專利名稱：一種利用農(nóng)桿菌轉化蘭科植物的技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生轉基因蘭科植物的方法，具體地說，涉及利用含目的基因的農(nóng)桿菌轉化蘭科植物的方法。
當今，在植物生物技術領域中，有關于植物轉化技術的報道，其中包括原生質(zhì)體法、基因槍法、農(nóng)桿菌感染法等。
所謂原生質(zhì)體法是指利用電穿孔或聚乙二醇技術將目的DNA導入原生質(zhì)體，然后從所述原生質(zhì)體再生植株。不過，問題在于此方法不能用于那些還沒有建立起由原生質(zhì)體再生為植株的植物品系，此外，用這種方法導入基因的效率也較低。基因槍法則是將吸附有目的基因的金屬粒子高速射入細胞從而進行轉化的方法，此方法原則上可以用于任何植物的組織和細胞并且轉化效率高，然而它需要基因槍這種專門的昂貴裝置。
另一方面，用感染性農(nóng)桿菌轉化植物的方法則已廣泛地用于雙子葉植物如煙草、kalanchoe等。盡管一般認為農(nóng)桿菌的寄主限于雙子葉植物而非單子葉植物，近年來，已報導用農(nóng)桿菌轉化包括水稻、小麥、大麥以及玉米等禾本科植物在內(nèi)的單子葉植物(EP 0 672 752 A1和EP 0 604 662 A1)。這些方法是用農(nóng)桿菌轉化培養(yǎng)的禾本科植物去分化組織或非去分化發(fā)育不完全的胚以產(chǎn)生轉基因植物體。盡管此方法可產(chǎn)生較高的轉化率，但還未證實以上方法可用于禾本科以外的單子葉植物。
蘭科植物屬單子葉植物，因此據(jù)認為其不為農(nóng)桿菌的寄主。事實上，我們前期的實踐也表明農(nóng)桿菌不能感染培養(yǎng)的蘭科植物去分化組織，也不能感染非去分化發(fā)育不完全的胚(未發(fā)表的資料)。因為蘭科植物很難由原生質(zhì)體再生成植株，所以，迄今為止要得到其轉化植株，本領域所知唯一有效的方法是利用基因槍向如蘭科植物胚狀體的上皮導入有用的基因(日本專利公開No.07255300 A)。
本發(fā)明的目的是提供一種利用農(nóng)桿菌的轉化來產(chǎn)生轉基因蘭科植物的方法。因此，此發(fā)明提供了一種轉化蘭科植物的方法。該方法包括利用含有待導入蘭科植物基因組的基因的農(nóng)桿菌感染來源于蘭科植物的組織。此方法使得首次利用農(nóng)桿菌轉化了蘭科植物。
在本發(fā)明中，蘭科植物的組織優(yōu)選是由蘭科植物的花梗節(jié)所長出的芽。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選培養(yǎng)感染的組織以產(chǎn)生胚狀體(PLB)，然后，再由PLB再生為成熟的蘭科植物。根據(jù)本方法，很容易獲得經(jīng)過同源轉化的成熟蘭科植物。
本發(fā)明的另一目的是提供包含有目的基因的轉基因蘭科植物。因此，該發(fā)明也提供了由農(nóng)桿菌轉化的轉基因蘭科植物。
根據(jù)本發(fā)明，欲用本方法轉化的蘭科植物可以是蘭科中的任何品系，包括Phalaenopsis，Dortitaenopsis，Doritis，Paraphalaenopsis，Euphalaenopsis及相關種。
根據(jù)本發(fā)明，欲用農(nóng)桿菌轉染的組織可以是如下蘭科植物的組織分化出的幼葉離體培養(yǎng)的原胚體、胚狀體及由花梗節(jié)所長出的芽。芽為最優(yōu)選。如何由花梗切段誘導出芽的方法在本領域中是已知的(M.Tanaka等，“園藝科學”(Scientia Horticulture)，35(1988)117-126)。簡言之，將蘭科植物的花梗節(jié)切成約1-3厘米的片段，切點位于梗節(jié)附近，切段培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)基中。優(yōu)選用于從花梗切段誘導芽的培養(yǎng)基包括Vacin-Went培養(yǎng)基、Murashige-Skoog培養(yǎng)基、Linsmaier-Skoog培養(yǎng)基及其它類似的但含低濃度鹽培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基添加本領域已知的適當成分。最優(yōu)選的培養(yǎng)基是Vacin-Went培養(yǎng)基，其由以下成分組成0.2g/l磷酸鈣、0.525g/l硝酸鉀、0.25g/l磷酸二氫鉀、0.5g/l硫酸銨、0.028g/l檸檬酸鐵(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸錳以及20g/l蔗糖。
花梗切段可在約20-30℃，約50-90％的相對濕度下培養(yǎng)。通常在培養(yǎng)一至三個月后，切段節(jié)上發(fā)芽。優(yōu)選用所述得到的芽來以農(nóng)桿菌感染。眾所周知，農(nóng)桿菌的感染發(fā)生在植物的傷口處，因此就必須先損傷植物，用細菌處理受傷部位。譬如，為用農(nóng)桿菌感染芽，可以尖部涂有農(nóng)桿菌的竹針損傷芽。
