專利名稱：一種黃色短桿菌質(zhì)粒提取的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物菌種質(zhì)粒提取技術(shù)領(lǐng)域。具體說，涉及一種黃色短桿菌質(zhì)粒的提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
黃色短桿菌(Brevikicterium flavum)，放線菌目短桿菌屬，是專性好氧、無芽孢的革蘭氏陽性短桿狀細(xì)菌，作為一種重要的工業(yè)菌種，常用于生產(chǎn)各種氨基酸。目前，采用基因工程方法構(gòu)建攜帶某種目的基因的重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得基因工程菌從而提高某種產(chǎn)品的產(chǎn)量是生產(chǎn)中常用的手段，黃色短桿菌也常用作構(gòu)建基因工程菌的宿主菌。在基因工程菌構(gòu)建過程中，為避免出現(xiàn)假陽性重組菌，需要從宿主菌中提取外源質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)及酶切驗(yàn)證。由于黃色短桿菌細(xì)胞壁比較特殊，采用常規(guī)的細(xì)菌質(zhì)粒提取方法不容易將其中的外源質(zhì)粒提取出來，因此需進(jìn)行特殊處理?，F(xiàn)有技術(shù)報(bào)道了一些有關(guān)黃色短桿菌構(gòu)建氨基酸基因工程菌的研究，特別是申請(qǐng)人在該領(lǐng)域做了大量前期研究。目前，本領(lǐng)域突出的技術(shù)問題在于，如何優(yōu)化和提高現(xiàn)有技術(shù)中黃色短桿菌質(zhì)粒的提取技術(shù)，能夠有效提高質(zhì)粒提取濃度及純度，既可用于PCR檢測(cè)， 也可用于酶切檢測(cè)，實(shí)用性強(qiáng)，是目前該領(lǐng)域存在的急需解決的技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)在將外源質(zhì)粒導(dǎo)入宿主菌的方法構(gòu)建基因工程菌的過程中， 為避免出現(xiàn)假陽性重組菌，需要從宿主菌中提取外源質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)及酶切驗(yàn)證；確保黃色短桿菌生長(zhǎng)迅速并有效阻止黃色短桿菌形成致密的細(xì)胞壁，降低質(zhì)粒提取難度是目前急需解決的技術(shù)問題。本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上，提供一種黃色短桿菌質(zhì)粒的提取方法，能夠有效提高質(zhì)粒提取濃度及純度，既可用于PCR檢測(cè)，也可用于酶切檢測(cè)，實(shí)用性強(qiáng)，同時(shí)提供一種液體培養(yǎng)基，能夠確保黃色短桿菌生長(zhǎng)迅速并能有效阻止黃色短桿菌形成致密的細(xì)胞壁，降低質(zhì)粒提取難度。本發(fā)明提供的技術(shù)方案通過提供的一種液體培養(yǎng)基，可使黃色短桿菌快速生長(zhǎng)， 培養(yǎng)12小時(shí)菌體OD6tltl ^ 1. 0 ；同時(shí)在培養(yǎng)基中添加異煙胼和甘氨酸，可阻止黃色短桿菌形成致密的細(xì)胞壁，提取質(zhì)粒過程中，采用一定的溶菌酶、EDTA等試劑處理，最后采用聚乙二醇方法進(jìn)行純化。本發(fā)明具體提供一種黃色短桿菌質(zhì)粒提取方法，具體提取步驟如下(1)將保存于斜面的含外源質(zhì)粒的黃色短桿菌劃線接種于含有20mg/ml氯霉素和 100mg/ml鏈霉素的MPA平板培養(yǎng)基上。(2)待菌落長(zhǎng)出后挑取單菌落接種于20ml液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，接種時(shí)加入終濃度為0.4% (w/v)的異煙胼，終濃度為3% (w/v)的甘氨酸。
3
(3)取5ml菌液，4°C，IOOOOrpm離心2分鐘，棄上清，吸盡殘留液體。(4)將菌體重懸于800 μ 1溶菌酶溶液，充分混勻，30°C水浴2小時(shí)，其間時(shí)常翻轉(zhuǎn)
