一種防治菌核病的噬菌核霉菌株jn-cm的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種防治菌核病的生防菌噬菌核霉JN-CM菌株。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(編號：CGMCC?No.8325)。本發(fā)明還公開了所述該菌株的生物特征及培養(yǎng)方法。本發(fā)明的微生物菌對菌核病具有較好的生防效果。
【專利說明】—種防治菌核病的噬菌核霉菌株JN-CM
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種防治菌核病的生防菌噬菌核霉JN-CM菌株，屬生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]核盤菌[Scerotiniasclerotionrum (Lib.) de Bary]是世界性的植物病原菌,可引起408種植物的菌核病。由其引發(fā)的油菜菌核病仍然是現(xiàn)中國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的難題。目前多采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行控制，而核盤菌核的抗藥性、化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境的污染以及人類身體健康的侵害是比較嚴(yán)重的問題。Coniothyrium minitans Campbell是1947年由美國學(xué)者Cambell首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的一種重要的菌核寄生菌。Coniothyrium minitans被認(rèn)為是一種對于核盤菌(Scerotinia sclerotionrum)很有前景的生防菌。Coniothyrium minitans的中文通用名為嗤囷核霉((2012)農(nóng)標(biāo)子044號)，目如嗤囷核霉廣品在歐州已有兩種霉制劑(K0NI和Contans)出售。國內(nèi)尚沒有關(guān)于噬菌核霉制劑產(chǎn)品上市。前期，我們從生長在江蘇省大豐油菜地土壤中分離所得了噬菌核霉，在NCBI中對測定的序列進(jìn)行Blast，結(jié)果顯示我們分離得到高致腐力的噬菌核霉JN-CM的微生物分類學(xué)為真菌界，子囊菌門，座囊菌綱，格孢菌目，小球腔菌科，盾殼霉屬，小盾殼霉種的噬菌核霉。該菌有著很強(qiáng)的產(chǎn)孢能力和抗菌核菌活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種分離自中國江蘇省大豐油菜地土壤中具有抗菌核病活性的微生物菌株噬菌核霉菌。本發(fā)明所述的噬菌核霉菌系從中國江蘇省大豐油菜地中分離獲得?，F(xiàn)在國家知識產(chǎn)權(quán)局認(rèn)可的保藏單位保藏，保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱:CGMCC，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵政編碼:100101。保藏日期為2013年10月12日，保藏編號為CGMCC No:8325。本發(fā)明所述的卩遼菌核霉菌命名為卩遼菌核`霉JN-CM(Coniothyrium minitans)。
[0004]1、噬菌核霉JN-CM的分子生物學(xué)鑒定:
[0005]采用以下引物，ITSl:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 擴(kuò)增核糖體 DNA 的 ITSU5.8s 和 ITS2 區(qū)域(圖 3)，對噬菌核霉JN-CM擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果為:
[0006]CCCCTGGGGGCTCCCCCAGGTGGTAAGGTGAAATACCCTATCGCGCCGCATACCTGCATCCTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGCGGGGCAACCTGCCGCTGGAACCTGATAAACCTTTTTTGCATCTAGTATTACCTGTTCTGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTTTGCGCGCGGACTCGCCCCAAACTCATTGGCAGCGGTTTTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACAATTGCGTCTGCGAGGGGGCGTGGCCCGCGTCCACGAAGCAACATTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATAATTAAAGCGGAGGAA
[0007]在NCBI中對測定的序列進(jìn)行Blast，結(jié)果顯示我們分離得到高致腐力的噬菌核霉JN-CM的微生物分類學(xué)為真菌界，子囊菌門，座囊菌綱，格孢菌目，小球腔菌科，盾殼霉屬，小盾殼霉種的嗤囷核霉。
[0008]采用引物DAF-4:5’-CGGCAGCGCC-3，DAF-6:5’-GCCGTCGCGG-3，DAF-8:5’ -CGGCGCCGCC-3’ DAF-9:5’ -CCGACGCGGC-3’對本噬菌核霉菌與德國商品化的Contans進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分析(圖4)，結(jié)果顯示本菌株與德國商品化的Contans存在
一定的差異。
[0009]2、噬菌核霉JN-CM于室內(nèi)自然環(huán)境中的培養(yǎng)特征:
[0010]噬菌核霉在溫度10°C~30°C，pH3~10范圍內(nèi)生長，最適生長溫度和最適產(chǎn)孢溫度均為20°C ;最適生長pH6。噬菌核霉孢子在15~25°C范圍內(nèi)萌發(fā)，最適萌發(fā)溫度20°C，濕度對于噬菌核霉孢子萌發(fā)的影響較大，當(dāng)濕度大于95%時(shí)，噬菌核霉孢子才能萌發(fā)。光照對噬菌核霉的生長和產(chǎn)孢影響不大，但是光照可以促進(jìn)孢子的成熟和萌發(fā)。噬菌核霉JN-CM在光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡下顯示出典型的噬菌核霉的形態(tài)特征(圖1、圖2)。
