專(zhuān)利名稱(chēng)：大腸桿菌菌株dsm 6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大腸桿菌(E.coli)菌株DSM 6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆，其制備方法以及如此獲得的細(xì)菌作為克隆載體的用途。
大腸桿菌是在自然中特別是在人和動(dòng)物的腸中存在的細(xì)菌，長(zhǎng)期以來(lái)其就已經(jīng)是深入的微生物學(xué)和基因技術(shù)研究的對(duì)象，并在基因技術(shù)中特別地用于克隆和/或表達(dá)某種的基因或者蛋白質(zhì)。
大多數(shù)埃希氏菌屬(Escgerichia)的菌株在腸腔外是致病的，并通常在侵襲部位導(dǎo)致感染。大腸桿菌的一個(gè)非致病菌株是在德國(guó)微生物保藏所中保存的菌株DSM 6601，其在一些基因特征上與所有常見(jiàn)的大腸桿菌菌株不同。然而，已經(jīng)表明這種菌株只是在復(fù)雜的情況下并且部分地是完全不可進(jìn)行基因操作的，因此其不能用作簡(jiǎn)單的克隆試劑。
大腸桿菌DSM 6601天然地含有兩種質(zhì)粒，它們被稱(chēng)為pMut1或pMut2，和分別具有3177kb和5552kb的大小。例如在US-6,391,631中描述了這些質(zhì)粒和其DNA序列。
大腸桿菌的致病性或非致病性明顯部分地受到其質(zhì)粒的控制，從這一考慮出發(fā)，和部分出現(xiàn)的大腸桿菌菌株的“基因抗性”也可能與其隱蔽的質(zhì)粒有關(guān)這另一考慮出發(fā)，本發(fā)明的任務(wù)是開(kāi)發(fā)出無(wú)質(zhì)粒的大腸桿菌，除此之外其與原始菌株就其基因組DNA方面在基因上完全相同。
前述的任務(wù)通過(guò)提供大腸桿菌菌株DSM 6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆以及通過(guò)制備這樣的克隆的方法來(lái)解決。
在附圖中

圖1以示意圖的形式顯示了制備菌株DSM 6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆的方法路線。
圖2顯示了質(zhì)粒pMut1-Tc的物理圖譜。
圖3顯示了質(zhì)粒pMut2-Kn的物理圖譜。
在導(dǎo)致本發(fā)明的漫長(zhǎng)的研究中，已經(jīng)表明用通常的基因技術(shù)方法根本不能或者只在巨大的困難下能夠制備菌株DSM 6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆，因此必須采取特殊的方法來(lái)形成這樣的克隆。因?yàn)樵摼甑囊吧统似浠蚪MDNA之外還具有兩種不同大小的質(zhì)粒，因此這些質(zhì)粒的去除必須在多個(gè)、部分平行施行的步驟中進(jìn)行。
為了制備本發(fā)明的克隆，根據(jù)本發(fā)明的方法，在第一步驟中用抗生素抗性分別標(biāo)記在大腸桿菌菌株DSM 6601中天然存在的質(zhì)粒pMut1和pMut2。為此根據(jù)常規(guī)方法分離質(zhì)粒，并在希望的位點(diǎn)上引入抗性基因。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，將抗性基因與表達(dá)盒一起引入各個(gè)質(zhì)粒中，該表達(dá)盒含有構(gòu)建的或還是可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
然后，根據(jù)常規(guī)方法如CaCl2方法或電穿孔將如此獲得的質(zhì)粒引入合適的宿主中，并在那里進(jìn)行克隆，其中引入各個(gè)質(zhì)粒中的抗性基因使得能夠容易地選擇帶有該質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。適合于克隆帶有該抗性基因的質(zhì)粒的宿主例如為大腸桿菌菌株DH5α或大腸桿菌HB101。
分離帶有該抗性基因的質(zhì)粒，隨后將sacB基因引入質(zhì)粒中，以提供進(jìn)一步的標(biāo)記。
然后，將如此獲得的或者說(shuō)經(jīng)標(biāo)記的質(zhì)粒引入大腸桿菌菌株DSM6601中。