農(nóng)桿菌已被用作雙子葉植物基因工程的載體。本說明書中，“農(nóng)桿菌”表示農(nóng)桿菌屬或其衍生株系。根據(jù)本發(fā)明，農(nóng)桿菌可以是本領域中已知的用于轉化雙子葉植物的任何株系，如Agrobacterium rhizogenes、Agrobacteriumtumefaciens，及其衍生株系。有許多可從市面上買到的株系。本說明書中的“衍生株系”一詞可以是來導入目的基因或促進細菌中所含的Ti/Ri質(zhì)粒的毒力的天然突變體和由本領域已知的任何方法得到的菌株的突變體。
當植物感染農(nóng)桿菌后，其Ti/Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)就會轉移并整合到植物細胞的基因組中。通常質(zhì)粒的T-DNA位點含有決定植物激素生物合成的基因，因而感染的宿主基因的T-DNA區(qū)的表達會產(chǎn)生導致感染位點瘤形成的植物組織的異常生長，使感染部位產(chǎn)生腫瘤。為了向宿主植物導入外源基因，必須將目的基因導入細菌Ti/Ri質(zhì)粒的T區(qū)。
向質(zhì)粒的T-DNA區(qū)導入外源基因的方法在本領域中是熟知的(Y.Hiei等，“植物雜志”(The Plant Journal)(1994)6(2)271-282，EP 0 672-752 A1，EP 0604 662 A1及Y.NIWA，“農(nóng)桿菌和植物細胞的相互作用”BISEIBUTSU(1987)3(4)407-417)。例如，用適當?shù)南拗菩悦盖邢碌奈⑸铩⒅参锘騽游锏哪康幕蚩蛇B結到同種限制酶切割的農(nóng)桿菌質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。或者，該區(qū)的不需要的基因也可用與上述方法相同的方法除去。另外，也可使用能買到的含有目的基因的菌株。
根據(jù)本發(fā)明，欲向蘭科植物導入的基因可以是任何目的基因，如決定抗病的、抗病毒的、抗蟲的、矮化的、控制花色的和抗寒的基因。
根據(jù)本發(fā)明，質(zhì)粒的T-DNA區(qū)優(yōu)選還含有一個基因標記以便篩選和驗證轉化子。標記基因的例子在本領域中熟知，包括抗生素抗性基因，如抗卡那霉素、G418、氯霉素及氨芐青霉素等的抗性基因。另外，因為農(nóng)桿菌的Ti/Ri質(zhì)粒本身具有決定感染部位形成瘤的基因，所以感染成功的植物中會觀察到瘤或腫脹。例如，用Agrobacterium rhizogenes感染時，約三周后就可以觀察到瘤的形成。因此檢測用細菌處理過的部位腫脹或瘤的形成可以進行第一次篩選，來篩選感染成功的芽。被感染的芽在含有抗生素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)4-6周以清除感染的農(nóng)桿菌。用于除去農(nóng)桿菌的抗生素的例子包括Claforan，其在本領域中是熟知的。
當細菌清除結束后，立即將感染部位(即芽的腫脹部分)切下并培養(yǎng)于PLB誘導培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生胚狀體。蘭科植物的胚狀體被認為是和不定胚相關的組織，不定胚由諸如芽尖、由花梗培養(yǎng)物而來的葉裂片或根尖的外植體誘導。并且認為每個PLB來源于外植體的單個細胞，因此，轉化的PLB再生為成熟的植株，獲得的植株的所有細胞可能都是被同源轉化過了的。
Michio TANAKA 1987年曾在“Kagawa大學農(nóng)學教師備忘錄”(MemoirsofFaculty of Agriculture)(Vol.49，pp1-85)上報導過用片段誘導生成PLB的具體方法。簡言之，將芽的腫脹部分切下并切成1厘米見方的片段，再將得到的片段移植到PLB誘導培養(yǎng)基中并在約25℃，光照強度為2000-3000勒克斯下培養(yǎng)。在本發(fā)優(yōu)選使用的PLB誘導培養(yǎng)基的例子由以下成份組成3.5g/lHyponex(N∶P2O5∶K2O＝7∶6∶19)、100mg/l肌醇、1mg/l煙酸、1mg/l鹽酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸(NAA)、10mg/l N6-苯甲基腺嘌呤(BA)、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖。在培養(yǎng)約100天后，可觀察到已形成PLB。
將得到的PLB分別移植到分化培養(yǎng)基中以獲得“幼態(tài)植株”，根據(jù)本說明書，“幼態(tài)植株”表示長至1-2厘米高的植株。用于從PLB產(chǎn)生幼態(tài)植株的分化培養(yǎng)基在本領域中是已知的，例如，優(yōu)選的固體培養(yǎng)基由以下成分組成3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖。PLB可在本領域中已知的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
