專利名稱：用脂酶進行苯并二氮雜－乙酸酯的酶拆分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用脂酶進行化合物的旋光異構(gòu)體的拆分。
背景技術(shù)：
人們熟知可以用蛋白水解酶水解酯。在某些情況下，當(dāng)?shù)孜秕ゾ哂幸粋€或多個手性碳原子時，該蛋白水解酶可以同外消旋混合物中的一種對映體比另一種對映體更快地反應(yīng)。對于適當(dāng)?shù)牡孜铮@種化學(xué)選擇性可以用作該混合物拆分的基礎(chǔ)。此種選擇性水解反應(yīng)的產(chǎn)物為反應(yīng)的對映體的羧酸和醇，而未反應(yīng)的對映體仍然為酯。隨后所述酯和酸的易分離性成為羧酸或醇部分立體化學(xué)純化的基礎(chǔ)。
一般而言，當(dāng)手性和復(fù)雜性殘留于分子的羧酸部分時，則用酯酶或蛋白酶制備相應(yīng)的手性酸，而當(dāng)復(fù)雜性和手性殘留于醇部分時，那么則用脂酶制備手性醇。然而，人們也已知用脂酶拆分手性酸的部分實例。
該方法的立體化學(xué)純度通常取決于外消旋物的每種異構(gòu)體的水解速率，如相對速率差異越大，最終手性產(chǎn)物的純度則越高。不論能否發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)拿?，選擇性水解給定的化合物的適當(dāng)酶的選擇通常憑經(jīng)驗決定。因此，作為有用的酶，該酶必須以所需化合物為底物、僅選擇性水解適當(dāng)?shù)膶τ丑w并產(chǎn)生可接受的對映體過量(e.e.)。
WO 93/00095(PCT/US/92/05463)和WO 94/14776(PCT/US93/12436)、WO 95/18619(PCT/US95/00248)和PCT/US96/11108公開了部分具有藥用價值的苯并二氮雜化合物。此類化合物就是這種情況，其藥理活性主要于在其中報道的外消旋物的一種對映體中。因此，人們需要制備非外消旋化合物的方法。在其中報道的方法基于通過手性高效液相層析(HPLC)和純手性合成分離對映體。然而，HPLC方法通常具有難以大規(guī)模進行的缺點，而手性合成則基于昂貴的手性合成子，并可能在合成中產(chǎn)生部分外消旋。因此，需要新的制備此類化合物的立體選擇性方法。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)通過用得自酵母Candida Antarctica的脂酶立體選擇性水解外消旋混合物的拆分方法，可以制備非外消旋形式的WO93/00095(PCT/US/92/05463)、WO 94/14776(PCT/US93/12436)和WO95/18619(PCT/US95/00248)中公開的化合物。該拆分方法容易進行并具有高度選擇性，并代表了手性3-氧代-1，4-苯并二氮雜乙酸化學(xué)領(lǐng)域的重大突破。用酶水解進行外消旋苯并二氮雜的拆分先前未有報道。
本發(fā)明簡述一方面，本發(fā)明為用得自Candida Antarctica的脂酶選擇性水解手性酶之一，從而拆分某些外消旋取代的3-氧代-2，3，4，5-1H-四氫-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸酯的方法。
本發(fā)明的另一方面為基本上對映體純?nèi)〈?-氧代-2，3，4，5-1H-四氫-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸化合物，特別是通過酶水解過程從外消旋化合物中制備的這樣一種化合物。
在另一個方面，本發(fā)明為提高3-氧代-2，3，4，5-1H-四氫-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸立體化學(xué)純度的方法。
在再一個方面，本發(fā)明包括用于藥用產(chǎn)物合成的特定的中間體化合物。
最后，本發(fā)明為固相化的Candida Antarctica脂酶B的制備和產(chǎn)生這樣一個制備的方法。
本發(fā)明的詳述本發(fā)明為制備式(I)化合物的方法
在式(I)中，X為氫、鹵素、CO2R3、OR4、COR5或纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈；R2為C1-6烷基，任選被Ar、Het或C1-6環(huán)烷基取代；R3為C1-6烷基或芐基；R4為C1-6烷基、COR3或芐基；R5為4，4’-聯(lián)哌啶-1-基、(1’-芐氧基羰基)-4，4’-聯(lián)哌啶-1-基或(1’-叔-丁氧基羰基)-4，4’-聯(lián)哌啶-1-基；所述方法包括用Candida Antarctica脂酶B處理式(II)化合物
其中R1為C1-20烷基或C3-20鏈烯基，任選被Ar、NR2或NR3+取代，其中R為C1-4烷基，并使產(chǎn)生的(S)-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸羧酸與相應(yīng)的(R)-酯分離。
