專(zhuān)利名稱(chēng)：利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)瑞替普酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物制備技術(shù)，具體涉及一種利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)直接在大腸桿菌中表達(dá)生產(chǎn)具有溶栓活性的藥物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。
背景技術(shù)：
由心血管疾病引發(fā)的血栓并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命，是造成死亡和病殘的主要原因之一。全世界每年心血管疾病患者多達(dá)1300萬(wàn)，其中急性心肌梗死(AMI)死亡率高達(dá)30%，因此研制、發(fā)展高效、特異、安全、副作用小的溶血栓藥物，一直是世界范圍的熱門(mén)課題。rPA是分子量為39. 6 kD的單鏈蛋白，由355個(gè)氨基酸組成，是人組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑(Tissue type plasminogen activator，tPA)缺失4-175位氨基酸序列的缺失變體。rPA —級(jí)結(jié)構(gòu)中不含tPA分子中的Kringle 1、Finger、EGF結(jié)構(gòu)域，但保留了 Kringle 2及絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。與tPA相比，rPA具有溶栓速度快、半衰期長(zhǎng)、再通率高和副作用小等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床上應(yīng)用最好的第三代溶栓藥物之一。目前，國(guó)內(nèi)外采用基因工程方法生產(chǎn)rPA的研究主要是應(yīng)用酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核表達(dá)系統(tǒng)中，成本較高，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)率很低，且真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物易產(chǎn)生糖基化而影響生物活性。大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)是目前最為成熟的基因工程表達(dá)體系，具有生產(chǎn)成本低，產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)，然而盡管也有不少學(xué)者嘗試在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)rPA基因， 但由于rPA富含9對(duì)二硫鍵，大腸桿菌系統(tǒng)很難直接形成正確的空間構(gòu)象，致使表達(dá)產(chǎn)物多以包涵體蛋白形式存在，必須將細(xì)胞破碎后才能將其分離出來(lái)，分離過(guò)程中要用蛋白質(zhì)變性劑，最后還要再把蛋白質(zhì)復(fù)性，在復(fù)性過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)異常的分子，工藝復(fù)雜， 收率較低，成本較高，而且容易影響產(chǎn)品的質(zhì)量，從而影響到藥物的療效。中國(guó)專(zhuān)利CN200710303763. 3公開(kāi)了一種在大腸桿菌中表達(dá)瑞替普酶的方法。它所提供的在大腸桿菌中表達(dá)瑞替普酶的方法是將瑞替普酶基因插入到表達(dá)載體PRSETa的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)載體，再將該重組表達(dá)載體與質(zhì)粒PREP4共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿菌，表達(dá)得到瑞替普酶。但該方法中存在一些問(wèn)題 PRSETa與pREP4質(zhì)粒均缺乏輔助二硫鍵形成的元件，利用pREP4質(zhì)粒所表達(dá)的LacI雖然可以激活pRSETa-rPA質(zhì)粒中rPA的高效表達(dá)，但卻無(wú)法輔助形成rPA活性所必需的二硫鍵， 因此該專(zhuān)利對(duì)所獲得的rPA重組蛋白質(zhì)僅通過(guò)western blot進(jìn)行鑒定，未能就其溶栓活性加以驗(yàn)證，無(wú)法確保實(shí)現(xiàn)正確的臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)，直接在大腸桿菌中表達(dá)制備具有活性的溶栓藥物瑞替普酶(rPA)的方法。本發(fā)明是將rPA基因插入到原核表達(dá)載體pET22b的多克隆位點(diǎn)，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-rPA，再將該重組表達(dá)質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒pET40b共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到同時(shí)含有這兩種質(zhì)粒的重組大腸桿菌，培養(yǎng)該重組大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后得到rPA。為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案
一種利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下步驟
(1)將rPA編碼基因插入到表達(dá)載體pET22b的多克隆位點(diǎn)，使其位于pelB信號(hào)肽下游，構(gòu)建得到pET22b-rPA重組質(zhì)粒；
(2)將pET22b-rPA、pET40b兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在Amp和Kan雙抗選擇壓力下，篩選得到同時(shí)含有pET22b-rPA、pET40b兩種質(zhì)粒的大腸桿菌；
(3)培養(yǎng)該重組大腸桿菌，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；
(4)收集菌液，超聲破碎離心后，分別對(duì)上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；