在轉(zhuǎn)化之后，將大腸桿菌DSM 6601在含有抗生素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)于該抗生素在先前的步驟中引入質(zhì)粒的抗性基因能夠表現(xiàn)出抗性。
通過(guò)在這樣的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，只有對(duì)于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中含有的抗生素具有抗性的克隆能夠生長(zhǎng)。此外，因?yàn)檫@些細(xì)菌的生長(zhǎng)不再需要原來(lái)的質(zhì)粒pMut1和pMut2，所以這些細(xì)菌丟失多余的基因物質(zhì)，以致于這些細(xì)菌最后只是仍然含有經(jīng)修飾的質(zhì)粒pMut1和pMut2(其含有抗性基因和sacB基因)。
在進(jìn)一步的步驟中，將如此培養(yǎng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至抑制含有sacB的細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，其中產(chǎn)生基本上只允許已經(jīng)丟失sacB基因的細(xì)菌生長(zhǎng)的選擇壓力。這可以通過(guò)在10％蔗糖的存在下于30℃培養(yǎng)菌株來(lái)進(jìn)行，因?yàn)樵谶@樣的條件下只有這種已經(jīng)丟失了帶有sacB基因的質(zhì)粒的克隆能夠進(jìn)行復(fù)制。
結(jié)果獲得菌株DSM 6601的無(wú)質(zhì)粒的衍生物。
現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，具有質(zhì)粒喪失的本發(fā)明的克隆絲毫沒(méi)有發(fā)生基因組DNA的改變，并能夠令人驚奇地很好地用作克隆載體。
因此，它們能夠在實(shí)驗(yàn)室中無(wú)風(fēng)險(xiǎn)地用作宿主細(xì)胞用于克隆或表達(dá)許多基因或蛋白質(zhì)。使用本發(fā)明的菌株DSM 6601 ΔpMut1/2的試驗(yàn)表明，當(dāng)將外源DNA整合入該菌株的特有的、以分離的形式存在的質(zhì)粒中，即該特有的質(zhì)粒由此用作外源DNA的克隆載體時(shí)，該菌株是對(duì)于外源DNA的特別優(yōu)異的受體。此外，因?yàn)檫@些細(xì)菌來(lái)自非致病性菌株，因此它們能夠用于在動(dòng)物和人中治療胃腸道紊亂。為此，如果需要，它們可以用促進(jìn)細(xì)菌粘附在粘膜上的外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如粘附素，其視需要宿主動(dòng)物特異性地促使細(xì)菌粘附在例如牛和/或豬的粘膜上，因此阻礙或防止其他病原微生物的生長(zhǎng)。
現(xiàn)在，用參考實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明。
實(shí)施例1pMut1的改變野生型DSM 6601的兩種天然存在的質(zhì)粒pMut1和pMut2根據(jù)QIAGEN的質(zhì)粒中等規(guī)模制備方案(Plasmid-Midiprep-Protokoll)(QIAGEN Plasmid Purification Handbook 12/2002，第16-20頁(yè))來(lái)進(jìn)行分離。
為了標(biāo)記質(zhì)粒pMut1，選擇源自載體pBR322的四環(huán)素抗性盒。將附屬的啟動(dòng)子從質(zhì)粒pASK75中取出。將由這樣的克隆過(guò)程得到的質(zhì)粒稱(chēng)為pKS-tetAtetp/o。用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI和HindIII切割出插入片段tetAtetp/o(插入片段大小為1.5kb)。將該XbaI/HindIII片段通過(guò)NbeI限制性酶切位點(diǎn)引入質(zhì)粒pMut1中。