式(I)的3-氧代-2，3，4，5-1H-四氫-1，4-苯并二氮雜乙酸酯是重要的藥用產(chǎn)物或為藥用產(chǎn)物制備中的中間體。如在WO 95/18619(PCT/US95/00248)中所述，這些化合物的(S)立體異構(gòu)體具有藥理活性。因此，需要進行純手性合成、物理分離或化學(xué)拆分。盡管已經(jīng)報道了此類化合物的物理拆分和純手性合成，但是卻沒有獲得化學(xué)拆分。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Candida Antarctica脂酶B可以高立體選擇性地與任選7-取代的3-氧代-2，3，4，5-四氫-1，4-苯并二氮雜-乙酸酯反應(yīng)，得到(S)-酸。而(R)-對映體不是該酶的有效水解底物，因此水解在約50％轉(zhuǎn)化時自發(fā)停止。該酶對于(S)-底物的特定取代也是高度敏感的。例如，亞甲基取代1，4-苯并二氮雜的1-氮時活性喪失。同樣，當(dāng)X取代基為CO2R3時，將X取代基由7-位移至8-位導(dǎo)致水解活性的喪失。然而，苯并二氮雜環(huán)7位的多樣性卻是允許的。在式(II)中，R1適合為C1-12烷基或C1-12鏈烯基，任選被苯基取代。R1更適合為C1-4烷基或芐基。R2適合為H或C1-4烷基，任選被苯基取代。在式(II)中，R1最好為甲基，R2為甲基。X適合為H、溴代、碘代、叔丁氧基羰基、芐氧基羰基、甲氧基羰基、羥基、甲氧基、(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基或[1’-叔丁氧基羰基-(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)]羰基。R3最好為叔丁基。
所用的酶可以為全細胞培養(yǎng)物、酶提取物、分離的酶或與固體載體如大孔丙烯酸樹脂連接的分離的酶部分。Candida Antarctica脂酶B的負載制劑可以從Novo Nordisk，Badsvaerd，Denmark以Novozym 435由商業(yè)獲得和從Boehringer Mannheim Gmbh，Mannheim，Germany以L-2脂酶由商業(yè)獲得。該酶通常為熱穩(wěn)定的，并可耐受多種高濃度的有機溶劑。由于易處理性，所以優(yōu)選該酶的負載制劑。
然而，當(dāng)使用該酶的負載制劑時，可能產(chǎn)生某些問題，特別是當(dāng)該酶與樹脂為非共價鍵結(jié)合時。例如，我們發(fā)現(xiàn)由于蛋白的淋洗作用，樹脂負載的酶可以使用的次數(shù)可能有點受限。此外，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)反應(yīng)大規(guī)模進行時，由于蛋白淋洗可能形成乳液。
我們發(fā)現(xiàn)這些問題可以通過用交聯(lián)劑如戊二醛對所述樹脂進行預(yù)處理克服。其它的交聯(lián)劑如二甲基suberimidate和戊二醛寡聚物也是有用的。一般而言，該預(yù)處理僅僅包括在有機溶劑如叔丁醇和水混合物中用戊二醛將所述樹脂處理數(shù)小時。此處理可以使樹脂穩(wěn)定，以使在每次使用時由該樹脂上丟失的酶更少，因此可以增加該樹脂再使用的次數(shù)。
所述水解一般在水和有機溶劑混合物中進行。多種有機溶劑是有用的，如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、叔-丁醇、苯和甲苯，使用溶液或兩相體系也是適合的。然而，在選擇適當(dāng)?shù)娜軇r可以需要進行一些試驗，以使作用物的溶解性能相符。例如，當(dāng)選擇丙酮-水混合物作溶劑時，作用物(R，S)-甲基7-[(1’-叔丁氧基羰基-(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸酯的反應(yīng)性較差。若使用叔-丁醇/水混合物，則反應(yīng)進行平穩(wěn)。酮和仲醇以及叔醇類特別適合用作一相體系的有機溶劑。反應(yīng)速率的增加有時可以通過使用兩相體系如水和芳烴溶劑混合物如水和苯、甲苯、二甲苯或三甲苯的混合物獲得。特別適合的是水/甲苯。
可以對反應(yīng)混合物進行緩沖或者通過加入堿維持恒定的pH進行。然而，在pH6.0-8.0之間，反應(yīng)的速率或立體選擇性一般變化很小。
反應(yīng)適合在20℃以上溫度進行。一般而言，如果反應(yīng)在室溫如約28-45℃進行，那么可以減少溶劑的用量和反應(yīng)時間。例如，如果在約36℃進行反應(yīng)，那么200份體積的溶劑可以減少至約40份體積的溶劑，反應(yīng)時間也可以由4天減少至約24小時。
所述反應(yīng)一般進行至50％原料酯消耗。這可以通過HPLC(優(yōu)選手性HPLC)監(jiān)測。由于(R)-酯是該酶較差的底物，所以反應(yīng)時間不是關(guān)鍵的。一般而言，根據(jù)反應(yīng)的溫度、所用的溶劑和底物，反應(yīng)時間可以為數(shù)小時至數(shù)天。10-24小時一般是適合的。
盡管許多其它的脂酶也為選擇性作用于本發(fā)明的3-氧代-2，3，4，5-四氫-1，4-苯并二氮雜化合物的有效的酶，但是該環(huán)系僅接受CandidaAntarctica脂酶B可以選擇性水解底物。例如，當(dāng)測試下列來源的脂酶時該反應(yīng)無法進行豬胰脂酶、解脂假絲酵母、Candida Cylindracea、瓜哇毛霉、熒光假單孢菌、Aspergillus usamii、白地霉、黑曲霉、Humicola Lanuginosa、Ammano SAM2、少根根霉、Penicilliumcycopum、雪白根霉、瓜哇根霉、Ammano脂酶A、RhizopusDelewar、婁地毒霉和Boehringer脂酶-L-1、L-3、L-4、L-5、L6和L-8。得自Candida Antarctica的第二種脂酶-脂酶A也無反應(yīng)活性。
其它的水解酶如Carlsberg枯草桿菌蛋白酶和豬肝脂酶均可水解7-未取代的苯并二氮雜的甲基酯，但是立體選擇性很小。
使用分離酯和酸的常規(guī)技術(shù)來分離羧酸產(chǎn)物和未反應(yīng)的酯。一般而言，將反應(yīng)混合物調(diào)至堿性的pH(如＞7)和高的鹽濃度，并用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑萃取。這樣使的未反應(yīng)的酯溶于有機溶劑中，而羧酸產(chǎn)物存在于水層。干燥并蒸發(fā)有機溶劑得到手性酯；而酸化水層、萃取、干燥并蒸發(fā)有機溶劑得到所需手性酸。其它技術(shù)如使用結(jié)晶或經(jīng)硅膠載體或離子交換或其它適當(dāng)?shù)臉渲瑢游鼍梢杂糜诜蛛x酸和酯，并包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
