎo)致蛋白活性的改變，多數(shù)突變降低了毒素的作用，但也有部分突變提高了 Cry蛋白的毒性。最早在1992年，Wu和Aronson發(fā)現(xiàn)CrylAc成孔域(Domain I) a 5螺旋的一個突變H168R促進了 CrylAc蛋白不可逆的結(jié)合，使蛋白對煙草天蛾毒性提高了 2倍(Wu D.，et al.，1992) ；Cry4B Domain I的R204A突變則可能通過去除蛋白水解的不穩(wěn)定位點而將毒性提高了 3 倍(Angsuthanasombat C. , et al. , 1993) ；Cry3A Domain II 的Ioopl在與受體結(jié)合中具有重要作用，該環(huán)上的兩種多點突變A1(R345A-Y350F-Y351F)和A2 (R345A-AY350-AY351)可使 Cry3A 對鞘翅目 Tenebrio molitor 的毒性分別提高了 7 倍和 11 倍(ffu S. ,et al. ,2000) ;CrylAb 蛋白 domain II loop2 的點突變 N372A 或 N372G 使蛋白對舞毒蛾的毒性提高了 8倍，同時對刷狀緣膜囊泡中受體的親和力增加了 4倍。而在loop 2和loop a 8上的N372A，A282G和L283S三重突變，毒性更是提高了 36倍，比CrylAa毒性則提高4倍。兩種突變蛋白都與昆蟲的刷狀緣膜囊泡親和力高，說明突變提高了 Cry蛋白與受體的結(jié)合作用，從而提高了對昆蟲的毒性(Rajamohan F. , et al. ,1996)。Ecogen公司在對Cry3B模型充分研究的基礎(chǔ)上，對其進行了一系列的定點突變工作，得到了許多毒性有所提高的突變蛋白，于2000年獲得專利(English，et al. ,2000, US Patent 6060594)。Monsanto公司Baum等對CrylCa的整個開放閱讀框的部分位點進行了定點突變，生物測定實驗的結(jié)果表明，CrylC R148G、CrylC R148M、CrylC R148L、CrylC R148A、CrylC R148D、CrylC 563 (El 18D-N121H-A124T)、CrylC 499(N121H)和CrylC579 (E118V-A124G)突變晶體的毒性都比野生CrylC活性高，該技術(shù)于2004年獲得專利(Baum, et al. 2004, US Patent 6825006)。CrylAa在Cryl類殺蟲晶體蛋白中的殺蟲能力是比較突出的，所以也導(dǎo)致了它在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，但是隨著抗性增強，CrylAa的殺蟲效果明顯下降，而在CrylAa殺蟲晶體蛋白上的關(guān)鍵位點的定點突變工作尚未開展。盡管CrylAc與CrylAa的序列同源性比較高并且功能相似，但是因為Bt蛋白在自然界中產(chǎn)生突變的速度很快，近來越來越多的新bt蛋白被鑒定，目前還沒有人在CrylAa的這些位點上進行突變位點的研究。因此，本發(fā)明為有效提高CrylAa的殺蟲效果，同時為更好地研究和理解Bt的殺蟲機制提供了方法和借鑒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明對CrylAa殺蟲晶體蛋白進行單點突變，分別是H168R，N372G和N372A，首次對CrylAa蛋白的這些關(guān)鍵位點的功能進行了研究，并且將突變質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入Bt菌株中并獲得穩(wěn)定表達，將突變的Bt蛋白制備后，采用細(xì)胞學(xué)快速檢測方法，即先用野生型蛋白緩沖液作為對照，摸索合適的蛋白的濃度用于細(xì)胞實驗，然后再比較同樣濃度條件下的野生型蛋白和突變蛋白對昆蟲細(xì)胞的致死數(shù)目，從而快速準(zhǔn)確地鑒定出突變蛋白較之野生型有更好的殺蟲效果。因此，本發(fā)明的目的在于通過單點突變的方法獲得CrylAa的單點突變蛋白，其包含選自 H168R、N372G 或 N372A 的任一種單點突變(即，CrylAa H168R, CrylAa N372G 和CrylAa N372A)，從而獲得提高CrylAa的殺蟲活性的有效方法。本發(fā)明對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要的應(yīng)用價值的同時，對環(huán)境友好安全。本發(fā)明還提供上述三種蘇云金芽孢桿菌CrylAa殺蟲晶體的突變蛋白用于制備殺蟲劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種殺蟲劑，其包含有效量的上述三種蘇云金芽孢桿菌CrylAa殺蟲晶體的突變蛋白中的任一種。