為此，在用相應(yīng)的酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化之后，將限制性?xún)?nèi)切酶酶切產(chǎn)物通過(guò)柱(Quiagen，PCR純化試劑盒)進(jìn)行純化，并進(jìn)行Klenow處理以形成“平頭末端”。為了防止質(zhì)粒pMut1的重新連接，將用限制性?xún)?nèi)切酶NdeI線性化并用Klenow酶處理的質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化。隨后將載體pMut1與插入片段tetAtetp/o連接，并用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12菌株DH5α。
為了制備感受態(tài)細(xì)胞，將150ml LB培養(yǎng)基(Lurea-Bertani培養(yǎng)基)用1.5mlN培養(yǎng)物接種，并于37℃搖動(dòng)，直至OD600＝0.5。然后將細(xì)菌培養(yǎng)物于冰上培養(yǎng)20分鐘，并于4℃以4000Upm離心10分鐘。將細(xì)菌粒狀沉淀在無(wú)菌的、冰冷的10％甘油中洗滌3次，第一次用100％的初始體積，然后用50％的初始體積，和最后一次用10％的初始體積。最后，將經(jīng)洗滌的沉淀物重新懸浮在300μl 10％甘油中，等分成幾份(40μl)，并于-80℃儲(chǔ)存。為了轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞，將1-2μl質(zhì)粒DNA(1-100ng)與40μl在冰上融解的感受態(tài)細(xì)胞混合，并在冰上培養(yǎng)5分鐘。然后，用移液器將這一所得物無(wú)氣泡地轉(zhuǎn)移至無(wú)菌且預(yù)冷的2mm電穿孔杯(Küvette)的兩個(gè)電極之間。將該杯充分晾干，并在電極夾中使用。于2.5kV、200Ω和25μF實(shí)施了電脈沖之后，用1ml LB培養(yǎng)基將細(xì)菌懸浮液從電穿孔杯中沖洗出來(lái)，并在搖床中于37℃培養(yǎng)1-2小時(shí)。隨后離心出細(xì)菌，并取出直至100μl的上清液。將沉淀在剩余的100μl中重新懸浮，在含有Tc的選擇平板上涂板，并將N于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。
克隆的結(jié)果通過(guò)微量制備單個(gè)細(xì)菌克隆的各個(gè)質(zhì)粒來(lái)檢查。將用四環(huán)素盒標(biāo)記的質(zhì)粒pMut1稱(chēng)為pMut1-Tc。在圖2中描繪了質(zhì)粒pMut1-Tc的物理圖譜。給出了對(duì)于介導(dǎo)四環(huán)素抗性的DNA片段的插入位點(diǎn)(初始時(shí)為單NdeI位點(diǎn))。所述DNA片段還含有適合于克隆的單EcoRI序列。此外，給出了對(duì)于引物Muta5和Muta6的結(jié)合位點(diǎn)，這些引物適合于通過(guò)PCR來(lái)特異性地檢測(cè)這些質(zhì)粒。
實(shí)施例2pMut2的改變?yōu)榱藰?biāo)記質(zhì)粒pMut2，選擇源自載體pACYC177的卡那霉素抗性盒。為此，用限制性?xún)?nèi)切酶StuI從該質(zhì)粒中切割出抗性盒(大小為1.34kb)，并通過(guò)BglII限制性酶切位點(diǎn)引入質(zhì)粒pMut2中。在用相應(yīng)的酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化之后，將限制性?xún)?nèi)切酶酶切產(chǎn)物通過(guò)柱(Quiagen，PCR分級(jí)試劑盒)進(jìn)行純化，并進(jìn)行Klenow處理所述質(zhì)粒pMut2以形成用于克隆的”平頭末端”。為了防止質(zhì)粒pMut2的重新連接，將用限制性?xún)?nèi)切酶BglII線性化并用Klenow酶處理的質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化。隨后連接載體pMut2和卡那霉素盒，并用此如實(shí)施例1中所述轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12菌株DH5α。將所述轉(zhuǎn)化物在含有Kn的LB瓊脂平板上進(jìn)行涂板?？寺〉慕Y(jié)果通過(guò)微量制備單個(gè)細(xì)菌克隆的質(zhì)粒DNA來(lái)檢查。將用卡那霉素盒標(biāo)記的質(zhì)粒pMut2稱(chēng)為pMut2-Kn。