(5)用纖維蛋白平板法檢測(cè)確定表達(dá)產(chǎn)物的溶栓活性。本發(fā)明所述的方法，其中步驟(1)中rPA基因片段插入表達(dá)載體pET22b中，置于 pelB信號(hào)肽下游，pelB信號(hào)肽能夠協(xié)助目的蛋白rPA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)，有利于蛋白質(zhì)形成正確的二硫鍵及空間折疊。本發(fā)明所述的方法，其中所述基因工程菌需要將pET22b-rPA和pET40b質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，其中pET40b可表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶DsbC并定位到細(xì)胞周質(zhì)， 并催化rPA的二硫鍵形成，使其直接以有活性的可溶形式表達(dá)，無(wú)需進(jìn)行包涵體復(fù)性。本發(fā)明所述的方法，其中rPA編碼的基因序列如序列表NOl所示。本發(fā)明所述的方法，其中重組大腸桿菌pET22b_rPA的氨基酸序列如序列表N02所
7J\ ο本發(fā)明所述的方法，其中所述的rPA編碼基因克隆插入pET22b載體所用PCR引物序列為
上游引物5，-CGCGGATCCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTAC-3' N03 ； 下游引物5，-GCCAAGCTTCAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGC-3’ N04 ； 其中在上下游引物中分別引入了 I和歷^dIII酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。本發(fā)明所述的方法，其中步驟(2)中利用Amp和Kan兩種不同抗生素的選擇壓力， 篩選同時(shí)含有兩種質(zhì)粒的重組菌。因?yàn)樵诤Y選培養(yǎng)基中同時(shí)存在兩種抗生素，缺乏其中任何一種質(zhì)粒的細(xì)菌都會(huì)因?yàn)槭ピ撡|(zhì)粒所攜帶的抗性而被相應(yīng)的抗生素所殺死，因此在存活下來(lái)的細(xì)菌中將同時(shí)含有兩種質(zhì)粒，并能夠同時(shí)表達(dá)這兩種質(zhì)粒所攜帶的基因，其中 pET22b-rPA可表達(dá)rPA并利用pelB信號(hào)肽將其引導(dǎo)到細(xì)胞周質(zhì)空間，pET40b可表達(dá)DsbC 并同樣定位到細(xì)胞周質(zhì)空間，同時(shí)DsbC可催化rPA 二硫鍵的正確形成。本發(fā)明所述的方法，其中所述的培養(yǎng)該重組大腸桿菌的過(guò)程中需加入終濃度為 0. 6 mM 的 IPTG 于 25°C誘導(dǎo) 3 h。本發(fā)明利用兩種質(zhì)粒pET22b_rPA與pET40b共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到了具有溶栓活性的目的蛋白rPA。本方法所獲得的目的蛋白無(wú)需包涵體復(fù)性、無(wú)需切除融合蛋白標(biāo)簽等處理即可實(shí)現(xiàn)rPA重組蛋白的高效可溶性表達(dá)，生產(chǎn)工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，成本低廉，為rPA的大規(guī)模生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖 1 是 pET22b-rPA 重組質(zhì)粒構(gòu)建的酶切驗(yàn)證；1 :lkb DNA ladder Marker ；2 pET22b質(zhì)粒經(jīng)漢警H I和歷·Ζ7(1ΠΙ雙酶切；3 :pET22b_rPA質(zhì)粒經(jīng)漢警H I和歷idIII雙酶切；
圖2是IPTG誘導(dǎo)rPA在雙質(zhì)粒系統(tǒng)大腸桿菌中表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)；M 蛋白質(zhì) Marker ；1 共轉(zhuǎn)pET22b_rPA和pET40b的大腸桿菌表達(dá)的包涵體形式的蛋白質(zhì)；2 共轉(zhuǎn) pET22b-rPA和p ET40b的大腸桿菌表達(dá)的可溶性蛋白質(zhì)；3 共轉(zhuǎn)pET22b_rPA和pET40b的大腸桿菌表達(dá)的總蛋白質(zhì)；
圖3是用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的溶栓活性檢測(cè)圖；；1 :tPA標(biāo)準(zhǔn)品(1000 U/mL, 10 μ L)； 2 :PET22b-rPA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物(30 μ L) ；3 :pET40b轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物(30 μ L) ；4 共轉(zhuǎn)pET22b-rPA和pET40b的大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物(30 μ L)。
具體實(shí)施例方式為了簡(jiǎn)單和清楚的目的，下文恰當(dāng)?shù)氖÷粤斯夹g(shù)的描述，以免那些不必要的細(xì)節(jié)影響對(duì)本技術(shù)方案的描述。在下述實(shí)施例中所給出的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。其中所用試劑均有市售。實(shí)施例1
rPA基因工程菌的構(gòu)建
1、以本實(shí)驗(yàn)室前期研究中構(gòu)建的pMD18T-tPA質(zhì)粒作為模板(江潔，江成英，杜連祥等.Reteplase基因的克隆及在甲醇畢赤酵母中的表達(dá).華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版， 2006， 34(12) 25-29)。采用上游引物
5’ -CGCGGATCCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTAC-3' (N03)； 下游引物
5，-GCCAAGCTTCAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGC-3’ (N04)；
進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用凝膠純化方法純化回收獲得rPA基因片段。為方便后續(xù)操作，在上下游引物中分別引入了I和歷^dIII酶切位點(diǎn)(下劃線部分)。經(jīng)過(guò)序列比較證實(shí)PCR擴(kuò)增得到的rPA編碼基因序列與已知的rPA基因序列完全一致，具體序列如下所示(序列表N01)
TCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCCTCACCGAG TCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCA GGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGA ACCGCAGGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAG GTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCC AGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAG AAATTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCA GCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGC AGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGA CAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGG GAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAG AAGGATGTCCCGGGTGTGTACACCAAGGTTACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTAA 2、將rPA基因和pET22b質(zhì)粒(購(gòu)買(mǎi)于Novagen公司)用Ba·和歷/ dIII雙酶切后，經(jīng) T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (天津科技大學(xué)工業(yè)微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)，在含有100 μ g/mL氨芐青霉素(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)的LB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)12 h后挑取單克隆，提取質(zhì)粒用BmMl和Η η III雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)有1.1 kb rPA目的片段的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，命名為pET22b-rPA (圖1)。所表汰的重組蛋白質(zhì)序列如下(序列表N02,其中,錄體激分為DelB信號(hào)肽，下劃線部分為rPA 氨基酸序列。)
#mZ/ r^gZZZZ^6'/^i^MDIGINSDPSYQGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPffNSMILIGKV YTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPD⑶AKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQ AAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCffILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDT YDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDffTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQ HLLNRTVTDNMLCA⑶TRSGGPQANLHDACQ⑶SGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWI RDNMRP
3、采用氯化鈣轉(zhuǎn)化法，將pET22b-rPA與pET40b等量共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，利用含100 μ g/mL Amp和50 μ g/mL Kan (購(gòu)自上海生工生物工程有限公司)的 LB固體培養(yǎng)基篩選獲得同時(shí)含有pET22b-rPA與pET40b兩種質(zhì)粒的重組大腸桿菌。實(shí)驗(yàn)同時(shí)分別轉(zhuǎn)化pET22b-rPA、pET40b (購(gòu)買(mǎi)于Novagen公司)單一質(zhì)粒作為對(duì)照。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明成功構(gòu)建了雙質(zhì)粒系統(tǒng)表達(dá)rPA的基因工程菌。實(shí)施例2
rPA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
1、將共轉(zhuǎn)pET22b-rPA與pET40b質(zhì)粒的重組大腸桿菌接種到5 mL含有終濃度50 μ g/mL Amp和30 μ g/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，220 rpm培養(yǎng)過(guò)夜。2、將上一步驟中所得過(guò)夜培養(yǎng)物分別按的體積比轉(zhuǎn)接到200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至其0D600為0. 6時(shí)加入IPTG (終濃度0. 6 mM)于25°C進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3 h03、誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，取3 mL菌液12000 rpm離心后收集菌體，加入SDS上樣緩沖液，煮沸收集總蛋白質(zhì)。剩余菌液12000 rpm離心收集菌體后采用超聲法破碎后于12000 rpm離心后，分別對(duì)上清(可溶性蛋白質(zhì))及沉淀(包涵體形式蛋白質(zhì))進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)， 見(jiàn)圖2。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在雙質(zhì)粒大腸桿菌系統(tǒng)中，rPA主要以可溶性?xún)煞N形式進(jìn)行表達(dá)。實(shí)施例3
