專利名稱：高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株，尤其是一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
普魯蘭酶(Pullulanase，EC 3. 2. 1. 41)是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點中的α -1，6-糖苷鍵，從而剪下整個側(cè)枝，形成直鏈淀粉的解支酶，在改善淀粉酶對淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低糧耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量及開發(fā)新產(chǎn)品方面有相當(dāng)巨大的價值，在淀粉加工工業(yè)中有著重要的用途及良好的市場前景，目前已經(jīng)被成熟的應(yīng)用于高麥芽糖漿、高葡萄糖漿及干啤酒的生產(chǎn)中。目前，普魯蘭酶的產(chǎn)量很低，只有丹麥諾維信及美國杰能科工業(yè)化生產(chǎn)并銷售此酶，國內(nèi)企業(yè)均依賴進口，價格昂貴。普魯蘭酶工業(yè)化生產(chǎn)菌株較少，我國關(guān)于普魯蘭酶的研究主要集中在產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選、誘變及優(yōu)化等方面，效果均不太理想，而隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)改造菌種，進一步提高酶的產(chǎn)量及活性，降低生產(chǎn)成本成為可能，并在世界范圍內(nèi)得到越來越廣泛的重視及應(yīng)用。近幾年，我國學(xué)者特別是江南大學(xué)學(xué)者利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株取得了一定的效果2006年，夏子芳利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達海棲熱袍菌普魯蘭酶基因，并得到少量酶活；2008年，張明焱將來源于Bacillus Iicheniformis的普魯蘭酶編碼基因利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達，酶活力達 5. 6U/ml ;2010年，王淑軍等人利用深海古菌Hiermococcus siculi HJ21 PCR擴增出一新的普魯蘭酶編碼基因，并在大腸桿菌中得到表達，但表達量較低。我國關(guān)于普魯蘭酶的研究起步較晚，為了改變對進口產(chǎn)品的依賴，尋求一條國產(chǎn)化的道路，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株，進一步提高酶的產(chǎn)量及活性，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法，通過重新構(gòu)建后獲得基因工程菌的普魯蘭酶的表達量明顯提高，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下—種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株含有普魯蘭酶基因， 普魯蘭酶基因基因的來源是Bacillus naganoensis (ATCC53909)。而且，所述基因工程菌株的宿主菌是大腸桿菌BL21 (DE3)。而且，所述基因工程菌株的普魯蘭酶基因由Bacillus naganoensis (ATCC53909) 染色體DNA擴增得到的。一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法，方法的步驟如下(1)基因克隆根據(jù)NCBI上報道的基因序列設(shè)計引物，以Bacillus naganoensis (ATCC53909)菌株的染色體DNA為模板克隆得到普魯蘭酶基因；
(2)基因工程菌株的構(gòu)建將所獲得的普魯蘭酶基因與載體pEY_22b(+)連接，酶切驗證；(3)將酶切驗證正確的載體轉(zhuǎn)化到宿主E. coli BL21(DE3)內(nèi)，之后進行酶切，測序驗證，確定構(gòu)建含有普魯蘭酶基因的基因工程菌株BL21 (DE3)/pET22b-pul。而且，基因工程菌株BL21 (DE3)/pET22b-pul經(jīng)發(fā)酵所測粗酶液酶活力為10. 94U/ mg，比出發(fā)菌株 Bacillus naganoensis (ATCC53909)酶活力提高了 37 倍。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下本發(fā)明首次利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含有普魯蘭酶基因的工程菌株，本菌株經(jīng)誘導(dǎo)后獲得的粗酶液的酶活力達10. 