在圖3中描繪了質(zhì)粒pMut2-Kn的物理圖譜。圖中畫(huà)出了對(duì)于卡那霉素抗性盒的插入位點(diǎn)(初始時(shí)為單BglII位點(diǎn))，以及適合作為克隆位點(diǎn)的單EcoRI序列。用Muta7至Muta10標(biāo)明與引物序列互補(bǔ)的那些區(qū)域，這些區(qū)域適合于通過(guò)PCR來(lái)特異性地檢測(cè)這些質(zhì)粒。
實(shí)施例3sacB基因的引入為了將sacB基因(編碼果聚糖蔗糖酶)引入用抗性盒標(biāo)記的質(zhì)粒pMut1-Tc和pMut2-Kn中，各在這兩個(gè)質(zhì)粒中選擇出單EcoRI限制性酶切位點(diǎn)。用限制性?xún)?nèi)切酶PstI從質(zhì)粒pCVD442中分離出sacB基因(大小為2.6kb)。為了準(zhǔn)備載體pMut1-Tc和pMut2-Kn，將這些質(zhì)粒用EcoRI進(jìn)行線性化，隨后施行Klenow處理以形成“平頭末端”以及去磷酸化。將插入片段sacB在用PstI進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶消化之后進(jìn)行純化，并用Klenow酶處理。連接線性化的載體和插入片段，并用此轉(zhuǎn)化如實(shí)施例1中所述制成感受態(tài)的大腸桿菌K-12菌株DH5α?？寺〉慕Y(jié)果通過(guò)微量制備單個(gè)細(xì)菌克隆的質(zhì)粒DNA和隨后的限制性?xún)?nèi)切酶酶切分析來(lái)檢查。將用sacB基因標(biāo)記的質(zhì)粒pMut1-Tc和pMut2-Kn稱(chēng)為pMut1-TcSac和pMut2-KnSac。
實(shí)施例4大腸桿菌菌株DSM 6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆的制備首先，將質(zhì)粒pMut1-TcSac如實(shí)施例1所述通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化入這一菌株中。在用于將質(zhì)粒pMut1-TcSac轉(zhuǎn)移入菌株DSM 6601中的電穿孔之后，將所得物在含有Tc(50μg/ml)的LB平板上進(jìn)行涂板。將獲得的四環(huán)素抗性細(xì)菌克隆就質(zhì)粒pMut1-TcSac的擁有和與此相關(guān)的天然存在的質(zhì)粒pMut1的喪失方面進(jìn)行檢查。質(zhì)粒pMut1的喪失通過(guò)如下方法進(jìn)行檢測(cè)，即在制備質(zhì)粒DNA和用酶EcoRI進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化之后，并在電泳分離線性化的質(zhì)粒之后，通過(guò)代表pMut1的DNA條帶的喪失來(lái)檢測(cè)。
隨后將這些克隆之一在含有10％蔗糖的LB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后在含有10％蔗糖的LB平板上進(jìn)行涂板(LB培養(yǎng)基的組成為在1L蒸餾水中含有10g來(lái)自酪蛋白的蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化鈉)。在冷卻至45℃之后通過(guò)向經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基中添加一定比例的過(guò)濾除菌的50％(重量/體積)蔗糖原液直至10％的終濃度，來(lái)制備含有蔗糖的LB培養(yǎng)基。將平板于30℃進(jìn)行培養(yǎng)。在這些條件下，只有那些不再表達(dá)sacB即已經(jīng)丟失了帶有sacB基因的質(zhì)粒的克隆能夠進(jìn)行復(fù)制。對(duì)由此得到的菌株DSM 6601 ΔpMut1就質(zhì)粒pMut1-TcSac的喪失進(jìn)行檢查。
然后，通過(guò)電穿孔將質(zhì)粒pMut2-KnSac引入菌株DSM 6601 ΔpMut1中。