可以使用分離特定的酯底物和產(chǎn)生的羧酸產(chǎn)物的其它相關(guān)技術(shù)。例如，(R)-7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯在水中的溶解性很高，因此即使在堿性pH下也很難從水層萃取。在此種情況下，可以用優(yōu)先與一種底物反應(yīng)的反應(yīng)話性的試劑處理反應(yīng)的酸和酯產(chǎn)物的混合物，以利于分離。例如，我們發(fā)現(xiàn)在pH約7.0時用羰基芐氧基氯、叔丁氧基羰基氯或相應(yīng)的酸酐處理(S)-7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸和其相應(yīng)的(R)甲酯異構(gòu)體，可以產(chǎn)生所述酯的哌啶基環(huán)的優(yōu)先?；?。一旦哌啶環(huán)?；?，那么該酯可優(yōu)先溶于有機溶劑中，因此可以通過萃取分離。
適合用根據(jù)本發(fā)明的方法制備的產(chǎn)物基本上是對映體純的。一般而言大于80％(e.e)、優(yōu)選大于90％、更優(yōu)選大于95％、最優(yōu)選大于99％。
盡管本發(fā)明主要為制備式(I)的非外消旋的3-氧代-2，3，4，5-四氫-1，4-苯并二氮雜產(chǎn)物的方法，但是可以理解本發(fā)明也可以用作增加式(I)的手性化合物的立體化學(xué)純度的方法，其中存在顯著量的(R)-對映體。例如，當(dāng)化學(xué)緩沖或物理方法如層析不能產(chǎn)生令人滿意的對映體純度的產(chǎn)物時，那么可以用本發(fā)明的方法增加產(chǎn)物的e.e.。
在具體的實施方案中，本發(fā)明為制備式(III)化合物的方法
其中X’為H、鹵素、CO2R3或OR4；R2為C1-6烷基，任選被Ar、Het或C1-6環(huán)烷基取代；R3為C1-6烷基或芐基；R4為C1-6烷基、COR3或芐基；所述方法包括(a)通過用Candida Antarctica的脂酶B處理式(IV)的化合物
其中R1為C1-20烷基或C3-20鏈烯基，任選被Ar、NR2或NR3+取代，其中R為C1-4烷基；并R2和X’如式(III)中定義；(b)使產(chǎn)生的(S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1 H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸羧酸與相應(yīng)的(R)-酯分離。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明為制備(S)-7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的方法，該方法包括用得自Candida Antarctica的脂酶B處理(R，S)7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯；并將(S)7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸與(R)7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯分離。該優(yōu)選的實施方案的其它變種包括其中所述底物為(R，S)7-[(1’-芐氧基羰基-(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1 H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯，并進一步包括在對映體分離后去除叔丁氧基羰基或芐氧基羰基的步驟。此類保護基團一般可以通過常規(guī)方法如酸處理或催化氫化去除。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明為制備(S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的方法，該方法包括用得自Candida Antartica的脂酶B處理(R，S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯；并將(S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸與(R) 7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯分離。
在再一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明為制備(S)-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的方法，該方法包括用得自Candida Antartica的脂酶B處理(R，S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯；并將(S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸與(R)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯分離。
在另一個方面，本發(fā)明為制備式(I)的非外消旋化合物的方法，其中X為-COR5或血纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈，所述方法包括轉(zhuǎn)化式(I)化合物，其中X為H、鹵素、CO2R3或OR4。
