專利名稱：一種檢測井岡霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力的方法
背景技術：
水稻是我國主要糧食作物之一，播種面占全國糧食作物的1/4，而產(chǎn)量則占一半以上。水稻紋枯病是水稻生產(chǎn)中重要的病害之一，全國各稻區(qū)都有發(fā)生，俗稱“花腳病”，發(fā)病重的田塊,秕谷率增加，千粒重下降。水稻紋枯病由稻立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKubn)引起，七十年代后，我國大面積推廣矮桿、早熟、多蘗型品種，而且隨著施肥水平的不斷提高，紋枯病危害逐漸加重，有的高肥地塊感病品種發(fā)病率高100%，致葉片枯死，結實率降低，千粒重減輕，病情指數(shù)達75. 69%，產(chǎn)量損失30%以上。近年來該病害已躍居我國水稻三大病害之首。
該病害病原菌主要以菌核在土壤中越冬，第二年飄浮水面的菌核萌發(fā)抽出菌絲，浸入葉鞘形成病斑，從病斑上再長出菌絲向附近蔓延形成新病斑。菌核落人水中又可借水流傳播。也能以菌絲體和菌核在病稻草和其他寄主殘體上越冬。溫度在25 - 31°C和飽和濕度為病害流行的最有利條件。水稻品種不同，R. solani的侵染情況也不同，一般矮桿闊葉型比高桿窄葉型水稻易感病；粳稻比秈稻易感?。簧诙痰钠贩N比生育期長而遲熟的品種發(fā)病重些。該病發(fā)生與水稻長勢情況和生育期關系密切，過量施氮肥，高度密植，灌水過深過多或偏遲，均為誘發(fā)病害的主要因素。一般水稻從分蘗期開始發(fā)病，孕穗期前后達發(fā)病高峰。生產(chǎn)上通常采用農(nóng)業(yè)防治、培育抗病品種、生物防治和化學防治等不同的防治措施來減輕其危害。但是在諸多防治措施中，化學防治尤其是采用井R霉素控制水稻紋枯病仍是目前生產(chǎn)中主要的手段之一。自1973上海農(nóng)藥研究所創(chuàng)制開發(fā)了井R霉素，在田間使用已有三十多年，已有部分區(qū)縣反應井R霉素在田間出現(xiàn)藥效下降的現(xiàn)象。水稻紋枯病菌對井R霉素的敏感性/抗性的適時檢測和監(jiān)測是明確田間抗性產(chǎn)生及發(fā)展現(xiàn)狀，并及時制定合理的抗性管理策略的前提。目前，已有研究和報道結果表明，水稻紋枯病菌對井R霉素的敏感性測定主要采用菌絲生長速率法，采用的培養(yǎng)基主要為瓊脂培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基和查彼培養(yǎng)基。但供試菌株在水洋菜培養(yǎng)基上菌絲生長不規(guī)則，使得所測得數(shù)據(jù)不準確，而且與田間藥效實驗的數(shù)據(jù)不一致；在PDA培養(yǎng)基上所測定菌落雖然生長規(guī)則，但是離體所測數(shù)據(jù)與田間藥效實驗結果相差10倍以上，不具有指導性。因此，為了準確測定井R霉素的抑菌作用，以準確進行田間菌株的敏感性測定，指導田間抗性的預測，生產(chǎn)中迫切需要建立一種準確和有效的測定水稻紋枯病菌對井R霉素敏感性的方法。以建立水稻紋枯病菌對井R霉素的敏感基線，監(jiān)測田間病原菌對井R霉素的敏感性變化，這是抗藥性研究及治理的前提，是實現(xiàn)植物病害化學防治可持續(xù)發(fā)展的基礎
發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力的方法。本發(fā)明所提供的檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力的方法，包括如下步驟I)將水稻紋枯病致病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，至得到以接種中心為圓心的菌落圓面，此時在培養(yǎng)容器背面標記出一圓周輪廓，該圓周輪廓以所述接種中心為圓心，以所述菌落圓面的半徑為圓周半徑；再繼續(xù)培養(yǎng)16h-48h ;然后在所述圓周輪廓區(qū)域打取菌餅；2)用步驟I)所得菌餅檢測井R霉素對所述水稻紋枯病致病菌的毒力。上述步驟2)中，可利用常規(guī)方法進行檢測，如將菌餅接種于培養(yǎng)基中，再利用十字 交叉法測量菌落直徑，根據(jù)菌落直徑大小計算抑制率。