在用于將質(zhì)粒pMut2-KnSac轉(zhuǎn)移入菌株DSM 6601 ΔpMut1中的電泳之后，將所得物在含有Kn(50μg/ml)的LB平板上進(jìn)行涂板。將所獲得的卡那霉素抗性細(xì)菌克隆就質(zhì)粒pMut2-KnSac的擁有和與此相關(guān)的天然存在的質(zhì)粒pMut2的喪失方面進(jìn)行檢查。隨后將這些克隆之一在含有10％蔗糖的LB培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后在含有10％蔗糖的LB平板上進(jìn)行涂板。將平板于30℃進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)由此得到的菌株DSM 6601 ΔpMut1/2就質(zhì)粒pMut2-KnSac的喪失進(jìn)行檢查。
此外，對(duì)于無(wú)質(zhì)粒的菌株DSM 6601 ΔpMut1/2施行脈沖場(chǎng)電泳，以排除可能的菌株的染色體改變。已確定不能檢測(cè)到變化，且進(jìn)一步的試驗(yàn)證明無(wú)質(zhì)粒的克隆絲毫沒(méi)有顯示出形態(tài)學(xué)的、生物化學(xué)的或發(fā)酵的變化。
權(quán)利要求
1.大腸桿菌菌株DSM 6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆。
2.用于制備根據(jù)權(quán)利要求1的無(wú)質(zhì)粒的克隆的方法，其特征在于下列步驟a)將抗性基因引入質(zhì)粒pMut1和pMut2中，b)將sacB基因引入步驟a)中獲得的質(zhì)粒中，c)將步驟b)中獲得的質(zhì)粒引入大腸桿菌菌株DSM 6601中，并在這樣的條件下培養(yǎng)該菌株，即在該條件下天然存在的質(zhì)粒pMut1和pMut2受到步驟b)中獲得的質(zhì)粒的排擠；和d)將步驟c)中獲得的克隆在這樣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，即該條件使得基本上只有喪失sacB基因的細(xì)菌能夠生長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于，抗性基因存在于表達(dá)盒中。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其特征在于，抗性基因選擇四環(huán)素抗性或卡那霉素抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于，質(zhì)粒pMut1用四環(huán)素抗性盒和sacB基因進(jìn)行標(biāo)記，和原來(lái)的質(zhì)粒pMut2用卡那霉素抗性盒和sacB基因進(jìn)行標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)的方法，其中將用標(biāo)記有四環(huán)素抗性盒和sacB基因的質(zhì)粒pMut1轉(zhuǎn)化的細(xì)菌在含有四環(huán)素的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，隨后在含有蔗糖的平板上進(jìn)行培養(yǎng)，并在首先去除質(zhì)粒pMut1之后，通過(guò)在卡那霉素平板上進(jìn)行培養(yǎng)和在蔗糖平板上繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)去除質(zhì)粒pMut2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的無(wú)質(zhì)粒的克隆用作克隆菌株的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的無(wú)質(zhì)粒的克隆用于制備藥劑的用途，該藥劑用于在動(dòng)物中治療胃腸的紊亂。
全文摘要
本發(fā)明涉及大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DSM6601的無(wú)質(zhì)粒的克隆，其制備方法以及其作為克隆載體的用途。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1700925SQ200480000915
公開(kāi)日2005年11月23日 申請(qǐng)日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月26日
發(fā)明者J·哈克爾, T·歐爾施拉格爾, S·奧斯瓦爾德, U·索南波恩, H·普羅泊特 申請(qǐng)人:制藥中心有限公司