式(III)化合物在制備其中X為-COR5或纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈的式(I)化合物時為特別有用的中間體。X’優(yōu)選的部分為H、Br、I、CO2CH3、CO2-t-Bu和OH。優(yōu)選的R1部分為C1-4烷基和芐基。
根據(jù)在此公開的方法制備的特別有用的化合物為(S)-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸；(S)-7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸；(S)-7-溴代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸；(S)-7-叔丁氧基羰基-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸及它們的簡單的酯。一般的酯為C1-4烷基酯、苯基酯和芐基酯及其衍生物，并且這些酯可以通過常規(guī)酯化反應(yīng)由相應(yīng)的羧酸制備。
因此，另一方面本發(fā)明也為制備式(I)化合物的方法，在式(I)中X為COR5或纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈，所述方法包括通過上述方法制備式(III)化合物，并將式(III)化合物轉(zhuǎn)化為式(I)化合物，其中X為COR5或血纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈。通過常規(guī)反應(yīng)和方法，如在WO 93/00095(PCT/US 92/05463)、WO 94/14776(PCT/US93/12436)、WO 95/18619(PCT/US 95/00248)、WO 96/00730(PCT/US95/08306)、WO 96/00574(PCT/US 95/08146)、PCT/US 97/18001和WO 97/24336(在此引入這些公開內(nèi)容作參考)中所述的那些方法，可以將本發(fā)明的中間體化合物轉(zhuǎn)化為式(I)化合物，其中X為COR5或血纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈。
在更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明為制備式(I)化合物的方法，這些化合物為如(S)-7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸，該方法包括將(S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸、(S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸、(S)7-溴代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸；或(S)7-叔丁氧基羰基-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸轉(zhuǎn)化為(S)-7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸。
可以用于將上述中間體轉(zhuǎn)化為式(I)化合物的示例性方法在流程I中給出流程I
a)吡啶·ICl或CBr4/Ph3P；b)CO、Pd(OAc)4、Ph3P和(4，4’-聯(lián)哌啶或1’-Boc-4，4’-聯(lián)哌啶或1’-Cbz-4，4’-聯(lián)哌啶)然而，可以設(shè)想可以用式(III)的單獨的手性中間體制備式(I)化合物的許多其它常規(guī)合成方法。
在此用化學(xué)領(lǐng)域通常使用的縮寫和符號描述本發(fā)明中有用的化合物。此外，部分術(shù)語具有下列意義如在此所用，血纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈通?？梢杂孟率浇o出W-(CR’2)q-Z-(CR’R10)r-U-(CR’2)s-V-或W’-(CR’2)q-U-(CR’2)s-，其中R’-為H、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基-C0-4烷基或Ar-C0-4烷基；R”為R’、-C(O)R’或C(O)OR’；R1為H、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基-C0-4烷基或Ar-C0-4烷基；R5為H、C1-6烷基、C3-7環(huán)烷基-C0-4烷基或Ar-C0-4烷基；R7為H、鹵代、-OR12、-SR12、-CN、-NR’R12、-NO2、-CF3、CF3S(O)r-、-CO2R’、-CONR’2、R14-C0-6烷基-、R14-C0-6氧代烷基-、R14-C2-6鏈烯基、-R14-C2-6炔基-、R14-C0-6烷氧基-、R14-C0-6烷氨基或R14-C0-6烷基-S(O)r-；R8為H、-COR’、CN、NO2、SO2R’或C(O)OR5；R9為R’、-CF3、-SR’或-OR’；R10為H、C1-4烷基或-NR’R”；R12為R’、-COR’、、-C(O)NR’2、-C(O)OR5、-S(O)mR’或S(O)2NR’2；R14為H、C3-6環(huán)烷基、Het或Ar；R15為H、C1-10烷基、C3-7環(huán)烷基-C0-8烷基或Ar-C0-8烷基；U和V不存在，或為CO、CR’2、C(＝CR152)、S(O)n、O、NR15、CR15’OR15、CR’(OR”)CR’2、CR’2CR’(OR”)、-C(O)CR’2、CR152C(O)、CONR15、NR15CO、OC(O)、C(O)O、C(S)O、OC(S)、C(S)NR15、NR15C(S)、SO2NR15、NR15SO2、N＝N、NR15NR15、NR15CR152、NR15CR152、CR152O、OCR152、C≡C、CR15＝CR15、Het或Ar，前提為U和V不同時不存在；W為R’R”N-、R’R”NR’N-、R’R”NR’NCO-、R’2NR’NC(＝NR’)-、R’ONR’C(＝NR’)-、