離心管。(5)將步驟(4)離心管中加入200 μ 1 0. 5Μ的EDTA, ρΗ 8. 0，充分混勻，30°C溫浴 30分鐘。(6)將步驟(5)離心管中加入Iml 2%的SDS及Iml 0. 2M的NaOH，快速混勻，56°C 溫浴10分鐘。(7)將步驟(6)離心管中加入1. 5ml KAc溶液，充分混勻，冰浴3分鐘。(8)在4°C，12000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管，加入與上清液等體積的酚氯仿(V/V，1:1)，混勻，4°C，12000rpm離心5分鐘。(9)將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入與上清液等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置 15分鐘。(10)在室溫條件，12000rpm離心5分鐘，去上清，所得沉淀即為質(zhì)粒。(11) 70%乙醇洗滌兩次，室溫晾干后加入:3ml TE，pH 8. 0，溶解質(zhì)粒，保存于_20°C本發(fā)明中，采用的液體培養(yǎng)基成分為蔗糖2.5% (w/v)，酵母粉2% (w/v), (NH4)2S042% (w/v)，MgSO4 · 7H20 0. 02% (w/v)，KH2PO4O. 05% (w/v)。本發(fā)明中，黃色短桿菌即為本領(lǐng)域通常所述的黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)可由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心等專業(yè)菌種保藏機(jī)構(gòu)購買，其它構(gòu)建載體所用的出發(fā)質(zhì)粒pUL330、pUC18、pKK232-8、pKK223-3、pUC4K及中間質(zhì)粒pUC19_T都可通過生物公司購買。本發(fā)明中，含外源質(zhì)粒的黃色短桿菌采用本領(lǐng)域熟知的方法可獲得，本發(fā)明提供了一種本領(lǐng)域常用獲取含外源質(zhì)粒的黃色短桿菌的方法，具體步驟如下(1)將質(zhì)粒pUL330、pUC18分別用Ml I-Hind III酶切，分別回收大片段相連，獲
得一質(zhì)粒。(2)將步驟⑴所得質(zhì)粒經(jīng)Dra I-Hind III酶切，回收4. Skb片段，采用DNA平滑化試劑盒將其末端平滑化，獲得一片段備用；將質(zhì)粒PUC 4K用I^st I酶切，回收1.31Λ片段備用；將兩備用片段連接后獲得一質(zhì)粒。(3)將步驟⑵所得質(zhì)粒采用Bgl I-EcoR I酶切，回收大片段后將其末端平滑化， 得到一片段，備用；將質(zhì)粒PKK232-8用Sma I-PVU II酶切，回收1. 41Λ片段將其末端平滑化，得到另一片段，備用；將兩備用片段相連，得到一質(zhì)粒。(4)將質(zhì)粒pKK223-3用Sma I-BamH I酶切，回收含tac啟動(dòng)子的片段備用；同時(shí)將步驟(3)所得質(zhì)粒用Hind III酶切，回收所得片段，將其末端平滑化，用BAmH I酶切，回收大片段備用；將回收備用的兩片段相連，得到含tac啟動(dòng)子的質(zhì)粒。(5)將步驟(4)所得質(zhì)料用Nru I-Hind III酶切，回收大片段備用；將質(zhì)粒pUC18 用EcoR I酶切，回收大片段并將其末端平滑化，所得片段用Hind III酶切，回收小片段備用；將回收的兩備用片段相連，所得質(zhì)粒即為可在黃色短桿菌/大腸桿菌穿梭表達(dá)載體。(6)提取谷氨酸棒桿菌ATCC39135基因組DNA，以此DNA為模板，以gdh_up 5 ‘ -AGTCGACACGAGGAAATCATGACAGTTG-3 ‘(含 Sal I 酶切位點(diǎn))，gdh-down 5' AAGCTTTCTTAGATGACGCCCTGT-3‘(含 Hind III 酶切位點(diǎn))為引物，進(jìn)行 PCR，回收目的條帶，所得片段為谷氨酸脫氫酶基因(gdh)；將gdh連接至pUC19-T載體，得到一含目的基因的中間質(zhì)粒。(7)將步驟(6)所得質(zhì)粒用Ml I、Hind III酶切，回收目的基因gdh。同時(shí)將步驟(5)所得載體質(zhì)粒用Ml I、Hind III酶切，回收載體大片段，將目的基因與載體大片段相連，即獲得含目的基因的重組質(zhì)粒。(8)采用電擊轉(zhuǎn)化方法將上述步驟(7)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黃色短桿菌，即獲得帶外源質(zhì)粒的黃色短桿菌。