上述方法中，所述步驟I)中，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時間為18h。上述過程中，所述步驟2)包括如下步驟將步驟I)所得菌餅接種于含有井R霉素的培養(yǎng)基中，檢測井R霉素對所述囷的抑制率；所述含有井R霉素的培養(yǎng)基是向E培養(yǎng)基中添加井R霉素得到的；所述E培養(yǎng)基由K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水組成，所述K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水的配比為 I. 5-2g 1. 5-2g 13-17g :15_18g :1L。上述過程中，所述E培養(yǎng)基中，所述K2HP04、KH2P04、瓊脂、葡萄糖和水的配比為2g 2g 14g 18g :1L。上述過程中，所述步驟I)中，所述培養(yǎng)的溫度為25°C。上述過程中，所述步驟I)中，培養(yǎng)2天，才得到所述以接種中心為圓心的菌落圓面。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力
的培養(yǎng)基。本發(fā)明所提供的用于檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力的培養(yǎng)基，由K2HPO4、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水組成，所述K2HPO4、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水的配比為I. 5-2g1. 5-2g 13-17g :15_18g 1L ；上述培養(yǎng)基中，所述K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水的配比為2g 2g 14g 18g IL0上述培養(yǎng)基在檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明是針對目前井R霉素對水稻紋枯病菌毒力測定方法中存在著測定結果不穩(wěn)定，重復性差，室內抑菌活性測定結果與井R霉素在田間對紋枯病的實際抑制效果差異很大的問題。從而篩選新的培養(yǎng)基，并確定供試菌餅的菌齡后建立的一種新的測定水稻紋枯病致病菌對井R霉素的敏感性的方法。該方法所測得的結果與采用田間藥效試驗方法測定的結果一致。并且該方法相對于水瓊脂培養(yǎng)基法，致病菌菌落生長更加致密規(guī)則，使得測量的數(shù)據(jù)準確。培養(yǎng)基制作簡單，使用的化學試劑規(guī)格易于統(tǒng)一，耗費量少，可作為一種新的標準化的方法，用于測定井R霉素對水稻紋枯病菌的毒力作用和監(jiān)測田間水稻紋枯病菌對井R霉素敏感性的變化，以指導水稻紋枯病的田間防治和抗藥性治理。本發(fā)明方法為進行水稻紋枯病致病菌對井R霉素的敏感性測定或抗藥性檢測和監(jiān)測提供了準確，有效的方法。


圖I為含100 μ g/ml井岡霉素的PDA和E培養(yǎng)基對水稻紋枯病菌的抑制作用。圖2為制取水稻紋枯病菌菌餅示意圖。圖3為65株水稻紋枯病菌對井岡霉素的敏感性分布。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 60%井岡霉素原藥購自浙江省桐廬匯豐生物化工有限公司；原藥溶解于滅菌水中配成IO5 μ g/ml的母液，置于4°C冰箱中備用。