Q為NR’、O或S；
Ra為H、C1-6烷基、Ar-C0-6烷基、Het-C0-6烷基或C3-6環(huán)烷基-C0-6烷基、鹵素、OR1、SR1、COR1、OH、NO2、N(R1)2、CO(NR1)2、CH2N(R1)2；Rb和Rc獨立選自H、C1-6烷基、Ar-C0-6烷基、Het-C0-6烷基或C3-6環(huán)烷基-C0-6烷基、鹵素、OR1、SR1、COR1、OH、NO2、N(R1)2、COCNR1)2、CH2N(R1)2，或者Rb和Rc一起形成5元或6元芳環(huán)或非芳環(huán)，任選被鹵素、C1-4烷基、OR1、SR1、COR1、OH、NO2、N(R1)2、CO(NR1)2、CH2N(R1)2、CN或R”R’NC(＝NR’)-取代；X為N＝CR’、C(O)或O；Y不存在，或為S或O；Z為(CH2)t、Het、Ar或C3-7環(huán)烷基；m為1或2；n為0、1、2或3；q為0、1、2或3；r為0、1或2；s為0、1或2；t為0、1或2；v為0或1；且w為0或1；q為0、1、2或3。
此類側(cè)鏈在如WO 93/00095(PCT/US 92/05463)、WO 94/14776(PCT/US 93/12436)、WO 95/18619(PCT/US 95/00248)、WO 96/00730(PCT/US 95/08306)、WO 96/00574(PCT/US 95/08146)和PCT/US96/11108有描述(在此引入其公開內(nèi)容作參考)?？梢岳斫釽和W’的堿性基團氮在進行本發(fā)明的方法時任選被保護。氮保護基團是本領(lǐng)域熟知的，并包括如乙酰基、甲?；?、三氟乙?；⒈郊柞；?、芐氧基羰基和烷氧基羰基。
典型的血纖維蛋白原受體或玻連蛋白受體拮抗劑側(cè)鏈為
在此所用C1-4烷基意欲包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基。C1-6烷基另外包括戊基、正戊基、異戊基、新戊基和己基及其簡單的脂族異構(gòu)體。同樣C1-20烷基包括指定數(shù)目的碳原子的簡單脂族烴。任何烷基可任選被R7取代，除特別指明外。另外C0-4烷基和C0-6烷基表明不需要烷基存在(如存在共價鍵)。
在此所用C2-6鏈烯基指2-6個碳原子的烷基，其中碳碳單鍵被碳碳雙鍵取代。C2-6鏈烯基包括乙烯、1-丙烯、2-丙烯、1-丁烯、2-丁烯、異丁烯和戊烯以及己烯的數(shù)種異構(gòu)體。同樣C3-20鏈烯基包括指定數(shù)目的碳原子的簡單的脂族烴，其中一個或多個碳碳單鍵被碳碳雙鍵取代。包括順式和反式兩種異構(gòu)體。除特別指明外，任何鏈烯基可任選被R7取代。
C2-6炔基指2-6個碳原子的烷基，其中一個碳碳單鍵被碳碳三鍵取代。C2-6炔基包括乙炔、1-丙炔、2-丙炔、1-丁炔、2-丁炔、3-丁炔和戊炔以及己炔的簡單的異構(gòu)體。C2-6炔基中的任何sp3碳原子可任選被R7取代。
C1-4氧代烷基指多至4個碳原子的烷基，其中CH2基團被C(O)或羰基取代。取代的甲?；?、乙?；?-丙醛、2-丙酮、3-丙醛、2-丁酮、3-丁酮、1-和4-丁醛為代表性實例。C1-6氧代烷基另外包括被羰基取代的5個和6個碳原子的較高級類似物和異構(gòu)體。
C1-6烷基、C2-6鏈烯基、C2-6炔基或C1-6氧代烷基上的取代基如R7可以在產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的任何碳原子上，并可通過常規(guī)合成技術(shù)獲得。
鹵原子指氟、氯、溴或碘。
在此所用Ar或芳基指苯基或萘基，或被1-3個R7部分取代的苯基或萘基。特別是R7可以為C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4烷硫基、三氟烷基、OH、F、Cl、Br或I。
Het或雜環(huán)指任選取代的5元或6元單環(huán)，或9元或10元雙環(huán)，其中含有1-3個選自氮、氧和硫的雜原子，這些環(huán)是穩(wěn)定的并可以通過常規(guī)化學(xué)合成獲得。說明性的雜環(huán)為苯并呋喃、苯并咪唑、苯并吡喃、苯并噻吩、呋喃、咪唑、吲哚、二氫吲哚、嗎啉、哌啶、哌嗪、吡咯、吡咯烷、四氫吡啶、吡啶、噻唑、噻吩、喹啉、異喹林、四氫和全氫喹啉以及異喹林。含有1個或2個氮原子的6元雜環(huán)如哌啶、哌嗪、四氫吡啶和吡啶為部分Z優(yōu)選的雜環(huán)。Het環(huán)上可以通過化學(xué)合成獲得并穩(wěn)定的多至3個取代基的任何可能的組合如選自R7的取代基的組合均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
C3-7環(huán)烷基指3-7個碳原子的任選取代的環(huán)系，可以含有多至兩個不飽和碳碳鍵。C3-7環(huán)烷基一般為環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)烷基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基和環(huán)庚基。環(huán)烷基環(huán)上可以通過化學(xué)合成獲得并穩(wěn)定的多至3個取代基的任何可能的組合如選自R7的取代基的組合均在本發(fā)明范圍內(nèi)。
在此所用