通過實(shí)施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果1.采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，黃色短桿菌生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)12小時(shí)菌體OD6tltl >1.0， 同時(shí)可阻止黃色短桿菌形成致密的細(xì)胞壁。2.采用本發(fā)明提供的質(zhì)粒提取方法，可有效提高質(zhì)粒提取濃度及純度，所得質(zhì)粒濃度達(dá)132 μ g/ml, OD260/OD280為1. 8，既可用于PCR檢測(cè)，也可用于酶切檢測(cè)。


圖1顯示為重組質(zhì)粒酶切及PCR驗(yàn)證圖，圖中，泳道1為重組質(zhì)粒單酶切，泳道M 為11Λ Marker,泳道2為重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物，泳道3為PCR陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料和設(shè)備有主要試劑牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、酵母粉、異煙胼、甘氨酸、聚乙二醇、瓊脂粉、(NH4)2S04、MgSO4 · 7H20、KH2P04、KAc、SDS、Na0H、LiCl、MgCl2、EDTA、Tris · Cl、CaCl2、BSA、 冰醋酸、異丙醇、乙醇、飽和酚、氯仿、TE、foiase A、溶菌酶、氯霉素、鏈霉素。主要儀器單人雙面超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、冷藏冷凍冰箱、數(shù)顯控溫水浴鍋、電子精密天平電熱恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌鍋、移液器。本發(fā)明中，黃色短桿菌可由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心等專業(yè)菌種保藏機(jī)構(gòu)購買，其它構(gòu)建載體所用的出發(fā)質(zhì)粒pUL330、pUC18、pKK232_8、pKK223_3、pUC4K及中間質(zhì)粒pUC19-T都可通過生物公司購買。本發(fā)明中，溶菌酶溶液成分為，溶菌酶ang/ml，Tris · Cl(pH 8.0)lmM，葡萄糖 0. 7M, CaCl2IOmM, BSA 0. 01% (w/v) ；PEG-MgCl2 溶液成分為，聚乙二醇(PEG 8000)40% (w/ ν), MgCl2 30mM;KAc 溶液成分為，KAc 3M，冰醋酸 11. 5% (ν/ν)；TE (ρΗ 8. 0)成分為，Tris · Cl (ρΗ 8. 0) IOmM, EDTA (pH 8. 0) ImM0本發(fā)明中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。實(shí)施例一(1)將質(zhì)粒pUL330、pUC18分別用Ml I-Hind III酶切，分別回收大片段相連，獲
得一質(zhì)粒。(2)將步驟(1)所得質(zhì)粒經(jīng)Dra I-Hind III酶切，回收4. Skb片段，采用DNA平滑化試劑盒將其末端平滑化，獲得一片段備用；將質(zhì)粒PUC 4K用I^st I酶切，回收1.31Λ片段備用；將兩備用片段連接后獲得一質(zhì)粒。(3)將步驟(2)所得質(zhì)粒采用Bgl I-EcoR I酶切，回收大片段后將其末端平滑化， 得到一片段，備用；將質(zhì)粒PKK232-8用Sma I-PVU II酶切，回收1. 41Λ片段將其末端平滑化，得到另一片段，備用；將兩備用片段相連，得到一質(zhì)粒。(4)將質(zhì)粒pKK223-3用Sma I-BamH I酶切，回收含tac啟動(dòng)子的片段備用；同時(shí)將步驟(3)所得質(zhì)粒用Hind III酶切，回收所得片段，將其末端平滑化，用BamH I酶切，回收大片段備用；將回收備用的兩片段相連，得到含tac啟動(dòng)子的質(zhì)粒。(5)將步驟(4)所得質(zhì)料用Nru I-Hind III酶切，回收大片段備用；將質(zhì)粒pUC18 用EcoR I酶切，回收大片段并將其末端平滑化，所得片段用Hind III酶切，回收小片段備用；將回收的兩備用片段相連，所得質(zhì)粒即為可在黃色短桿菌/大腸桿菌穿梭表達(dá)載體。