重組蛋白質(zhì)溶栓活性檢測(cè)
1、制備纖維蛋白平板稱(chēng)取0.02 g纖維蛋白原加到裝有5 mL PBS的小錐形瓶中，混勻后置于37°C預(yù)熱10 min使其溶解。同時(shí)另取適量凝血酶放入裝有ImL PBS的EP管，輕吹一下，放入37°C預(yù)熱。2、稱(chēng)取0. 07 g瓊脂糖用7 mL PBS溶解，加熱使溶解后，冷卻至適宜溫度。將凝血酶溶液迅速混入纖維蛋白原的溶液中，立即混勻后加入至瓊脂糖溶液中搖勻后，將混合液倒入平板中使其 冷卻固化。3、用打孔器在事先準(zhǔn)備好的纖維蛋白平板上打孔，加入30 111^待測(cè)樣品，371下孵育12 h，檢測(cè)溶栓圈大小。實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)pET22b、pET40b單獨(dú)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作為陰性對(duì)照，檢測(cè)人組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑tPA(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用共轉(zhuǎn)兩種不相容質(zhì)粒所獲得的可溶性rPA目的蛋白具有顯著的溶栓活性，而用pET22b、pET40b單獨(dú)轉(zhuǎn)化大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物則不具有活性。具體見(jiàn)圖3。
權(quán)利要求
1.一種利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)瑞替普酶的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將rPA編碼基因插入到表達(dá)載體pET22b的多克隆位點(diǎn)，使其位于pelB信號(hào)肽下游，構(gòu)建得到pET22b-rPA重組質(zhì)粒；(2)將pET22b-rPA、pET40b兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在Amp和Kan雙抗選擇壓力下，篩選得到同時(shí)含有pET22b-rPA、pET40b兩種質(zhì)粒的大腸桿菌； (3)培養(yǎng)該重組大腸桿菌，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；(4)收集菌液，超聲破碎離心后，分別對(duì)上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)；(5)用纖維蛋白平板法檢測(cè)確定表達(dá)產(chǎn)物的溶栓活性。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(1)中rPA基因片段插入表達(dá)載體pET22b中，置于pelB信號(hào)肽下游，pelB信號(hào)肽能夠協(xié)助目的蛋白rPA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周質(zhì)，有利于蛋白質(zhì)形成正確的二硫鍵及空間折疊。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因工程菌需要將pET22b-rPA和pET40b質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，其中pET40b可表達(dá)二硫鍵異構(gòu)酶DsbC并定位到細(xì)胞周質(zhì)， 并催化rPA的二硫鍵形成，使其直接以有活性的可溶形式表達(dá)，無(wú)需進(jìn)行包涵體復(fù)性。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因工程菌的構(gòu)建需要在Amp和Kan雙抗選擇壓力下篩選獲得。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的利用該重組大腸桿菌表達(dá)rPA的過(guò)程中需加入終濃度為0. 6 mM的IPTG于25°C誘導(dǎo)3 h。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中rPA編碼的基因序列如序列表NOl所示。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中重組大腸桿菌pET22b-rPA的氨基酸序列如序列表N02 所示。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的rPA編碼基因克隆插入pET22b載體所用PCR弓丨物序列為上游引物5，-CGCGGATCCATCTTACCAAGGAAACAGTGACTGCTAC-3' N03 ； 下游引物5，-GCCAAGCTTCAATGTCTTACCAAGGAAACAGTGACTGC-3’ N04 其中在上下游引物中分別引入了 Β— I和Hind III酶切位點(diǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)溶栓藥物瑞替普酶(Reteplase，rPA)的方法。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到rPA的基因片斷，將該基因片斷克隆到載體pET22b中，構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pET22b-rPA。利用pET22b-rPA和pET40b二者不同的抗性，將其共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，在氨芐青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)的雙抗選擇壓力下，篩選獲得工程菌。該工程菌經(jīng)IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)表達(dá)后，可生產(chǎn)獲得可溶性的rPA目的蛋白，經(jīng)纖維蛋白平板法檢測(cè)，證明本方法所獲得的rPA蛋白不需進(jìn)行復(fù)性，即可具有顯著的溶栓活性。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102250933SQ20111014090
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者倪萌, 張同存, 羅學(xué)剛 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)