指氮雜環(huán)，可以為飽和或不飽和的穩(wěn)定的5元、6元或7元單環(huán)，或者為7-10元雙環(huán)，可以含有多至3個氮原子，或者含有1個氮原子和選自氧和硫的雜原子，并且可以在產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的任何原子上被取代。該環(huán)中的氮原子可以被取代，產(chǎn)生季氮。含氮雜環(huán)可以在任何穩(wěn)定的位置被R20取代，如H、C1-4烷氧基、F、Cl、Br、I、NO2、NR’2、OH、CO2R’、CONHR’、CF3、R14-C0-4烷基、R14-C1-4烷基-S(O)u(如其中u為0、1或2)或被任何上述取代基取代的C1-4烷基。代表性的
的實例為吡咯啉、吡咯烷、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、哌啶、哌嗪、嗎啉、吡啶、吡啶鎓、四氫吡啶、四氫和六氫氮雜、喹寧、喹寧鎓、喹啉、異喹林，以及四氫和全氫喹啉和異喹林。特別是
可以為吡啶基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、氮雜環(huán)丁烷基、喹寧基或四氫吡啶基。優(yōu)選
為4-吡啶基、4-(2-氨基-吡啶基)、4-四氫吡啶基、4-哌啶基或4-哌嗪基。
當(dāng)Rb和Rc結(jié)合形成與Rb和Rc連接的環(huán)稠合的5元或6元芳環(huán)或非芳環(huán)時，形成的環(huán)一般為選自上述雜環(huán)的5元或6元雜環(huán)，或者為苯基、環(huán)己基或環(huán)戊基環(huán)。W’部分優(yōu)選苯并咪唑基、4-氮雜苯并咪唑基、5-氮雜苯并咪唑基及其取代的衍生物。
用于本發(fā)明的式(II)和(IV)的酯可以根據(jù)在下列專利中所述的方法制備WO 93/00095(PCT/US 92/05463)、WO 94/14776(PCT/US93/12436)、WO 95/18619(PCT/US 95/00248)、WO 96/00730(PCT/US95/08306)、WO 96/00574(PCT/US 95/08146)、WO 97/24336和PCT/US 96/11108(在此引入這些公開內(nèi)容作參考)。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是很明顯的本發(fā)明的方法可以用于制備式(V)化合物
其中R1、R2和X與式(II)中所述相同，根據(jù)常規(guī)方法水解這些化合物得到式(II)的非外消旋(R)羧酸異構(gòu)體，其中R1為H。
下面的實施例不用于限制本發(fā)明的范圍，提供這些實施例是為了說明如何制備和使用本發(fā)明的化合物。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言許多其它的實施方案是很明顯的、且可以利用的。
實施例實施例1用Candida Antartica脂酶B水解的通用方法將3-氧代-2，3，4，5-四氫-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯(0.5g)或其適當(dāng)取代的衍生物溶于丙酮(30ml)或叔丁醇和緩沖液(70ml，pH7.0，0.1N磷酸鹽)中。加入大孔丙烯酸酯樹脂(200mg，/700PLU/g，以Novozym435商品名投放市場)負載的Candida Antarctica脂酶，于室溫下將該反應(yīng)物攪拌4.0天。經(jīng)HPLC監(jiān)測該反應(yīng)，水解47％時該反應(yīng)自發(fā)停止。用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至8.0，加入乙酸乙酯(75ml)。過濾該混合物去除酶催化劑，分離乙酸乙酯層。用乙酸乙酯(2×75ml)萃取水層。干燥(硫酸鈉)合并的乙酸乙酯萃取物，真空蒸發(fā)乙酸乙酯，得到(R)-酯(0.28g)。通過與真正的(R)-酯比較確定立體化學(xué)(手性HPLC)，e.e.＞99％。
用濃鹽酸將水相的pH調(diào)至5，用乙酸乙酯(5×75ml)萃取。干燥(硫酸鈉)合并的乙酸乙酯萃取物，蒸發(fā)得到(S)酸(0.23g)。e.e.為99％(由手性HPLC計算)。
用上述方法拆分下列3-氧代-2，3，4，5-四氫-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸。
X R1e.e.HCH3(S)99％(R)99％Br CH3(S)99.4％ (R)99.4％ICH3(S)98％(R)95％CO2-t-BuCH3(S)99.8％ (R)99.1％[1′-Cbz-(4，4′-bi- CH3(S)98.3％聯(lián)哌啶-1-基)]羰基實施例2(S)-7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的制備(R，S)7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯(34g，0.077mol)在水(580ml)和1.0N鹽酸(34ml)中制成淤漿。于30℃將該混合物攪拌0.5小時，加入1.0N鹽酸保持pH約為6.2。加入固相化的脂酶樹脂(Boehringer L-2脂酶，8.2g)，于30℃攪拌該混合物，加入1.5M氨溶液保持pH為6.2。當(dāng)不再需要滴定劑時，濾出酶樹脂，并用水(50ml)洗滌。
用氯代甲酸芐酯(7.8g，0.046mol)的二氯甲烷(130ml)溶液處理濾液。于30℃攪拌該混合物1小時，加入1.5M氨溶液保持pH為7.0。分離各相，用二氯甲烷(130ml)萃取水相。
保持pH為6.8，于真空下、55℃加熱水相。當(dāng)溶液的體積約為150ml時，將該溶液冷卻至5℃，放置12小時并不時調(diào)整pH。然后濾出固體，用冷水洗滌，并干燥得到目標(biāo)化合物(16g，80％)；經(jīng)手性HPLC分析為99.9％(S)-異構(gòu)體。