(6)提取谷氨酸棒桿菌ATCC39135基因組DNA，以此DNA為模板，以gdh_up 5 ‘ -AGTCGACACGAGGAAATCATGACAGTTG-3 ‘(含 Sal I 酶切位點(diǎn))，gdh-down 5' AAGCTTTCTTAGATGACGCCCTGT-3‘(含 Hind III 酶切位點(diǎn))為引物，進(jìn)行 PCR，回收目的條帶，所得片段為谷氨酸脫氫酶基因(gdh)；將gdh連接至pUC19-T載體，得到一含目的基因的中間質(zhì)粒。(7)將步驟(6)所得質(zhì)粒用Ml I、Hind III酶切，回收目的基因gdh。同時(shí)將步驟(5)所得載體質(zhì)粒用Ml I、Hind III酶切，回收載體大片段，將目的基因與載體大片段相連，即獲得含目的基因的重組質(zhì)粒。(8)采用電擊轉(zhuǎn)化方法將上述步驟(7)獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黃色短桿菌，即獲得帶外源質(zhì)粒的黃色短桿菌。實(shí)施例二(1)將保存于斜面的含外源質(zhì)粒的黃色短桿菌劃線接種于含有20mg/ml氯霉素和 100mg/ml鏈霉素的MPA平板培養(yǎng)基上。(2)待菌落長(zhǎng)出后挑取單菌落接種于20ml液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，接種時(shí)加入終濃度為0.4% (w/v)的異煙胼，終濃度為3% (w/v)的甘氨酸。(3)取5ml菌液，4°C，IOOOOrpm離心2分鐘，棄上清，吸盡殘留液體。(4)將菌體重懸于800 μ 1溶菌酶溶液，充分混勻，30°C水浴2小時(shí)，其間時(shí)常翻轉(zhuǎn)
離心管。(5)將步驟(4)離心管中加入200 μ 1 0. 5Μ的EDTA, ρΗ 8. 0，充分混勻，30°C溫浴 30分鐘。(6)將步驟(5)離心管中加入Iml 2%的SDS及Iml 0. 2M的NaOH,快速混勻，56°C 溫浴10分鐘。(7)將步驟(6)離心管中加入1. 5ml KAc溶液，充分混勻，冰浴3分鐘。(8)在4°C，12000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管，加入與上清液等體積的酚氯仿(V/V，1:1)，混勻，4°C，12000rpm離心5分鐘。(9)將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入與上清液等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置 15分鐘。(10)在室溫條件，12000rpm離心5分鐘，去上清，所得沉淀即為質(zhì)粒。(11)通過70%乙醇洗滌兩次，室溫晾干后加入:3ml TE, ρΗ 8. 0，溶解質(zhì)粒。
(12)將步驟(11)獲得的質(zhì)粒冰浴，冷卻至0°C ；加入3ml冰預(yù)冷的5M LiCl溶液， 混勻，4°C，12000rpm離心5分鐘。(13)轉(zhuǎn)移上清至新管中，加入與上清液等體積異丙醇，混勻，室溫靜置15分鐘，室 溫，12000rpm離心5分鐘。(14)棄上清，70%乙醇洗滌，室溫晾干。(15)用 500 ill 含 20 ii g/ml Rnase A 的 TE，pH8. 0，溶解沉淀，室溫靜置 30 分鐘。(16)加入500 u 1 PEG-MgCl2溶液，室溫放置10分鐘，4°C，12000rpm離心5分鐘，
棄上清。(17)沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫晾干。(18)質(zhì)粒沉淀用70 U 1 TE, pH8. 0，溶解后保存于_20°C。實(shí)施例三MPA平板培養(yǎng)基具體成分為
牛肉膏 10% (W/V) 蛋白胨 0.5% (W/V) 葡萄糖 2%(w/v)
瓊脂 1.5%(w/v)液體培養(yǎng)基具體成分為
蔗糖2. 5% (w/V)
酵母粉2% (w/V)
(NH4)2SO42% (w/V)
MgS04-7H200.02% (w/v)