實施例I、測定井岡霉素對水稻紋枯病菌的毒力各處理條件的選擇一、培養(yǎng)基的選擇供試培養(yǎng)基A 培養(yǎng)基(酵母粉 2g，葡萄糖 10g，MgSO4WH2O O. 5g, (NH4)2SO4 IgjKH2PO4 2g, K2HPO4I. 5g，瓊脂粉14g，IL去離子水)B 培養(yǎng)基(葡萄糖 10g, MgSO4 · 7H20 O. 5g，(NH4)2SO4 lg，KH2PO4 2g，K2HPO4 I. 5g，KNO3 2g，瓊脂粉14g，IL去離子水)C培養(yǎng)基(葡萄糖8g，酵母粉5g，瓊脂粉14g，IL去離子水)D培養(yǎng)基(葡萄糖10g，KNO3 5g，瓊脂粉14g，IL去離子水)E培養(yǎng)基(K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，瓊脂粉14g，葡萄糖18g，IL去離子水)F 培養(yǎng)基(酵母粉 4g，MgSO4 · 7H20 O. 36g，KH2PO4L 77g，明膠 4g，瓊脂粉 14g，IL 去離子水)水洋菜培養(yǎng)基(瓊脂粉14g，IL去離子水)胡蘿卜培養(yǎng)基(胡蘿卜200g，瓊脂粉14g，IL去離子水)V8汁瓊脂培養(yǎng)基(V8汁100ml，CaCO3 O. 2g，瓊脂粉14g，IL去離子水)理查培養(yǎng)基(蔗糖50g, MgSO4 · 7H20 2. 5g，KH2PO4 5g，KNO3 IOg, FeCl3 0. 02g,瓊脂粉14g，IL去離子水)查彼培養(yǎng)基(蔗糖30g MgSO4 · 7H20 O. 5g，KH2PO4 Ig KCl O. 5g，NaNO3 2g，F(xiàn)eSO4
0.Olg，瓊脂粉14g，ILl去離子水)PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，瓊脂粉14g，葡萄糖18g，IL去離子水)I、將配制好的井R霉素母液分別加入以上12種培養(yǎng)基中，制成終濃度為0，100 μ g/ml含藥平板。在PDA平板上預培養(yǎng)好的菌落邊緣打取直徑5mm的菌餅，接種于含不同藥劑濃度的含藥平板上，25°C黑暗培養(yǎng)2天。當對照菌落直徑達到培養(yǎng)皿直徑的80 %以上時，十字交叉法測量菌落直徑，每處理2次重復。計算出各藥劑濃度對菌絲生長的抑制百分率(％)。結果自然培養(yǎng)基A、C、PDA、V8的抑制效果要比水瓊脂培養(yǎng)基及合成培養(yǎng)基E、D培養(yǎng)基，理查培養(yǎng)基，查彼培養(yǎng)基的抑制效果差，表明在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中，井R霉素對水稻紋枯病菌抑制作用較差，因此選擇合成培養(yǎng)基E培養(yǎng)基和查彼培養(yǎng)基作為進一步篩選的待選培養(yǎng)基。2、在實驗I的基礎上，選擇抑制率較高的E、D、查彼培養(yǎng)基進行再次測定，PDA培養(yǎng)基為對照。在進一步篩選的過程中發(fā)現(xiàn)在不同時間段測得的抑制率相差較大，但是在24小時后，所測結果比較穩(wěn)定，為方便測量，選擇在接菌后2天，對照菌落直徑達到培養(yǎng)皿直徑的80 %以上時測量菌落的大小。結果也表明，水稻紋枯病菌在低藥劑濃度的D培養(yǎng)基上生長不規(guī)則，影響測定的準確性。因此，選擇E培養(yǎng)基作為獨立測定的供試培養(yǎng)基開展進一步的研究。菌落抑制情況見圖I。二、水稻紋枯病菌菌齡的選擇選擇用E培養(yǎng)基，先將菌餅接到PDA培養(yǎng)基上在25°C條件下預培養(yǎng)2天后，將配制好的系列濃度的藥液分別加入以上12種培養(yǎng)基中，制成終濃度為0，50 μ g/ml含藥平板。在PDA平板上預培養(yǎng)好的菌落上打取距離菌落生長邊緣0cm, I. 5cm, 3. 0cm, 4. 5cm, 6. Ocm的菌餅，接菌于含不同藥劑濃度的帶藥平板上，25°C黑暗培養(yǎng)2天。當對照菌落直徑達到培養(yǎng) 皿直徑的80 %以上時，十字交叉法測量菌落直徑，每處理2次重復。計算出各藥劑濃度對菌絲生長的抑制百分率(％)。在PDA和查彼培養(yǎng)基上的實驗結果表明，不同菌齡在這兩個培養(yǎng)基上的抑制率沒有明顯的規(guī)律性，在E培養(yǎng)基上，則是隨著菌齡的增加，對井R霉素的敏感性也在增加。上述在不同菌齡的菌餅對井R霉素的敏感性不同。將菌餅預接在PDA上，待菌落生長2天后，菌落的生長邊緣接近培養(yǎng)皿邊緣時，用記號筆劃線標記出菌落生長邊緣的輪廓，在同心圓位置上的經(jīng)過不同時間0h、10h、18h、24h、48h后打取菌餅，菌絲面朝下，將菌餅接在濃度梯度為1，2. 