本發(fā)明的殺蟲劑可用于殺滅鱗翅目、雙翅目、鞘翅目的害蟲，還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目的多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有具有具有特異性的殺蟲活性。檢測本發(fā)明的CrylAa的單點突變蛋白(H168R，N372G和N372A)的殺蟲效果的實驗對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是清楚的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的檢測方法對突變蛋白的殺蟲活性和效果進行檢測。通常，本領(lǐng)域一般采用生物活性測定方法進行檢測，即將所構(gòu) 建的突變體蛋白以適當(dāng)?shù)臐舛葢?yīng)用于孵育試蟲，培育適當(dāng)時間后檢測存活的試蟲的數(shù)目，但是生物活性測定方法一般實驗周期比較長，鑒于此，本發(fā)明人采用了一種細(xì)胞學(xué)檢測方法，該細(xì)胞學(xué)檢測方法的詳細(xì)步驟如下所述I)復(fù)蘇培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞系Sf9(購自百恩維生物公司)，加入IX青鏈霉素，5mlTC100培養(yǎng)基(PAA公司)培養(yǎng)3天。2) 3天左右細(xì)胞數(shù)量達到IO6個mr1后進行繼代培養(yǎng)，3000g (印pendorf公司5702型)離心5min收集細(xì)胞，再用Iml新鮮的培養(yǎng)基緩慢吹吸和重懸細(xì)胞，吸出到含有9ml新鮮培養(yǎng)基的IOcm培養(yǎng)皿上搖勻后繼續(xù)培養(yǎng)。3)等到細(xì)胞數(shù)量達到IO6個ml'離心收集，再用新鮮的TC100培養(yǎng)基12ml緩慢重懸細(xì)胞，分裝到細(xì)胞培養(yǎng)6孔板上,每孔加入2ml。注意搖勻，防止細(xì)胞聚團。4)顯微鏡(10倍目鏡)下觀察細(xì)胞形狀以及大小。5)將事先用濾膜過濾除菌稀釋好的蛋白以及緩沖液等樣品依次加入到細(xì)胞培養(yǎng)板的每個孔中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中27°C培養(yǎng)3h。6)孵育3h后，離心收集細(xì)胞，用IOOiil PBS (磷酸緩沖液)重懸吹打均勻，再用臺盼藍染液進行染色，在血球計數(shù)板上統(tǒng)計未著色細(xì)胞(活細(xì)胞)和著色細(xì)胞(死細(xì)胞)數(shù)目。7)統(tǒng)計數(shù)目并分析結(jié)果。


從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中圖I顯示CrylAa蛋白的分子篩結(jié)果(圖1A)和SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖1B)。圖2顯示不同濃度的CrylAa蛋白對昆蟲細(xì)胞系Sf9的致死效果。圖3顯示不同CrylAa蛋白在相同蛋白濃度(0. 04mg mF1)下對昆蟲細(xì)胞系Sf9的致死效果。圖4顯示不同CrylAa蛋白在相同蛋白濃度(0. 004mg mF1)下對昆蟲細(xì)胞Sf9的致死效果。序列表說明SEQ ID No. I 野生型CrylAa的氨基酸序列SEQ ID No. 2 CrylAa突變體H168R的氨基酸序列SEQ ID No. 3 CrylAa突變體N372G的氨基酸序列
SEQ ID No. 4 CrylAa突變體N372A的氨基酸序列
具體實施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述實施例僅是舉例說明本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，除非另外指明，實施例中所用的試劑均為市售分析純級別的試劑。實施例I :CrvlAa野牛型蛋白的提取含有CrylAa基因的Bt菌株(可以按照常規(guī)分子克隆方法以Bt野生型菌株為材料講行克降，克降方法可參見Schnepf H. E. and Whiteley H. R. ,1981, Bt野生型菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(菌株編號I. 