KH2PO40.05% (w/v)通過上述提供的培養(yǎng)基，在pH 7.0, 30°C條件下，可使黃色短桿菌快速生長(zhǎng)，培養(yǎng) 12小時(shí)菌體0D_ ^ 1. 0，同時(shí)可阻止黃色短桿菌形成致密的細(xì)胞壁。實(shí)施例四采用上述實(shí)施例提供的黃色短桿菌質(zhì)粒提取方法，將獲得質(zhì)粒稀釋20倍，通過紫 外分光光度計(jì)測(cè)其OD26tl = 0. 132，根據(jù)質(zhì)粒濃度公式C = 50 X AXn (50 :在260nm下1個(gè)OD 值表示50ug/ml的雙鏈DNA ；A 吸光度值；n 稀釋倍數(shù))，算出所得質(zhì)粒濃度為132 u g/ml, 其0D26(l/0D■為1. 8，表明采用本發(fā)明提供的黃色短桿菌質(zhì)粒提取方法可有效提高質(zhì)粒提取 濃度及純度，既可用于PCR檢測(cè)，也可用于酶切檢測(cè)。
權(quán)利要求
1. 一種黃色短桿菌質(zhì)粒提取方法，其特征在于，所述的具體提取步驟如下(1)將保存于斜面的含外源質(zhì)粒的黃色短桿菌劃線接種于含有20mg/ml氯霉素和 100mg/ml鏈霉素的MPA平板培養(yǎng)基上，所述的MPA平板培養(yǎng)基成分為，牛肉膏10% (w/v), 蛋白胨 0.5% (w/v)，葡萄糖 2% (w/v)，瓊脂 1.5% (w/v)；(2)待菌落長(zhǎng)出后挑取單菌落接種于20ml液體培養(yǎng)基中，接種時(shí)加入終濃度為0.4% (w/v)的異煙胼，終濃度為3% (w/v)的甘氨酸，30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜；所述的液體培養(yǎng)基成分為，蔗糖 2. 5% (w/v)，酵母粉 2% (w/v)，(NH4)2S042% (w/v)，MgSO4 · 7H20 0. 02% (w/v), KH2PO4O. 05% (w/v)；(3)取5ml菌液，4°C，IOOOOrpm離心2分鐘，棄上清，吸盡殘留液體；(4)將菌體重懸于800μ 1溶菌酶溶液，充分混勻，30°C水浴2小時(shí)，其間時(shí)常翻轉(zhuǎn)離心管；(5)將步驟(4)離心管中加入200μ 1 0. 5Μ的EDTA, ρΗ 8. 0，充分混勻，30°C溫浴30分鐘；(6)將步驟(5)離心管中加入Iml2%的SDS及Iml 0. 2M的NaOH,快速混勻，56°C溫浴 10分鐘；(7)將步驟(6)離心管中加入1.5ml KAc溶液，充分混勻，冰浴3分鐘；(8)在4°C，12000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管，加入與上清液等體積的酚氯仿(V/V, 1:1)，混勻，4°C，12000rpm離心5分鐘；(9)將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入與上清液等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置15分鐘；(10)在室溫條件，12000rpm離心5分鐘，去上清，所得沉淀即為質(zhì)粒；(11)70%乙醇洗滌兩次，室溫晾干后加入:3ml TE, ρΗ 8. 0，溶解質(zhì)粒，保存于_20°C備
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃色短桿菌質(zhì)粒提取方法。通過提供的一種液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)12小時(shí)菌體OD600≥1.0，可使黃色短桿菌快速生長(zhǎng)；同時(shí)在培養(yǎng)基中添加異煙肼和甘氨酸，可阻止黃色短桿菌形成致密的細(xì)胞壁，提取質(zhì)粒過程中，采用一定的溶菌酶、CaCl2等試劑處理，最后采用聚乙二醇方法進(jìn)行純化。采用本發(fā)明能夠有效提高質(zhì)粒提取濃度及純度，既可用于PCR檢測(cè)，也可用于酶切檢測(cè)，實(shí)用性強(qiáng)，同時(shí)有效阻止黃色短桿菌形成致密的細(xì)胞壁，能夠確保黃色短桿菌生長(zhǎng)迅速。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102321610SQ20111020604
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者包慧芳, 楊慧, 王寧, 王煒, 莫海燕 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所