5，5，10，25，50 μ g/ml的帶毒平板上，在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天后，CK菌落生長接近滿皿時，測量各梯度濃度下菌落的直徑，計算EC5tl值。在18h時，所測的EC5tl同已經(jīng)報道的井岡霉素在田間活體植株上測定的抑制效果接近(已經(jīng)報道的井岡霉素在田間的藥效的濃度為5. 2 μ g/ml)。所以選擇在菌落某確定位置的菌落生長18h后，打取菌餅測定該菌的EC5tl。實施例2、測定井R霉素對水稻紋枯病菌的毒力一、實驗室檢測I、供試病菌水稻紋枯病致病菌，分離自福建，廣東，廣西，海南的田間，共65株。2、供試培養(yǎng)基E培養(yǎng)基由K2HPO4 2g，KH2PO4 2g，瓊脂粉14g，葡萄糖18g，IL去離子水組成。在115°C，15分鐘條件下高壓濕熱滅菌。3、每株菌的檢測步驟I)將水稻紋枯病致病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，在25°C培養(yǎng)2天，得到以接種中心為圓心的菌落圓面，此時用記號筆在培養(yǎng)皿背面劃線標記出菌落生長邊緣的同心圓圓周輪廓，該圓周輪廓以所述接種中心為圓心，以所述菌落圓面的半徑為圓周半徑。將供試菌落邊緣劃線標記后，繼續(xù)在25°C條件下培養(yǎng)18h，在所述圓周輪廓區(qū)域打取菌餅(如圖2)。2)將步驟I)所得菌餅分別接種于含有不同濃度井R霉素的培養(yǎng)基中(向E培養(yǎng)基中添加不同量的井R霉素，使井R霉素在E培養(yǎng)基中的濃度分別為I，2. 5，5，10，25，50 μ g/ml), 25°C培養(yǎng)2天，CK菌落生長接近滿皿時(即對照菌落直徑達到培養(yǎng)皿直徑的80%以上時)，十字交叉法測量各梯度濃度下菌落直徑，計算抑制率，得出EC5tl值，即檢測出井岡霉素對水稻紋枯病菌的毒力；抑制率的計算公式
^對照菌落增長直徑(mm) —處理菌落增長直徑
抑制率(％)
(mm)_ XlOO
對照菌落增長直徑(mm)按照上述方法，得到井岡霉素對每株水稻紋枯病菌的EC5tl值。 4、結果結果表明，65株菌株的平均EC5tl為4. 5025±2. 5066yg/ml，其中EC5tl值最小為O. 9206 μ g/ml，最大為13. 5299 μ g/ml，相差14. 70倍。如圖3所示，不同菌株對井岡霉素的敏感性頻率分布呈單峰曲線，未出現(xiàn)敏感性下降的病原菌亞群體。因此可將該曲線作為水稻紋枯病菌對井岡霉素的敏感性基線，可將井岡霉素對該病原群體的平均EC5tl值作為水稻紋枯病菌對井網(wǎng)霉素的敏感性基線，并用于田間抗藥性的監(jiān)測的參考標準。實驗設3次重復，結果均一致。二、田間檢測I、供試病菌與實驗室檢測時所用致病菌株相同，井岡霉素對其EC5tl為5. 09 μ gml。2、檢測方法配制濃度分別為0，3，6，10和20 μ g/ml的井R霉素水溶液(其中包括
0.5%的吐溫20)在水稻孕穗期和齊穗期分別施藥，末次施藥后15天后調查藥劑對水稻紋枯病的防治效果。然后將防治效果轉化成機率值(Y)，藥劑濃度轉換成以10為底的對數(shù)值(X)，在Microsoft Excel中作回歸直線，求出有效抑制中濃度EC5tl值。3、結果調查結果表明，井R霉素水溶液對紋枯病具有較好的防治效果。在水稻孕穗期和齊穗期兩次施藥后調查顯示，施藥濃度分別為3，6，10和20 μ g/ml時，其防效分別為38%，53%,65%和78%。經(jīng)計算，其田間抑制中濃度EC5tl值為5. 16 μ g/ml。將實驗室檢測結果與田間檢測結果進行比對，可知，兩者無顯著差異，證明本發(fā)明方法檢測結果可靠，與實際田間結果一致。實施例3、測定井R霉素對水稻紋枯病菌的毒力供試病菌與檢測方法均與實施例2所示相同，不同的是所用的E培養(yǎng)基的組成如下由Κ2ΗΡ04、ΚΗ2Ρ04、瓊脂、葡萄糖和水組成，所述K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水的配比為
1.5g 1. 5g 17g 15g :1L0結果與實施例2無顯著差異。實驗設3次重復，結果均一致。
權利要求