94U/mg,比出發(fā)菌株酶活力提高了 37倍，實現(xiàn)普魯蘭酶的高效表達，為普魯蘭酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明的PCR擴增圖，其中1為PCR產(chǎn)物；2為11Λ DNA marker ；圖2為本發(fā)明重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程；圖3為本發(fā)明酶切驗證凝膠圖，其中1為11Λ DNA marker ；2為經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切；3為經(jīng)BamH I單酶切；4為經(jīng)BamH I單酶切的pET_22b (+)；圖4為本發(fā)明蛋白電泳圖，其中1為BL21 (DE3) /pET22b_pul誘導(dǎo)前的全細胞；2為BL21 (DE3)/pET22b-pul誘導(dǎo)后的全細胞；3為BL21 (DE3)誘導(dǎo)前的全細胞；4為 BL21(DE3)誘導(dǎo)后的全細胞；5為BL21(DE3)/pET-22b(+)誘導(dǎo)前的全細胞；6為BL21 (DE3) / pET-22b (+)誘導(dǎo)后的全細胞；M為蛋白marker。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進一步說明；下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，構(gòu)建基因工程菌株BL21(DE3)/pET22b-pul，實現(xiàn)普魯蘭酶的高效表達，本發(fā)明目的基因的來源是 Bacillus naganoensis (ATCC53909)，基因工程宿主菌是大腸桿菌BL21 (DE3)，所構(gòu)建的重組表達載體不僅包括編碼目的基因的DNA序列，還包括表達該基因所需的控制元件。一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法，步驟是1、普魯蘭酶基因的克隆根據(jù)NCBI上報道的基因序列設(shè)計引物，引物如下上游引物Fl :CGCGGATCCAGATGGGAACACCACAAACATC 酶切位點為 BamH I下游引物R2 :ACGCGTCGACTAAGTTCATTTAGGTCGATG 酶切位點為 Sal I1.1 PCR 擴增體系
權(quán)利要求
1.一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株，其特征在于所述基因工程菌株含有普魯蘭酶基因，普魯蘭酶基因基因的來源是Bacillus naganoensisATCC53909。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株，其特征在于所述基因工程菌株的宿主菌是大腸桿菌BL21 (DE3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株，其特征在于所述基因工程菌株的普魯蘭酶基因由Bacillus naganoensis ATCC53909染色體DNA擴增得到的。
4.一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于方法的步驟如下(1)基因克隆根據(jù)NCBI上報道的基因序列設(shè)計引物，以Bacillus naganoensis (ATCC53909)菌株的染色體DNA為模板克隆得到普魯蘭酶基因；(2)基因工程菌株的構(gòu)建將所獲得的普魯蘭酶基因與載體pET-22b(+)連接，酶切驗證；(3)將酶切驗證正確的載體轉(zhuǎn)化到宿主E.coli BL2KDE3)內(nèi)，之后進行酶切，測序驗證，確定構(gòu)建含有普魯蘭酶基因的基因工程菌株BL21 (DE3)/pET22b-pul。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征在于基因工程菌株BL21 (DE3)/pET22b-pul經(jīng)發(fā)酵所測粗酶液酶活力為10. 94U/mg,比出發(fā)菌株 Bacillus naganoensis ATCC53909 酶活力提高了 37 倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效表達普魯蘭酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法，主要內(nèi)容是從長野芽孢桿菌中提取染色體DNA、設(shè)計引物并PCR獲得目的基因、構(gòu)建重組質(zhì)粒、利用大腸桿菌表達系統(tǒng)BL21(DE3)/pET-22b(+)使得目的基因的拷貝數(shù)增加，普魯蘭酶的表達量明顯提高，粗酶液酶活力達10.94U/mg，比出發(fā)菌株酶活力提高了37倍，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。另外其在提高淀粉利用率、降低糧耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量及開發(fā)新產(chǎn)品方面有廣闊的開發(fā)前景，本發(fā)明不僅具有較強的基礎(chǔ)理論研究價值，而且具有較大的經(jīng)濟效益和社會效益。
文檔編號C12R1/19GK102226166SQ20111014162
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者劉逸寒, 張艷, 王建玲, 王春霞, 路福平 申請人:天津科技大學(xué)