若農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)含有抗生素抗性基因，可在從PLB分化成的幼態(tài)植株之前或后篩選轉化體，篩選可以通過在含所述抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)PLB或獲得的幼態(tài)植株來進行。
為驗證所選擇的轉化體是否含有目的基因，在本領域中有一些已知的方法。例如，可將轉化子的基因組DNA進行擴增(如利用PCR技術)，再分析擴增DNA以證實是否含目的基因。若感染的農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)含有瘤形成基因，由轉化的PLB再生出的幼態(tài)植株形成瘤可作為轉化的信號。此外，可以對PLB或幼態(tài)植株進行組織學分析來驗證GUS基因的表達。
通過培養(yǎng)在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中，可將已驗證轉化成功的幼態(tài)植株培養(yǎng)成成熟植株。培養(yǎng)條件與從PLB分化為幼態(tài)植株所需的條件相同。
根據(jù)本方法的一個實施方案，分別用幾種農(nóng)桿菌轉化蘭科植物Phalaenopsis，所用的農(nóng)桿菌菌株分別為Agrobacterium rhizogenes R-1601，Agrobacterium rhizogenes 03-01724及ATCC No.15834的Agrobacteriumrhizogene系。這些菌株均有包含rol-C基因的Ri質(zhì)粒，該基因位于T-DNA區(qū)，決定植物的矮化。Agrobacterium rhizogenes R-1601菌株由美國華盛頓大學(Seattle，WA 98195，U.S.A.)生物化學系Gordon教授提供；Agrobacteriumrhizogenes 03-01724菌株來源于日本國立農(nóng)業(yè)生物資源研究院。
在梗節(jié)附近將Phalaenopsis的花梗節(jié)切成約1-3厘米長的片段，浸于1％的芐基二甲基氯化銨(benzalkonium chloride)水溶液中10分鐘，再轉入氯氣有效濃度為1％的次氯酸水溶液中浸20分鐘以對切段表面進行消毒，消毒好的切段置于Vacin-Went培養(yǎng)基上，此培養(yǎng)基由以下成分組成0.2g/l磷酸鈣、0.525g/l硝酸鉀、0.25g/l磷酸二氫鉀、0.028g/l檸檬酸鐵(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸錳以及20g/l蔗糖。培養(yǎng)溫度28℃，相對濕度90％。培養(yǎng)1個月后的切段的節(jié)萌發(fā)出芽。用然后用涂有上述農(nóng)桿菌菌株的竹針刺傷芽使之感染，感染后的芽在同樣條件下培養(yǎng)。
感染三周后，芽的感染部位腫脹。選擇腫脹的芽(即作為感染成功的芽的候選物)并且再在含有500μg/l Claforan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天以從芽清除農(nóng)桿菌。
細菌清除結束后，切下腫脹部分并切成1厘米見方的片段，再移植到PLB誘導培養(yǎng)基中固定培養(yǎng)以誘導PLB的形成，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為2000勒克斯，培養(yǎng)基由以下成分組成3.5g/l Hyponex、100mg/l肌醇、1mg/l煙酸、1mg/l鹽酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸、10mg/l苯甲基腺嘌呤、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖(Michio TANAKA，Memoirs of Faculty ofAgriculture，Kagawa University，Vol.49，pp1-85，1987)。將產(chǎn)生的PLB分別培養(yǎng)在含3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖的分化培養(yǎng)基上以誘導幼態(tài)植株。
將產(chǎn)生的幼態(tài)植株移植到含有抗生素的選擇培養(yǎng)基以選擇抗生素抗性植株。再于與誘導幼態(tài)植株相同的條件下培養(yǎng)選擇的幼態(tài)植株。若農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)在幼株中成功表達，則可在選擇出的幼株中觀察到瘤。在相同條件下進一步培養(yǎng)3-5個月后，即可得到成熟的矮化植株和成熟的合軸植株。