1.一種檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力的方法，包括如下步驟 1)將水稻紋枯病致病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，至得到以接種中心為圓心的菌落圓面，此時在培養(yǎng)容器背面標記出一圓周輪廓，該圓周輪廓以所述接種中心為圓心，以所述菌落圓面的半徑為圓周半徑；再繼續(xù)培養(yǎng)16h-48h ;然后在所述圓周輪廓區(qū)域打取菌餅； 2)用步驟I)所得菌餅檢測井R霉素對所述水稻紋枯病致病菌的毒力。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，所述繼續(xù)培養(yǎng)的時間為18h。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)包括如下步驟將步驟I)所得菌餅接種于含有井R霉素的培養(yǎng)基中，檢測井R霉素對所述菌的抑制率； 所述含有井R霉素的培養(yǎng)基是向E培養(yǎng)基中添加井R霉素得到的； 所述E培養(yǎng)基由K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水組成，所述K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水的配比為 I. 5-2g 1. 5-2g 13-17g :15_18g :1L。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其特征在于所述E培養(yǎng)基中，所述Κ2ΗΡ04、ΚΗ2Ρ04、&月旨、匍萄糖和水的配比為2g 2g 14g 18g :1L。
5.根據(jù)權利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，所述培養(yǎng)的溫度為25°C。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟I)中，培養(yǎng)2天，才得到所述以接種中心為圓心的菌落圓面。
7.一種用于檢測井網(wǎng)霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力的培養(yǎng)基，由K2HP04、KH2PO4,瓊脂、葡萄糖和水組成，所述K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水的配比為I. 5-2g 1. 5_2g 13-17g 15-18g :1L。
8.根據(jù)權利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述K2HP04、KH2PO4、瓊脂、葡萄糖和水的配比為 2g 2g 14g 18g lLo
9.權利要求7或8所述培養(yǎng)基在檢測井R霉素對水稻紋枯病致病菌的毒力中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測井岡霉素對水稻紋枯病致病菌對的毒力的方法。該方法包括如下步驟1)將水稻紋枯病致病菌接種于PDA培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)2天，得到以接種中心為圓心的菌落圓面，此時在培養(yǎng)容器背面標記出一圓周輪廓，該圓周輪廓以所述接種中心為圓心，以所述菌落圓面的半徑為圓周半徑；再繼續(xù)培養(yǎng)16h-48h；然后在所述圓周輪廓區(qū)域打取菌餅；2)用步驟1)所得菌餅，采用E培養(yǎng)基檢測井岡霉素對所述水稻紋枯病致病菌的毒力。本發(fā)明方法為進行水稻紋枯病致病菌對井岡霉素的敏感性測定或抗藥性檢測和監(jiān)測提供了準確，有效的方法。
文檔編號C12Q1/18GK102766675SQ201210177630
公開日2012年11月7日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權日2012年5月31日
發(fā)明者劉西莉, 嵇莉莉, 龐智黎, 張宏軍, 張紹亮, 朱春雨, 李健強, 畢揚, 牟文君 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學