1014))培養(yǎng)到對數(shù)期后離心收菌，用50mMNa2CO3-HCl (包含5% 3 -巰基乙醇，pH 9.5)充分懸浮沉淀，37°C保溫lh，離心(2850g，離心機購自Beckman公司Allegra X-15R型號)5min,去沉淀(即去除不溶解的伴胞晶體和芽胞)，上清液即為晶體蛋白溶液的初制品。將晶體蛋白上清液滴加4M NaAc-HAc (pH 4. 4)，約1/20體積，離心，去上清，沉淀用ddH20洗3次，再用50mM Na2CO3-HCl (pH9. 5)溶解上述蛋白沉淀，離心(沉淀為少量變性蛋白和雜質(zhì))，上清液即為可溶性晶體蛋白。按胰蛋白酶晶體蛋白=I 50加入胰蛋白酶溶液到可溶性晶體蛋白溶液中，37°C處理60min。再將酶解之后的溶液進行分子篩純化，純化之后進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白。圖I顯示了野生型CrylAa蛋白進行酶解之后的分子篩結(jié)果和SDS-PAGE電泳結(jié)果，緩沖液為50mMNaHC03，pH10. 2。實施例2 :三種CrylAa單點突變蛋白(H168R, N372G, N372A)的制備我們?yōu)榱双@得野生型CrylAa質(zhì)粒，以Plasmidl37 DNA(來自蘇云金芽孢桿菌Btl520)為模板，根據(jù)CrylAa序列設(shè)計了特異引物序列，引物序列如下上游引物
5' -TCCCCCGGG GTAATCGCTCGTCTATC-3 '(加 smal I 位點)；下游引物5 ' -ACGCGTCGACCATATAGGGAGAATGCAGT-3'(加 Sal I 位點)。按照常規(guī)方法，將基因擴增片段回收，酶切，將CrylAa基因全長連接到pHTlk載體中。再將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)入Btl71感受態(tài)細(xì)胞中(Btl71感受態(tài)細(xì)胞菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院喻子牛教授實驗室惠贈，Btl71感受態(tài)細(xì)胞按常規(guī)方法制備，具體方法詳見2. 3，可參考李林，邵宗澤，喻子牛.電脈沖法轉(zhuǎn)化蘇云金芽孢桿菌BMB171的研究[J]微生物學(xué)通報，2000，27 (5) =331-334 (即參考文獻13))。為了研究CrylAa的殺蟲機理，我們以按上述構(gòu)建好的野生型CrylAa質(zhì)粒為模板，利用定點突變PCR的方法構(gòu)建了三個克隆H168R，N372G,N372A。下表列出的是定點突變所用到的引物(表I)。表I用于構(gòu)建CrylAa突變體的引物
權(quán)利要求
1.一種蘇云金芽孢桿菌CrylAa殺蟲晶體的突變蛋白，其包含選自H168R、N372G或N372A的任一種單位點突變。
2.權(quán)利要求I中所述的蘇云金芽孢桿菌CrylAa殺蟲晶體的突變蛋白用于制備殺蟲劑的應(yīng)用。
3.—種殺蟲劑，其包含有效量的權(quán)利要求I中所述的蘇云金芽孢桿菌CrylAa殺蟲晶體的突變蛋白。
4.權(quán)利要求3的殺蟲劑，其用于殺滅鱗翅目、雙翅目、鞘翅目的害蟲。
5.權(quán)利要求3的殺蟲劑，其還對膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目的多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有選擇性的殺蟲活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蘇云金芽孢桿菌Cry1Aa殺蟲晶體突變蛋白，其包含選自H168R、N372G或N372A的任一種單點突變，以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明涉及上述蘇云金芽孢桿菌Cry1Aa殺蟲晶體突變蛋白用于制備殺蟲劑的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種殺蟲劑，其包含有效量的所述蘇云金芽孢桿菌Cry1Aa殺蟲晶體的突變蛋白。
文檔編號C07K14/325GK102757485SQ20121022242
公開日2012年10月31日 申請日期2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月29日
發(fā)明者儲俊, 周叢照, 李衛(wèi)芳 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)