蒸發(fā)二氯甲烷萃取物得到目標(biāo)化合物(R)7-[1’-芐氧基羰基-(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸，為淡黃色結(jié)晶固體(23g，100％)；經(jīng)手性HPLC分析為＞98％(R)-異構(gòu)體。
實施例3(S)-7-[[(N’-芐氧基羰基)-4，4’-聯(lián)哌啶基]羰基]-3-氧代-2，3，4，5-四氫-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的制備a)7-[[(N’-芐氧基羰基)-4，4’-聯(lián)哌啶基]羰基]-3-氧代-2，3，4，5-四氫-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯于95℃、8-14psi的一氧化碳壓力下，將7-碘代-3-氧代-2，3，4，5-四氫-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯(50g，134mmol)、1’-芐氧基羰基-4，4’-聯(lián)哌啶鹽酸鹽(52.12g，154mmol)、Hunigs堿(67.9ml，402mmol)、NMP(200ml)、水(5.2ml，289mmol)和氯化鈀(II)雙三苯膦(1.88g，2.68mmol)的混合物在Parr振蕩器上振搖。4小時后，一氧化碳吸收停止，使該反應(yīng)混合物冷卻至室溫。然后加入二氯甲烷(400ml)，過濾該溶液，用水洗滌。將有機層濃縮至干，將殘留物在甲醇(770ml)中制成淤漿。過濾產(chǎn)物，用甲醇洗滌，抽干得到目標(biāo)化合物(54g，70％)。
b)(S)-7-(4，4’-聯(lián)哌啶基)羰基)-3-氧代-2，3，4，5-四氫-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸將實施例3(a)的化合物溶于叔丁醇和緩沖液(70ml，pH7.0，0.1N磷酸鹽)中。加入大孔丙烯酸酯樹脂(200mg，/700PLU/g，以Novozym 435商品名投放市場)負載的Candida Antartica脂酶B，于室溫下將該反應(yīng)物攪拌4.0天。用氫氧化鈉溶液將pH調(diào)至8.0，加入乙酸乙酯(75ml)。過濾該混合物，分離乙酸乙酯層。用乙酸乙酯再萃取水層。干燥(硫酸鈉)合并的乙酸乙酯萃取物，真空蒸發(fā)乙酸乙酯，得到(R)-酯。
用鹽酸將水相的pH調(diào)至5，用乙酸乙酯萃取。干燥(硫酸鈉)合并的乙酸乙酯萃取物，蒸發(fā)得到(S)-酸(e.e.為99％)。
于氫氣環(huán)境(45psi)下，將(S)酸(0.15mmol)的甲醇(40ml)和乙酸(8滴)溶液與10％Pd/C(20mg)一起振搖30分鐘。通過CELITE過濾該混合物，真空濃縮濾液得到目標(biāo)化合物。
實施例4(S)-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的制備將(R，S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯(20g，0.081mol)在甲苯(200ml)中制成淤漿，加熱至回流5分鐘。將該溶液冷卻至40℃，加入水(200ml)和Novozym 435(20g)。于40℃攪拌該反應(yīng)物，用氨溶液(1.5mol)維持pH為7.0。16小時后，HPLC分析表明反應(yīng)完成。濾出酶樹脂，用溫水(45ml)和溫甲苯(75ml)洗滌。
分離甲苯層，用乙酸乙酯(2×100ml)萃取水層，用氨溶液(1.5M)維持pH為8.0。將合并的有機萃取物(甲苯和乙酸乙酯萃取物)蒸發(fā)至干，使殘留物從二氯甲烷-己烷中重結(jié)晶，得到原料酯的(R)-異構(gòu)體(8g，80％)。
用乙酸乙酯使水層分層，用鹽酸酸化至pH為4.0，蒸發(fā)至干，重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物。
實施例5(S)-7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1 H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的制備重復(fù)實施例3的方法至從含有(S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的水相中萃取(R)-酯的步驟。然后將水溶液的pH調(diào)至7.0，加入吡啶ICl配合物(10.2g，0.042mol)。用氨溶液(1.5M)維持pH為6.0，將該混合物攪拌1小時。然后用濃鹽酸將pH調(diào)至4.0，攪拌16小時。濾出產(chǎn)物，用冷的pH為4的緩沖液洗滌，干燥得到目標(biāo)化合物(11.2g，84％)。經(jīng)手性HPLC分析表明為99.82％(S)-異構(gòu)體。
實施例6固相負載酶的制備于室溫下，將Novozym 435(Novo Nordisk，3g)在水(4ml)、叔丁醇(45ml)和戊二醛(1ml，50％w/w水溶液)攪拌約3-4小時，不調(diào)節(jié)pH。濾出樹脂，用水洗滌，將其不經(jīng)進一步干燥使用。
權(quán)利要求
1.制備式(I)化合物的方法
在式(I)中，X為氫、鹵素、CO2R3、OR4、COR5或纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈；R2為C1-6烷基，任選被Ar、Het或C1-6環(huán)烷基取代；R3為C1-6烷基或芐基；R4為C1-6烷基、COR3或芐基；R5為4，4’-聯(lián)哌啶-1-基、(1’-叔-芐氧基羰基)-4，4’-聯(lián)哌啶-1-基或(1’-叔-丁氧基羰基)-4，4’-聯(lián)哌啶-1-基；所述方法包括(a)用Candida Antartica脂酶B處理式(II)化合物