我們通過下述實施例進一步闡述本發(fā)明而不是進行限制。
實施例1在梗節(jié)附近將Phalaenopsis的花梗節(jié)切成約1-3厘米長的片段，浸于1％的芐叉氯水溶液中10分鐘，再轉入氯氣有效濃度為1％的次氯酸水溶液中浸20分鐘以對切段表面進行消毒，消毒好的切段置于Vacin-Went培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基由以下成分組成0.2g/l磷酸鈣、0.525g/l硝酸鉀、0.25g/l磷酸二氫鉀、0.028g/l檸檬酸鐵(III)水合物、0.0075g/l四水硫酸錳以及20g/l蔗糖。培養(yǎng)溫度28℃，相對濕度90％，時間為1個月。培養(yǎng)1個月后切段的節(jié)萌發(fā)出芽。用農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes R-1601感染芽并在同樣的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。本發(fā)明所用的Agrobacterium rhizogenes R-1601菌株由美國華盛頓大學(Seattle，WA 98195，U.SA.)生物化學系Milton P.Gordon教授購得，對其性質(zhì)Pythoud等已于“生物技術”(Bio.Technology)，5,1323-1327(1987)上加以描述。該菌株的Ri質(zhì)粒中含特定的vir區(qū)，其增加細菌的毒力。另外，Ri質(zhì)粒中還含G418抗性區(qū)及rol-C基因，該基因位于T-DNA區(qū)，決定植物的矮化性狀。
感染3個月后，芽的被感染部位出現(xiàn)腫脹。選擇腫脹的芽并進一步地在含500μg/l Claforan的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，以清除芽中的農(nóng)桿菌。
當細菌清除結束后，切下芽的腫脹部分并切成1厘米見方的片段，再移植到PLB誘導培養(yǎng)基中固定培養(yǎng)以產(chǎn)生PLB。培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為2000勒克斯。培養(yǎng)基由以下成分組成3.5g/l Hyponex、100mg/l肌醇、1mg/l酸、1mg/l鹽酸硫胺素、1mg/lα-萘乙酸、10mg/l苯甲腺嘌呤、10mg/l腺嘌呤及20g/l蔗糖。然后將產(chǎn)生的PLB分別培養(yǎng)到含3g/l Hyponex、50g/l土豆浸出液和20g/l蔗糖的分化培養(yǎng)基中以誘導幼態(tài)植株。
產(chǎn)生的幼態(tài)植株移植到含有20μg/l G418的培養(yǎng)基上以篩選抗生素抗性植株，選擇出的幼態(tài)植株在與誘導幼態(tài)植株相同的條件下進一步培養(yǎng)。觀察到選擇的幼態(tài)植株上的瘤的發(fā)生，證實農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)的基因在再生的植株中成功表達。選擇的幼態(tài)植株在相同條件下再培養(yǎng)3-5個月，結果得到成熟的矮化植株和成熟的合軸植株。
本發(fā)明首次提供了用農(nóng)桿菌轉化蘭科植物的方法。據(jù)本發(fā)明可容易地得到含目的基因的轉基因蘭科植物。
權利要求
1.一種轉化蘭科植物的方法，其包括如下步驟利用農(nóng)桿菌感染所述蘭科植物的組織，其中該農(nóng)桿菌具有待導入該植物的基因。
2.權力要求1的方法，其中，所述蘭科植物的組織是指植物花梗節(jié)發(fā)的芽。
3.權力要求1的方法，其還包括如下步驟由感染組織誘導胚狀體(PLB)，再將所述胚狀體轉化為成熟的植株。
4.權力要求1的方法，其中，農(nóng)桿菌選自Agrobacterium rhizogenes、Agrobacterium tumefaciens及其衍生菌株。
5.權力要求4的方法，其中，農(nóng)桿菌是Agrobacterium rhizogenes及其衍生菌株。
6.權力要求1的方法，其中，蘭科植物是選自Phalaenopsis，Doritaenopsis，Doritis，Paraphalaenopsis，Euphalaenopsis及有關菌株。
7.權力要求4的方法，其中，蘭科植物是Phalaenopsis。
8.一種轉化的蘭科植物，其是通過一種方法轉化蘭科植物得到，該方法包括用具有待導入植物基因組的基因的農(nóng)桿菌感染所述蘭科植物的組織。
全文摘要
一種轉化蘭科植物的方法,該方法包括用具有待導入植物的基因的農(nóng)桿菌感染所述蘭科植物的組織。因此使得首次用農(nóng)桿菌轉化蘭科植物成為可能。
文檔編號C12N15/82GK1193253SQ97190514
公開日1998年9月16日 申請日期1997年3月26日 優(yōu)先權日1996年3月28日
發(fā)明者三浦靖高, 山本好和 申請人:日本涂料株式會社