[0011]3、噬菌核霉JN-CM于不同固體培養(yǎng)基上的生長特點(diǎn)
[0012]卩遼菌核霉JN-CM 在 Potato dextrose agar (PDA) > Biomalt agar (BA) > Biomaltagar+yeast (BAY)以及Czapek-Dox agar (CDA)等不同固體培養(yǎng)基上的生長特點(diǎn)如下:
[0013]
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1:噬菌核霉JN-CM菌株的分離、篩選及鑒定
[0015]采集江蘇大豐油菜菌核病發(fā)生地5-10cm 土層的土樣,利用核盤菌菌核誘捕法分離獲得噬菌核霉JN-CM菌株。進(jìn)一步通過稀釋平板方法、核盤菌對峙培養(yǎng)、產(chǎn)孢量測定以及致腐活性測定篩選出產(chǎn)孢能力及致腐活性較高的噬菌核霉JN-CM菌株。通過菌落照片、顯微照片、rDNA序列、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)等鑒定方法對該菌株進(jìn)行了鑒定。菌株于2013年10月12日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為:CGMCC N0.8325。
[0016]實(shí)施例2:高產(chǎn)噬菌核霉JN-CM固態(tài)發(fā)酵
[0017]1、噬菌核霉JN-CM孢子懸浮液的制備:將噬菌核霉JN-CM菌株置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，與20°C條件下培養(yǎng)6~8天，用無菌水沖洗斜面孢子，利用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整分生孢子懸浮液濃度至IO6 / ml，放入4°C冰箱內(nèi)備用。
[0018]2、二級種子液的制備:取經(jīng)修飾過的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(在培養(yǎng)基中加入
0.7%。瓊脂)，以I~1.5%的接種量想發(fā)酵種子液培養(yǎng)基接種孢子懸浮，于搖床中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:20°C，150r / min，培養(yǎng)6~8天，獲得二級菌種。
[0019]3、獲得產(chǎn)量高的固體發(fā)酵條件:以麩皮為基質(zhì)，對固體發(fā)酵產(chǎn)孢條件進(jìn)行優(yōu)化。首先，確定最佳產(chǎn)孢天數(shù)為8~11天，添加微量元素營養(yǎng)液含量為70%~80%，經(jīng)過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定對孢子產(chǎn)量有影響的因子。之后,進(jìn)行正交試驗(yàn)(如不同碳源、有機(jī)無機(jī)氮源)選出產(chǎn)孢最優(yōu)組合。最后,進(jìn)行Response Surface試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定添加最有影響因子的最佳含量。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證理論與實(shí)際的相符性，得到最優(yōu)產(chǎn)孢量不少于IxIOki個(gè)/克干物質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1:噬菌核霉JN-CM菌株的孢子形態(tài)[0021 ]圖2:噬菌核霉JN-CM菌株的掃描電鏡照片
[0022]圖3:噬菌核霉JN-CM DNA采用ITSl和ITS4擴(kuò)增的結(jié)果。
[0023]Lanel ~4 :JN-CM ；Lane5:Contans ；Lane6:陰性對照；Lane7: IOObp marker
[0024]圖4:噬菌核霉JN-CM不同引物擴(kuò)增的RAPD指紋圖譜。
[0025]Linel ~2:JN-CM ；Line3 ~4:Contans0
【權(quán)利要求】
1.一種防治菌核病的生防菌菌株曬菌核霉JN_CM(Coniothyrium minitans),現(xiàn)保藏在國家知識產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，編號為 CGMCC N0.8325。
2.按照權(quán)利要求1所述的噬菌核霉菌，其特征是其ITSrDNA基因組由542個(gè)堿基組成，序列如下:
CCCCTGGGGGCTCCCCCAGGTGGTAAGGTGAAATACCCTATCGCGCCGCATACCTGCATCCTTTTTTTACGAGCACCTTTCGTTCTCCTTCGGCGGGGCAACCTGCCGCTGGAACCTGATAAACCTTTTTTGCATCTAGTATTACCTGTTCTGATACAAACAATCGTTACAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATCTACACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGCGTCTGTCCCGCCTTTGCGCGCGGACTCGCCCCAAACTCATTGGCAGCGGTTTTTGCCTCCTCTCGCGCAGCACAATTGCGTCTGCGAGGGGGCGTGGCCCGCGTCCACGAAGCAACATTACCGTCTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATAATTAAAGCGGAGGAA·
【文檔編號】C12R1/645GK103710269SQ201310692663
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】朱瑞宇, 雷楗勇, 金堅(jiān), 夏森玉, 陳蘊(yùn), 沈志松, 徐夢龍, 李紅 申請人:無錫楗農(nóng)生物科技有限公司