R1為C1-20烷基或C3-20鏈烯基，任選被Ar、NR2或NR3+取代，其中R為C1-4烷基，并(b)分離相應(yīng)的酯和產(chǎn)生的2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸羧酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述Candida Antartica脂酶B固定在固體載體上。
3.權(quán)利要求2的方法，其中通過用交聯(lián)劑處理將所述CandidaAntarctica脂酶B固定。
4.權(quán)利要求1的方法，其中通過用不相混溶的有機溶劑萃取水溶液來分離(S)-異構(gòu)體和(R)-異構(gòu)體。
5.權(quán)利要求1的方法，其中R1為甲基。
6.權(quán)利要求1的方法，其中R2為甲基。
7.權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)溫度高于室溫。
8.制備(S)-7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的方法，該方法包括(a)用得自Candida Antartica的脂酶B處理(R，S)7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯；并(b)分離(R)7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯和(S)7-[(4，4’-聯(lián)哌啶-1-基)羰基]-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸。
9.制備(S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的方法，該方法包括(a)用得自Candida Antartica的脂酶B處理(R，S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯；并(b)分離(R)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯和(S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸。
10.制備(S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸的方法，該方法包括(a)用得自Candida Antartica的脂酶B處理(R，S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯；并(b)分離(R)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸甲酯和(S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸。
11.化合物為(S)2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸；(S)7-碘代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸；(S)7-溴代-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸；或(S)7-叔丁氧基羰基-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸。
12.制備權(quán)利要求1所述的式(I)化合物的方法，在式(I)中X為-COR5或纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈，所述方法包括將權(quán)利要求11的化合物轉(zhuǎn)化為所述式(I)化合物。
13.制備式(I)化合物的方法
在式(I)中，X為COR5或纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈；R2為C1-6烷基，任選被Ar、Het或C1-6環(huán)烷基取代；R3為C1-6烷基或芐基；R4為C1-6烷基、COR3或芐基；R5為4，4’-聯(lián)哌啶-1-基、(1’-芐氧基羰基)-4，4’-聯(lián)哌啶-1-基或(1’-叔-丁氧基羰基)4，4’-聯(lián)哌啶-1-基；所述方法包括(a)通過用Candida Antarctica的脂酶B處理式(IV)的化合物
其中R1為C1-20烷基或C3-20鏈烯基，任選被Ar、NR2或NR3+取代，其中R為C1-4烷基，制備式(III)化合物
其中X’為H、鹵素、CO2R3或OR4；R2為C1-6烷基，任選被Ar、Het或C1-6環(huán)烷基取代；R3為C1-6烷基或芐基；R4為C1-6烷基、COR3或芐基；及(b)分離相應(yīng)的式(III)的(R)-酯和產(chǎn)生的(S)-2，3，4，5-四氫-4-甲基-3-氧代-1H-1，4-苯并二氮雜-2-乙酸羧酸；及(c)將式(III)化合物轉(zhuǎn)化為式(I)化合物，其中X為COR5或纖維蛋白原或玻連蛋白拮抗劑側(cè)鏈。
14.權(quán)利要求14的方法，其中R1為C1-4烷基或芐基；X’為H、Br、I、CO2CH3、CO2-t-Bu或OH。
全文摘要
本發(fā)明涉及對映體純的苯并二氮雜乙酸酯和通過用脂酶拆分外消旋混合物制備它們的方法。
文檔編號C12P41/00GK1246157SQ9718185
公開日2000年3月1日 申請日期1997年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月27日
發(fā)明者A·S·維爾斯 申請人:史密絲克萊恩比徹姆有限公司